Name: Capture simultanément en temps réel des images en deux canaux démission en utilisant un système de fractionnement double caméra émission: Applications à ladhésion cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Découvrez l'imagerie en deux couleurs en temps réel pour les essais d'adhésion cellulaire en utilisant un système de fractionnement d'émission à double caméra. Cette méthode améliore la résolution temporelle et la qualité d'image.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Douglas Goetz (Département de chimie et génie biomoléculaire de l&#39;Université de l&#39;Ohio) et le Dr Fabian Benencia (Département des sciences biomédicales, Université de l&#39;Ohio) pour des discussions pertinentes et évaluation des manuscrits. Nous remercions également le Dr Christopher Huppenbauer pour les discussions techniques utiles (W. Nuhsbaum Inc.). Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Science Foundation (CBET-1106118) et les National Institutes of Health (1R15CA161830-01).

Une. Installation du logiciel <ol><li> Achetez Streampix 5 logiciels multi-caméras avec module SimulPix ou un autre logiciel d&#39;imagerie capable de collecter et combiner des images captées par les caméras CCD monochrome. </li><li> Exigences minimales pour Streampix 5 comprennent: Un PC équipé Core 2 Duo 2,4 GHz ou mieux avec 2 Go de RAM ou plus. Une caméra IEEE soutenu numérique ou analogique et d&#39;acquisition d&#39;images compatible. Fenêtres XP/7/Vista 32 ou 64 bits. Un moniteur supportant une résolution de 1024 x 768 ou supérieure. Une carte graphique avec de bonnes performances 2D (UCO express 16x ou plus est recommandé) et 7200 RPM disque dur pour l&#39;enregistrement avec configuration RAID-O. </li></ol> 2. Installation d&#39;un système de double caméra Capable de deux couleurs simultanée d&#39;imagerie en temps réel <ol><li> Connectez le séparateur DC2 Photometrics d&#39;émission, ou dispositif d&#39;émission de fractionnement double caméra similaire, au microscope en faisant glisser l&#39;adaptateur DC2 monture C dans le port vidéo de la MICRoscope de telle sorte que le logement de la dichroïque sur le dispositif est accessible. </li><li> Insérez deux caméras CCD monochrome en femelle monture C 1 et C-femme monter 2. Caméras identiques sont préférables. Caméras similaires peuvent être utilisés, mais dépend de la compatibilité matérielle interne, le plus important au capteur d&#39;image CCD. </li><li> Utilisez le logiciel d&#39;imagerie pour afficher les images des deux caméras. Les étapes suivantes (2.3.1 - 2.3.4) s&#39;appliquent à Streampix 5 avec module SimulPix et doivent être adaptés à d&#39;autres logiciels d&#39;imagerie multi-caméra. <ol><li> Ouvrir Streampix 5 et sélectionnez &quot;espace de travail&quot; dans le ruban de la tâche. </li><li> Ouvrir &quot;gestionnaire d&#39;espace de travail», situé à l&#39;extrême droite de l&#39;écran et sélectionnez «nouvel espace de travail&quot;. </li><li> Après la nomination d&#39;un appareil photo, suivez le logiciel demande de sélectionner une carte d&#39;acquisition d&#39;une liste pré-remplie. Sélectionnez la carte d&#39;acquisition correspondant au modèle de l&#39;appareil et répétez l&#39;opération pour le deuxième espace de travail de la caméra. Pour l&#39;espace de travail fusionnée, répéter une fois de plus, mais «toutes les caméras sont en cours d&#39;utilisation&quot; erreur message s&#39;affiche. Ce message est normal. </li><li> Une fois l&#39;espace de travail fusionnée est chargé, affecter les caméras de l&#39;espace de travail et espace de travail 1 2 à l&#39;espace de travail fusionnée dans le panneau d&#39;accueil situé sur le côté droit de l&#39;écran de visualisation. </li></ol></li><li> Alignez les caméras dans le système de séparation des émissions de double caméra. <ol><li> Alignez les caméras dans le champ lumineux ou contraste de phase avec la grille de calibrage fourni par le fabricant en utilisant un objectif Planapo 40X (ou plus). </li><li> Envoyer lumière pour les oculaires du microscope, placer la grille de calibrage revêtus de métal qui a été fourni par le fabricant sur la platine du microscope et de la place de la grille sur la platine du microscope. </li><li> Apportez la grille dans le foyer. </li><li> Déplacer, mais ne pas retirer le boîtier dichroïque pour aligner la caméra 1 (caméra de dérivation). Afficher la grille sans binning et sans le redimensionnement. Concentrer l&#39;image en utilisant la molette de réglage de mise au point sur le port monture C 1. </li><li> Poussez le boîtier dichroïque dans le double Channel dispositif d&#39;acquisition entièrement, de sorte que l&#39;image est divisée par le dichroïque à deux caméras. </li><li> Desserrer les trois 5/64 &quot;set vis et tourner la deuxième caméra sur la femelle monture C 2 jusqu&#39;à ce que l&#39;orientation de la grille est identique dans les deux images. Utilisation de la molette de réglage de mise au point sur le C-monter le port 2, amener l&#39;image de la caméra 2 dans le foyer. </li><li> Achever l&#39;alignement de l&#39;aide de l&#39;image combinée dans l&#39;espace de travail fusionnée du logiciel d&#39;imagerie. Cela permet de voir un pseudo-superposition en temps réel des deux images de la grille d&#39;étalonnage. Ajuster les positions d&#39;image combinées en utilisant uniquement le système R / L bouton sur le côté droit de la DC2. Réglez ce bouton jusqu&#39;à ce que droite / gauche limite verticale des images est précisément aligné. </li><li> Utilisez le bouton U / D pour régler l&#39;alignement haut / bas de la deuxième image jusqu&#39;à ce que les barres horizontales de la grille sont correctement alignés. </li><li> Si lors de l&#39;alignement vers le haut / vers le bas une légère rotation de la caméra se produit, Corriger cette question en desserrant les trois 5/64 &quot;scre poucesws pour appareil photo 2 et tourner jusqu&#39;à ce que l&#39;image affichée est correctement aligné. </li></ol></li></ol> 3. Préparation des cellules cancéreuses pour plaques parallèles Chambre de circulation Essai d&#39;adhésion <ol><li> Culture BT-20 des cellules de cancer du sein dans un milieu essentiel minimum (MEM) additionné de milieu complet avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine à 37 ° C et 5,0% de CO 2, comme précédemment décrit 2. </li><li> Récolte des cellules cancéreuses avec un traitement à la trypsine diluée et compter les cellules avec un hémocytomètre. </li><li> Laver et suspendre les cellules à 10 7 cellules / ml dans 0,1% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) dans du DPBS avec calcium et magnésium (DPBS +). </li><li> Diluer les anticorps primaires, les souris purifié anti-CD24 humain et de rat purifiée HECA-452 (les antigènes anti-sialofucosylated), à une concentration optimale prédéterminée dans 0,1% de BSA DPBS +. Incuber les cellules pendant 30 min 9, 10. </li><li> Centrifuger les cellules à 1200 rpm pour obtenir un culot cellulaire. Aspiévaluer anticorps primaire, et laver les cellules deux fois avec 0,1% de BSA SPD +. </li><li> Diluer anticorps secondaires, de chèvre anti-IgG de souris AlexaFluor 568 (émission max, 603 nm), et de chèvre anti-IgM de rat AlexaFluor 488 (émission max, 519 nm), à une concentration optimale prédéterminée dans 0,1% de BSA DPBS +. Incuber les cellules pendant 30 min. </li><li> Laver les cellules deux fois et suspendre dans 0,1% de BSA DPBS + à 10 6 cellules / ml dans 0,1% de BSA DPBS +. </li></ol> 4. Préparation du réactif Substrat pour plaque parallèle Chambre de circulation Essai d&#39;adhésion <ol><li> Relier deux longueurs de tube séparées pour les ports de la chambre d&#39;écoulement parallèle de la plaque qui s&#39;adapte à l&#39;intérieur d&#39;une boîte de culture tissulaire de 35 mm entrée et de sortie. Un tube se connecte au réservoir de cellules marquées en suspension dans 0,1% de BSA DPBS + et l&#39;autre à la pompe à seringue, qui va retirer du fluide à un débit spécifié. </li><li> Connexion à une ligne vide à la chambre d&#39;écoulement 1. </li><li> Placez la chambre d&#39;écoulement sur le 35 mm culture de tissus dish contenant une monocouche de cellules d&#39;ovaire de hamster chinois exprimant la sélectine E (CHO-E). Des cellules CHO-E ont été cultivées dans du milieu MEM complet à 37 ° C et 5,0% de CO 2 2. </li><li> Ajuster la chambre d&#39;écoulement et / ou le joint de la chambre d&#39;écoulement afin d&#39;assurer un joint étanche au vide suffisant 1. </li><li> Retirer du fluide depuis le réservoir, le contrôle de l&#39;assemblage de la chambre d&#39;écoulement pour une bonne étanchéité, et aucune preuve visuelle de la formation de bulles d&#39;air 1. </li><li> Placer l&#39;assemblage de la chambre d&#39;écoulement sur ​​le microscope (Leica DMI 6000B) 1. </li></ol> 5. Deux couleurs d&#39;acquisition de l&#39;image <ol><li> Puissance d&#39;une source Leica EL-6000 lumière compact, ou un dispositif similaire, pour générer une lumière de forte intensité et deux dans un guide de lumière. Utilisez un microscope inversé à passer cette lumière à travers un filtre de combinaison cube, soit G / R (vert / rouge) filtre cube, pour exciter des fluorophores de couleur / intensité souhaitée. </li><li> Assurez logements dichroïque est en position de fonctionnement correct (déprimé) etn&#39;est pas en mode de dérivation. </li><li> Fonctionner en mode microscope de fluorescence et sélectionnez bon cube de filtre de fluorescence (vert / rouge). </li><li> Déterminer le temps d&#39;exposition et le gain en appareil photo 1 (rouge, 620 ± 60 nm) et un appareil photo 2 (vert, 535 ± 40 nm). <ol><li> Appuyez sur la dichroïque pour obtenir des images dans les deux canaux d&#39;émission rouge et vert. Utilisation d&#39;un dosage de la chambre d&#39;écoulement avec des cellules marquées avec le fluorochrome rouge seulement, et obtenir une image dans le canal rouge en ajustant le temps d&#39;exposition de la caméra 1 en &quot;direct&quot; paramètres du logiciel d&#39;imagerie. </li><li> Correspondre à la durée d&#39;exposition de l&#39;appareil photo 2 à la durée d&#39;exposition de la caméra 1. Si une image est observée dans le canal vert, les artefacts de purge-through sont présents et la durée d&#39;exposition dans les deux appareils doit être réduite. </li><li> Garder le temps d&#39;exposition équivalent à huis clos et une caméra 2, de réduire le temps d&#39;exposition jusqu&#39;à ce que l&#39;artefact de purge par n&#39;est plus visible dans le canal vert. Réglez le gain de la caméra 1 pour améliorer l&#39;image visibility dans le canal rouge, si nécessaire. </li><li> Répétez les étapes 5.4.1 - 5.4.3 avec des cellules marquées avec le fluorophore vert seulement, mais de définir le temps d&#39;exposition avec un appareil photo 2 cellules d&#39;image dans le canal vert sans artefacts purge travers du canal rouge recueillies par la caméra 1. </li><li> Anticorps Retitrate si artefacts purge par ne peuvent être éliminés 11, ou si le temps d&#39;exposition de la caméra 1 et la caméra 2 sont sensiblement différents, tels que la fusion des images peuvent être temporellement alignées. </li></ol></li><li> Utilisez le logiciel d&#39;imagerie pour visualiser les images capturées simultanément à partir de deux caméras CCD monochrome dans l&#39;expérience de la chambre d&#39;écoulement. </li><li> Fusionner des images recueillies par les deux caméras en utilisant le module de SimulPix Streampix 5 ou un logiciel alternatif. </li><li> Utiliser les ajustements de correction numériques en SimulPix ou logiciel alternatif pour aligner spatialement les images fusionnées, le cas échéant. Les images peuvent être corrigées avec le module SimulPix pour horizontal, verticalet les ajustements de rotation. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Le système de fractionnement des émissions de double caméra a une résolution spatiale, temporelle, et optique nécessaire pour capturer des images de haute qualité dans des applications où la cellule ou le mouvement moléculaire est rapide. Dans la génération des résultats représentatifs, les paramètres du système de fractionnement caméra émission double, y compris les paramètres logiciels et réglages de l&#39;appareil, ont été optimisés pour obtenir une séquence d&#39;image fusionnée dans laquelle roulement et les cellul...

Des procédés pour l&#39;analyse de molécules sur la surface des cellules, telles que l&#39;immunocoloration, emploient des sondes qui sont chimiquement conjugués à des fluorophores, ce qui permet la détection de molécules cibles. Imagerie des cellules vivantes et hydrodynamiques des essais d&#39;adhérence des cellules basées sur les flux sont généralement enregistrés avec des caméras CCD monochrome conçus pour capturer les processus physiologiques au niveau cellulaire et / ou moléculaire 1, 2. Ces caméras sont très sensibles, offrir des taux de trame rapides (plus de 30 images par seconde), et de fournir une résolution temporelle exceptionnelle (en raison de taux de trame rapides et des temps d&#39;exposition court). Toutefois, les caméras monochromes ne peuvent capturer un canal d&#39;émission unique (détection d&#39;un seul fluorophore) pour recueillir des images. Simples systèmes caméra émission de séparation peuvent être incorporés à capturer plusieurs canaux d&#39;émission mais réduisent souvent le champ de vision et nécessitent le même temps d&#39;exposition pour l&#39;imagerie de tous les canaux. Pour capturer le spectre complet des couleurs de cellules marquées par multiparele fluorophores, une caméra couleur peut être utilisé comme une alternative. Cependant, les caméras couleurs ne sont généralement pas capables de fournir la résolution temporelle souhaitée pour l&#39;imagerie des cellules vivantes dans certaines applications. Un autre dispositif de formation d&#39;image est nécessaire pour les applications dans lesquelles il est avantageux de l&#39;image des cellules vivantes dans des longueurs d&#39;ondes multiples tout en conservant une haute résolution temporelle. Une application expérimentale de choix est l&#39;analyse de l&#39;adhérence de la chambre d&#39;écoulement à plaques parallèles, dans lequel les cellules sont perfusées dans des conditions physiologiquement pertinentes sur un substrat potentiellement réactif 1, 3. Les cellules dans le flux qui expriment des molécules de surface spécifiques de cellules peuvent adhérer et roulent sur ​​le substrat, par exemple une monocouche de cellules exprimant des molécules d&#39;adhésion ou des protéines de surface adsorbé extracellulaires matricielles 4, 5. Cellules de roulement peuvent subir un mouvement de rotation et de translation en une fraction de seconde. Les caractéristiques moléculaires et de laminage sur les cellules adhérentes, telles que des grappes de molécules de surface cellulaire, ont également le potentiomètreal à subir une réorganisation active sur la surface de la cellule. Ainsi, les systèmes d&#39;imagerie doivent fournir une résolution temporelle exceptionnel (30 images par seconde ou plus, et &quot;proche de zéro&quot; temps d&#39;exposition) pour générer une séquence d&#39;images qui illustre la progression étape par étape de la cellule de roulement 6, 7. Systèmes de séparation double caméra d&#39;émission sont capables de répondre à ces exigences pour l&#39;imagerie de cellules marquées avec des fluorophores multiples. Systèmes de séparation double caméra d&#39;émission répartis et canaux de fluorescence de filtre en deux caméras semblables à capturer simultanément deux images identiques mais spatialement spécifique fluorophores tout en conservant la totalité du champ de vue. Cette technologie permet la comparaison directe de l&#39;image capturée en temps réel dans chaque canal et permet à l&#39;utilisateur de basculer rapidement entre les modèles d&#39;appareil photo avec différentes capacités d&#39;imagerie. Cette fonction est utile pour faire des ajustements aux paramètres de capture d&#39;image dans un appareil photo qui mieux permettre au système de capturefluorophores avec différentes intensités, durées de vie, et des coefficients d&#39;extinction 8. Couplée avec un logiciel d&#39;imagerie, des systèmes de séparation d&#39;émission de caméra double permet l&#39;enregistrement en temps réel en direct des dosages d&#39;imagerie des cellules dans les longueurs d&#39;onde multiples et peuvent améliorer les essais in vitro qui utilisent la fluorescence pour étudier le comportement des cellules.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Réactif/Matériel</Cellules fortes></td></tr><tr><td>BT-20</td><td>Cellules ATCC</td><td>HTB-19</td><td></td></tr><tr><td>CHO-E</td><td>Don du Dr R. Sackstein (Brigham and Women' s Hospital, Harvard Medical School)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM </td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30024.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine / 0,1 % EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30031,01</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028,02</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+</td><td>Life Technologies</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>HECA-452 Anticorps monoclonal</td><td>BD Biosciences</td><td>555946</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal CD24 anti-humain</td><td>BD Biosciences</td><td>555426</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rat IgM AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21212</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris IgG AlexaFluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11004</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>EXi Blue Fluorescence Microscopy</td> Digital <td>CCD Camera Q Imaging</td><td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Retiga EXi FAST 1394 Caméra numérique CCD</td><td>Q Imaging</td><td>RET-EXi-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>DC2 Emission Splitter</td><td>Photometrics</td><td>DC2</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence inversée</td><td>Leica</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Streampix 5</td><td>Norpix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

capture simultanément en temps réel des images en deux canaux d&#39;émission en utilisant un système de fractionnement double caméra émission: applications à l&#39;adhésion cellulaire

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Multi-color microscopie par immunofluorescence pour détecter des molécules spécifiques dans la membrane cellulaire peut être couplé avec des dosages en parallèle de la chambre d&#39;écoulement de la plaque pour étudier les mécanismes qui régissent l&#39;adhérence cellulaire dans des conditions d&#39;écoulement dynamique. Par exemple, les cellules cancéreuses marquées avec des fluorophores multiples peuvent être perfusées sur un substrat potentiellement réactifs pour modéliser les mécanismes de la métastase cancéreuse. Cependant, multi-canaux systèmes de caméras et appareils photo unique de couleur présentent des lacunes dans l&#39;acquisition d&#39;image pour analyse en temps réel des cellules vivantes. Pour surmonter ces limitations, nous avons utilisé un système de séparation des émissions de double caméra pour capturer simultanément en temps réel des séquences d&#39;images de cellules marquées par fluorescence dans la chambre d&#39;écoulement. Longueur d&#39;onde filtre des systèmes de séparation d&#39;émission de l&#39;appareil photo à double sens varie en deux caméras CCD monochrome, capturant ainsi simultanément deux images identiques mais spatialement spécifique fluorophores. Par la suite, psuedocolored images d&#39;un canal sont combinés en un seulen temps réel a fusionné la séquence qui peut révéler de multiples molécules cibles sur des cellules se déplaçant rapidement à travers une région d&#39;intérêt.

Un essai d&#39;adhérence à la chambre d&#39;écoulement à plaques parallèles a été utilisé pour démontrer un système de fractionnement appareil d&#39;émission double qui a capturé simultanément en temps réel de séquences d&#39;images en deux voies d&#39;émission (figure 1). Le système de division de l&#39;émission de la caméra double détecté BT-20 cellules qui ont été marquées par fluorescence avec CD24 anti-humain et HECA-452 (détection des antigènes sialofucosylated) des anticorps monoclonaux et des an...

Émissions des systèmes de séparation à double caméra pour deux couleurs microscopie à fluorescence générer en temps réel des séquences d&#39;images avec une résolution optique et temporelle exceptionnelle, une exigence de certains tests cellulaires en direct, y compris des essais parallèles chambre d&#39;écoulement de la plaque d&#39;adhérence. Lorsque le logiciel est utilisé pour fusionner des images de canaux d&#39;émission acquis simultanément, des séquences d&#39;images pseudocolored sont produites.

Capture simultanément en temps réel des images en deux canaux d&#39;émission en utilisant un système de fractionnement double caméra émission: Applications à l&#39;adhésion cellulaire

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser un test d'adhérence en chambre d'écoulement à plaques parallèles à l'aide d'un système de séparation d'émission à double caméra afin d'enregistrer simultanément des séquences d'images en temps réel dans deux couleurs. Pour ce faire, les deux caméras du dispositif d'imagerie sont d'abord alignées. Ensuite, les cellules et le substrat réactif sont préparés, puis la chambre d'écoulement à plaques parallèles est montée.Les paramètres de la caméra sont ensuite calibrés pour l'acquisition d'images en deux couleurs et toutes les corrections numériques nécessaires sont appliquées à l'alignement de la caméra. Des séquences d'images sont ensuite capturées, illustrant l'acquisition d'images en double couleur avec une résolution temporelle élevée. L'avantage des systèmes de séparation d'émission à double caméra par rapport aux systèmes à caméra unique est qu'un temps d'exposition différent peut être attribué à chaque caméra et que tout le champ de vision est conservé.Cette technique peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'adhérence cellulaire, telles que la manière dont la localisation des molécules d'adhérence à la

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Le cloisonnement des protéines soit au sein de la membrane plasmique ou dans des endroits intracellulaires est un mécanisme de régulation qui peuvent grandement influencer les résultats de signalisation, d'où, à comprendre la signalisation, il est important d'étudier le comportement spatial et temporel des protéines impliquées. Nous décrivons ici un système de microscopie TIRF base pour étudier la transduction du signal dans les cellules T, mais est largement applicable.

Une technique de microscopie TIRF en temps réel, imagerie simultanée du TCR et de ses associés protéines de signalisation

Förster énergie de résonance de transfert (FRET) microscopie est une technique puissante pour surveiller en temps réel des événements de signalisation dans les cellules vivantes en utilisant différents biocapteurs en tant que journalistes. Ici, nous décrivons comment construire un épifluorescence personnalisée FRET système d'imagerie à partir de composants disponibles dans le commerce et la façon de l'utiliser pour des expériences de FRET.

FRET microscopie pour Surveillance en temps réel des événements de signalisation dans les cellules vivantes en utilisant Biocapteurs unimoléculaires

Source : Bello-Gamboa, A. et al., Imagerie de la synapse immunologique humaine.J. Vis. Exp.(2019) Cette vidéo montre l’étude in vitro de la formation de synapses immunologiques entre une cellule présentatrice d’antigène et des lymphocytes T auxiliaires à l’aide d’un microscope à fluorescence. Les récepteurs des lymphocytes T auxiliaires interagissent avec un complexe antigène-CMH-II dans les cellules présentatrices d’antigène et forment des synapses immunologiques, suivies de mouvements de...

Formation de synapses immunologiques entre les lymphocytes T auxiliaires et les cellules présentatrices d’antigène

Source : Kulkarni, M. et al. Imagerie Ca2+ Dynamique dans les terminaux axonaux des photorécepteurs coniques de la rétine de la souris. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo montre l’utilisation de la microscopie à deux photons pour surveiller la dynamique calcique dans les photorécepteurs coniques d’une rétine de souris transgénique. Il décrit les étapes de préparation des coupes rétiniennes, d’imagerie des biocapteurs de calcium basés sur FRET et d’analyse des changements de fluorescence pour...

Microscopie à deux photons pour la surveillance de la dynamique calcique dans les photorécepteurs coniques rétiniens de souris

Nous décrivons une méthode d'imagerie des cellules vivantes qui donne un aperçu de la dynamique des protéines au cours du processus d'activation des lymphocytes T. Nous démontrons l'utilisation combinée de la cellule T test d'épandage, microscopie confocale et analyse d'imagerie pour obtenir des résultats quantitatifs à suivre la signalisation formation du complexe à travers l'activation des lymphocytes T.

En temps réel l&#39;imagerie en direct de T-signalisation cellulaire Formation Complex

Nous démontrons l’utilisation de la microscopie de localisation par photo-activation de fluorescence (FPALM) pour imager simultanément plusieurs types de molécules marquées par fluorescence au sein des cellules. Les techniques décrites permettent de localiser des milliers à des centaines de milliers de protéines individuelles marquées par fluorescence, avec une précision de plusieurs dizaines de nanomètres à l’intérieur de cellules uniques.

Imagerie multicolore simultanée de structures biologiques avec microscopie de localisation par photoactivation de fluorescence

Nous présentons ici un protocole pour la localisation multi-couleur des protéines membranaires unique dans les organites des cellules vivantes. Pour fixer les fluorophores, étiquetage des protéines sont utilisées. Protéines, situés dans des compartiments de différentes membranes de l’organite même, peuvent être localisées avec une précision d’environ 18 nm.

Microscopie multicolore localisation des protéines de la Membrane unique dans les organites des cellules mammifères vivants

Nous présentons ici un guide pratique de construction d’un système de microscopie intégrée, qui fusionne l’imagerie conventionnelle épi-fluorescence, l’imagerie Super-résolution axée sur la détection de molécules simples et détection de molécules simples multicolore, y compris transfert d’énergie Single-molecule fluorescence resonance imaging, dans une mise en place d’une manière rentable.

Réalisation de multiples Modes d’imagerie avec un Microscope à Fluorescence

Nous décrivons une approche de formation image pour la détermination de l'état oligomeric moyen des oligomères mEGFP-marqué-récepteurs induits par la liaison de ligand dans la membrane de plasma des cellules vivantes. Le protocole est basé sur la microscopie de la fluorescence de la réflexion interne totale (TIRF) combinée à l'analyse du nombre et de la luminosité (N-B).

Dynamique d'oligomerisation des récepteurs de surface cellulaire dans les cellules vivantes par microscopie de fluorescence interne totale combinée à l'analyse du nombre et de la luminosité

Ce protocole présente une collection de données géométriques sarcomères, calciques et macroscopiques provenant d’une trabécule cardiaque en contraction active ex vivo. Ces mesures simultanées sont rendues possibles par l’intégration de trois modalités d’imagerie.

Imagerie tomographique simultanée en champ lumineux, en fluorescence et par cohérence optique de trabécules cardiaques contractants ex vivo

Ce protocole présente les procédures expérimentales pour effectuer le test d’empreinte d’adhérence afin d’imager les événements d’adhérence pendant l’adhésion rapide des cellules.

Imagerie de l’adhésion moléculaire dans le laminage cellulaire par essai d’empreinte d’adhérence

Découvrez l'imagerie en deux couleurs en temps réel pour les essais d'adhésion cellulaire en utilisant un système de fractionnement d'émission à double caméra. Cette méthode améliore la résolution temporelle et la qualité d'image.

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Capture simultanément en temps réel des images en deux canaux d'émission en utilisant un système de fractionnement double caméra émission: Applications à l'adhésion cellulaire

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