Capture simultanément en temps réel des images en deux canaux d'émission en utilisant un système de fractionnement double caméra émission: Applications à l'adhésion cellulaire

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer un test d’adhérence en chambre d’écoulement de plaques parallèles à l’aide d’un système de division d’émission à double caméra pour enregistrer simultanément des séquences d’images en temps réel en deux couleurs. Pour ce faire, les deux caméras de la configuration d’imagerie sont d’abord alignées. Ensuite, les cellules et le substrat réactif sont préparés et la chambre d’écoulement à plaques parallèles est mise en place.

Les paramètres de l’appareil photo sont ensuite calibrés pour l’acquisition d’images en deux couleurs et toutes les corrections numériques nécessaires sont apportées à l’alignement de l’appareil photo. Des séquences d’images sont ensuite capturées, qui démontrent l’acquisition d’images bicolores avec une résolution temporelle élevée. L’avantage des systèmes de séparation d’émission à deux caméras par rapport aux systèmes à caméra unique est que différents temps d’exposition peuvent être attribués à chaque caméra et que le champ de vision complet est conservé.

Cette technique peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’adhésion cellulaire, telles que la façon dont la localisation des molécules d’adhésion à la surface des cellules pourrait affecter les processus biologiques dynamiques tels que la migration cellulaire, l’inflammation et les métastases cancéreuses. La procédure suivante nécessite un microscope à épifluorescence inversée. Celui-ci doit être équipé d’une source lumineuse de haute intensité couplée à un guide de lumière, d’un cube de filtre combiné et d’un système de caméra à double caméra à division d’émission.

La configuration du microscope doit être connectée à un ordinateur exécutant un logiciel d’imagerie capable de collecter et de combiner des images capturées par des caméras CCD monochromes. Ici, le logiciel multi-caméras stream picks five est utilisé avec le module simul picks. Commencez par ouvrir stream picks five dans le ruban de tâche, puis sélectionnez workspace.

Ensuite, à l’extrême droite de l’écran, ouvrez le gestionnaire d’espace de travail et sélectionnez un nouvel espace de travail. Après avoir nommé l’appareil photo, suivez les instructions du logiciel pour sélectionner dans une liste préremplie, un modèle de caméra correspondant, une petite icône de caméra apparaîtra dans l’espace de travail pour indiquer que le flux de la caméra est reçu. Les objets imagés au microscope peuvent maintenant être visualisés à l’écran.

Répétez ce processus pour l’espace de travail de la deuxième caméra, puis pour l’espace de travail fusionné, répétez cette opération une fois de plus et toutes les caméras sont utilisées. Un message d’erreur apparaîtra. Ce message est normalement attribué aux caméras des espaces de travail un et deux à l’espace de travail fusionné dans le panneau d’ancrage situé sur le côté droit de l’écran d’affichage.

Les images des espaces de travail un et deux seront superposées dans l’espace de travail fusionné sous la forme de deux images pseudo-colorées. L’aspect le plus difficile de cette procédure est l’alignement de la caméra. Pour assurer le succès, nous utilisons la glissière du fabricant tout en suivant méticuleusement les instructions du fabricant.

Pour aligner les caméras dans le système de séparation d’émission à double caméra, envoyez une lumière en fond clair ou à contraste de phase à l’oculaire du microscope. Placez la grille d’étalonnage à revêtement métallique fournie par le fabricant sur la platine du microscope et équerrez la grille sur la platine du microscope. Affichez la grille sans binning et sans mise à l’échelle automatique et mettez-la au point puis déplacez, mais ne retirez pas le boîtier dichroïque pour aligner la caméra.

Ensuite, à l’aide de la molette de réglage de la mise au point sur le port un du mont sous-marin, faites à nouveau la mise au point sur l’image. Ensuite, enfoncez complètement le boîtier dichroïque dans le périphérique d’acquisition double canal afin que l’image soit divisée par le dichroïque entre les deux caméras. Desserrez les vis de réglage 3 5 60 quatrième pouce et tournez la deuxième caméra sur le port femelle de la monture CM deux jusqu’à ce que l’orientation de la grille soit identique dans les deux images à l’aide de la molette de réglage de la mise au point sur le port de monture C deux, faites la mise au point sur l’image de la deuxième caméra.

Pour finaliser l’alignement, utilisez le bouton RL sur le côté droit du DC deux pour ajuster les positions d’image combinées jusqu’à ce que la droite se soulève. La limite verticale des images est alignée avec précision dans l’espace de travail fusionné. Utilisez ensuite le bouton UD pour ajuster l’alignement haut bas de la deuxième image jusqu’à ce que les barres de grille horizontales soient correctement alignées.

Si, pendant l’alignement vers le bas, une légère rotation de l’appareil photo se produit, corrigez ce problème en desserrant les vis 3 5 60 du quatrième pouce de l’appareil photo deux et en les tournant jusqu’à ce que l’image affichée soit correctement alignée. Préparez les cellules cancéreuses du sein BET 20 pour le test d’adhérence en chambre d’écoulement à plaques parallèles en les colorant avec anti CD 24 et TECA 4 5 2 à l’aide des secondaires LOR 5 68 et 4 88 comme décrit dans le document d’accompagnement, assurez-vous de préparer les commandes unicolores appropriées après la coloration distribuez les cellules dans le réservoir de la chambre d’écoulement à plaques parallèles. Connectez deux longueurs distinctes de tube aux orifices d’entrée et de sortie de la chambre d’écoulement.

Un tube se connectera au réservoir contenant les cellules marquées en suspension dans le DPBS plus contenant 0,1 % de PSA. Connectez l’autre tube au pousse-seringue, qui aspirera le liquide à un débit spécifié. Connectez une conduite de vide à la chambre d’écoulement et positionnez la chambre d’écoulement sur la boîte de culture tissulaire de 35 millimètres contenant une monocouche de cellules ovariennes de hamster chinois exprimant des cellules de lectine ou de cho e.

Ajustez la chambre d’écoulement et le joint de la chambre d’écoulement pour assurer une étanchéité sous vide adéquate. Prélevez le liquide du réservoir en surveillant l’étanchéité de la chambre d’écoulement. Enfin, placez l’ensemble de la chambre d’écoulement sur le microscope, alimentez la source lumineuse et configurez le microscope par inspection manuelle.

Assurez-vous que le boîtier dichroïque est dans la bonne position de fonctionnement enfoncée et qu’il n’est pas en mode bypass. Passez manuellement en mode fluorescence et sélectionnez le cube de filtre de fluorescence vert rouge pour déterminer le temps d’exposition et le gain séparément. Imagez les cellules en utilisant la fluorescence rouge dans la première caméra et la fluorescence verte dans la deuxième caméra.

Appuyez manuellement sur le dichroïque si nécessaire pour obtenir les images. Déposer ensuite une suspension de cellules BT 20 colorées uniquement avec de la flore rouge. Quatre anticorps conjugués dans le réservoir connectés à l’orifice d’entrée de la chambre d’écoulement à plaques parallèles.

Utilisez la pompe à seringue pour perfuser les cellules BT 20 sur la monocouche choi dans la chambre d’écoulement à plaques parallèles. Dans les paramètres en direct du logiciel d’imagerie, ajustez le temps d’exposition de la caméra un pour obtenir une image dans le canal rouge. Faites correspondre le temps d’exposition de l’appareil photo deux au temps d’exposition de l’appareil photo un.

Si une image est observée dans le canal vert, des artefacts de saignement sont présents. Si cela se produit, conservez l’équivalent du temps d’exposition dans la caméra un et la deuxième caméra et réduisez le temps d’exposition jusqu’à ce que l’artefact de saignement ne soit plus visible dans le canal vert. Ajustez le gain de la caméra un pour améliorer la visibilité de l’image dans le canal rouge si nécessaire.

Ensuite, retirez toute suspension de cellule BT 20 restante du réservoir et remplacez la suspension par DPBS. Utilisez le pousse-seringue pour perfuser la solution sur la monocouche de choi jusqu’à ce que les cellules BT 20 ne soient plus visibles sur la monocouche. Remplissez le réservoir avec la suspension de cellules BT 20 colorées uniquement avec un anticorps conjugué fluoro quatre vert.

Répétez le processus d’étalonnage de l’appareil photo à l’aide des commandes monochromes vertes. Cette fois, définissez le temps d’exposition avec la caméra deux pour imager les cellules dans le canal vert sans déborder des artefacts dans le canal rouge collectés par la caméra un. Utilisez le logiciel d’imagerie pour visualiser simultanément les images capturées à partir des deux caméras CCD monochromes dans la chambre d’écoulement. Expérience.

Fusionnez les images collectées à partir des deux caméras à l’aide du module de photos simultanées de Stream Picks. Utilisez les réglages de correction numérique dans simul pic ou un autre logiciel pour aligner spatialement les images fusionnées. Si nécessaire, les images peuvent être corrigées avec le module simul PIC pour des ajustements horizontaux, verticaux et rotationnels.

Le système est maintenant prêt à être utilisé pour capturer deux images couleur simultanément. Un test d’adhérence en chambre d’écoulement de plaques parallèle a été utilisé pour démontrer le système de séparation d’émission à double caméra décrit dans cette vidéo. Comme le montre ici, le système a détecté des cellules BT 20 qui ont été marquées par fluorescence avec le CD 24 anti-humain indiqué en rouge et le HECA 4 52, qui se lie aux molécules apparentées aux SCO indiquées en vert.

Certaines cellules roulantes affichaient des signaux rouges, mais pas verts. D’autres affichaient des signaux verts mais pas de signaux rouges, et d’autres encore affichaient des signaux rouges et verts. Ici. Les caméras ont maintenu la résolution optique et temporelle nécessaire pour suivre les caractéristiques cellulaires sur une cellule qui culbute et se dégrade alors qu’elle roule sur le substrat réactif dans le sens de l’écoulement : les canaux d’émission fusionnés ont révélé la distribution et la colocalisation des molécules CD 24 et satellitées à la surface des cellules BT 20, roulant et adhérant aux monocouches CHO.

Ces images montrent un zoom d’une seule cellule BT 20 dans laquelle les molécules CD 24 et satées co-localisent et apparaissent sous forme de taches jaunes à orange lorsque les canaux d’émission pseudo-colorés rouges et verts sont fusionnés. Pris ensemble. Ces informations démontrent que le système de division d’émission à double caméra a la résolution spatiale, temporelle et optique nécessaire pour révéler les caractéristiques cellulaires et moléculaires dans des applications telles que les tests d’adhésion en chambre d’écoulement dans lesquels les cellules se déplacent rapidement dans le champ de vision.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la configuration et de l’étalonnage d’un système de séparation d’émission à double caméra ou de l’imagerie d’un test d’adhérence à chambre d’écoulement de plaques parallèles en temps réel en deux couleurs. Cette méthode peut être appliquée à d’autres tests in vitro qui utilisent la fluorescence pour étudier le comportement cellulaire.