Imagerie multicolore simultanée de structures biologiques avec microscopie de localisation par photoactivation de fluorescence

L’objectif global de cette procédure est d’imager plusieurs espèces de protéines simultanément avec une précision nanométrique dans des cellules fixes ou vivantes. Pour ce faire, il suffit d’ajuster d’abord la position d’une caméra et de l’optique jusqu’à ce qu’une image focalisée du microscope soit projetée sur la puce de la caméra. La deuxième étape consiste à disposer les faisceaux laser de manière à ce qu’ils soient directement alignés sur un échantillon sur la platine du microscope.

Ensuite, l’échantillon cellulaire préparé est éclairé et une cellule exprimant les protéines souhaitées est choisie. La dernière étape consiste à imager la cellule avec la microscopie de localisation par photo-activation de fluorescence en éclairant l’échantillon avec des lasers, puis en dirigeant la fluorescence de la cellule vers la puce de la caméra pour acquérir un ensemble de données. En fin de compte, la microscopie de localisation par photo-activation de fluorescence est utilisée pour montrer la localisation de plusieurs espèces de protéines à l’échelle spatiale nanométrique dans des cellules fixes ou vivantes et à champ large ou lors de l’utilisation de la fluorescence à réflexion interne totale pour isoler une région mince de l’échantillon.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la microscopie confocale ou électronique, est que l’on peut imager plusieurs protéines simultanément avec une résolution nanométrique dans des cellules fixes ou vivantes. Les étapes suivantes se réfèrent à un système de numérotation tel qu’illustré ici, qui est un schéma pour la configuration multicolore F Om fourni comme figure un dans le protocole de texte d’accompagnement pour aligner le microscope : commencez par placer une échelle d’étalonnage ou un radical sur la platine du microscope avec un objectif 10 x en place et le réglage de la lampe pour la lumière transmise. Centrez la verticale au centre du champ de vision.

Ensuite, ajustez le microscope pour un éclairage plus large en fermant l’ouverture du champ et en regardant à travers les oculaires à la verticale. Si les bords de l’ouverture du champ sont flous, ajustez la hauteur du condenseur jusqu’à ce que l’ouverture du champ et le rouge soient nets. Ajustez ensuite la position latérale de l’ouverture du champ jusqu’à ce qu’elle soit centrée par rapport au champ de vision et fermez l’ouverture du champ jusqu’à ce que seule la grille centrale du rouge soit éclairée.

La première fois que ces composants sont assemblés, ajustez les longueurs de trajet de chaque canal pour qu’elles soient égales. Pour réaliser ce projet, le rouge sur la puce de la caméra ajuste les miroirs sept et neuf et ferme l’ouverture de détection pour éviter le chevauchement spatial entre les deux canaux. Ensuite, focalisez l’image du radical dans le canal de lumière réfléchie et vérifiez s’il est également net dans le canal de lumière transmise.

Si l’image dans le canal de lumière transmise n’est pas nette, décalez le miroir neuf jusqu’à ce que l’image radicale soit nette simultanément dans les deux canaux. Commencez à aligner les lasers en retirant la lentille un de la trajectoire du laser et en bloquant les faisceaux d’activation et de lecture. Placez ensuite une carte blanche au ras du miroir quatre, ouvrez l’obturateur du microscope et faites la mise au point jusqu’à ce que l’image radicale soit projetée sur la carte devant le miroir quatre.

Ensuite, débloquez le faisceau de lecture et ajustez le miroir un pour centrer le laser de lecture sur le réticule de l’image radicale du miroir quatre. Une fois centré, projetez l’image radicale sur le miroir cinq et ajustez le miroir quatre jusqu’à ce que le faisceau soit centré sur le réticule de l’image du miroir cinq. Le faisceau de lecture doit maintenant être centré à la fois sur M quatre et M cinq.

Bloquez ensuite le faisceau de lecture en fermant l’obturateur un. Ensuite, projetez l’image radicale sur le miroir trois. Retirez l’extenseur de faisceau de la trajectoire du laser et débloquez le laser d’activation.

Ajustez maintenant le miroir deux pour centrer le faisceau d’activation sur le réticule de l’image radicale du miroir trois. Une fois centré, replacez l’extenseur de faisceau entre les miroirs deux et trois et ajustez la position de l’extenseur de faisceau jusqu’à ce que le faisceau soit centré sur le réticule de l’image radicale. Sur le miroir trois, projetez l’image radicale sur le miroir cinq et faites la mise au point.

À l’aide du bouton de mise au point du microscope, ajustez l’angle du miroir dichroïque numéro un jusqu’à ce que le faisceau d’activation soit centré sur l’image du rouge. Bloquez ensuite le laser d’activation en fermant l’obturateur deux sans objectif en place et l’obturateur du microscope ouvert. Ouvrez l’obturateur de lecture et projetez le laser à travers l’ouverture arrière du microscope.

Ajustez le miroir cinq jusqu’à ce que le faisceau sorte du microscope, de sorte que le faisceau sorte du microscope verticalement avec la lentille un et l’objectif en place. Placez un échantillon contenant 100 micromolaires de brome B sur la platine avec le laser d’activation bloqué. Projetez le laser de lecture à travers un objectif 60x et dans le colorant.

Avec le gain multiplicateur d’électrons désactivé. Envoyez cette image à l’appareil photo. Ensuite, concentrez l’objectif sur l’échantillon.

Ouvrez l’ouverture suffisamment large pour permettre l’imagerie du profil du faisceau complet. Déplacez ensuite l’ouverture latéralement de sorte que le centre du profil du faisceau et l’ouverture soient concentriques. À l’aide du logiciel de la caméra, choisissez la région d’intérêt pour autoriser la plus petite région de lecture de la caméra encapsulant les deux canaux et enregistrez ces coordonnées.

À ce stade, enregistrez un seul instantané pour représenter le profil du faisceau de lecture. Ensuite, bloquez le laser de lecture en fermant l’obturateur un et en ouvrant l’obturateur deux. Afin de commencer à mesurer le profil du faisceau d’activation, projetez le laser d’activation sur l’échantillon, si nécessaire, utilisez un gain multiplicateur d’électrons inférieur à 100 et ajustez le premier miroir dichroïque jusqu’à ce que le faisceau soit centré dans chaque champ de vision.

Enregistrez ensuite un instantané du profil du faisceau d’activation afin de commencer à acquérir des images multicolores de la paume F. Éliminez tout éclairage de pièce. Ensuite, projetez la lampe au mercure via la monture rabattable sur des cellules transfectées et changez le cube du filtre pour un cube contenant la longueur d’onde d’excitation appropriée du pré-photocommutateur. État.

Une fois qu’une cellule est choisie, déplacez la monture rabattable vers le bas afin de permettre aux lasers de passer dans le microscope, changez la tourelle du filtre pour celle contenant le miroir dichroïque approprié pour l’imagerie, comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Projetez ensuite cette image sur la caméra pour distinguer les cellules transfectées de la fluorescence de fond et pour confirmer que les molécules sont photonables. Éclairez brièvement l’échantillon avec une faible puissance de moins de 10 microwatts à partir du laser d’activation.

Ensuite, préparez le logiciel de la caméra pour l’acquisition de séries cinétiques en réglant le jeu multiplicateur d’électrons sur 200 et le nombre d’images souhaité entre cinq et 10 000. Réglez également l’exposition entre 10 et 30 millisecondes. Bloquez ensuite le faisceau d’activation, débloquez le faisceau de lecture et projetez l’image de la cellule éclairée sur la caméra.

Choisissez un plan focal près de la membrane cellulaire inférieure en déplaçant la mise au point vers le bas jusqu’à ce que les molécules individuelles ne soient plus visibles. Ensuite, déplacez progressivement le foyer vers le haut jusqu’à ce que les molécules deviennent d’abord visibles. Maintenant, débloquez le faisceau d’activation et illuminez l’échantillon avec moins d’un watt par centimètre carré d’intensité.

Commencez à acquérir ces données via le logiciel de la caméra tout en maintenant une densité de 0,1 à une molécule photonable visible par micron carré en ajustant dynamiquement le filtre de densité neutre devant le laser d’activation. Pour une imagerie par fluorescence à réflexion interne totale, la monture miroir cinq et la lentille un sur une seule platine de translation à déplacer latéralement juste derrière l’entrée du microscope. Au fur et à mesure que le miroir cinq et la lentille un sont translatés, les lasers sortant de l’objectif vers le haut à travers l’échantillon basculeront progressivement d’un côté, continuant à déplacer l’étage jusqu’à ce que l’angle des lasers atteigne 90 degrés par rapport à la verticale.

À ce stade, le laser émergent lui-même disparaîtra et le laser entrant sera à nouveau réfléchi dans l’ouverture, se déplaçant anti-parallèlement au faisceau entrant et déplacé sur le côté. Vous devriez voir une réduction du bruit de fond lorsque l’échantillon entre en fluorescence à réflexion interne totale à la fin des acquisitions d’images, fermez immédiatement l’obturateur du microscope et bloquez les deux faisceaux. Désactivez le gain multiplicateur d’électrons.

Réglez l’appareil photo pour qu’il enregistre une image et définissez la zone de lecture de l’appareil photo sur sa taille maximale. Enfin, bloquez un canal en plaçant une carte sur F trois ou F quatre avec un filtre passe-long monté sur la lampe du microscope. Illuminez l’échantillon et projetez cette image sur l’appareil photo.

Enregistrez un instantané de la cellule pour représenter la cellule entière en lumière transmise. Voici un exemple d’acquisition de la paume d’une cellule NIH à trois cellules T exprimant à la fois DENDRA deux hémagglutinine et PAM Cherry actin. Le canal transmis à gauche contient des longueurs d’onde plus longues que le canal réfléchi à droite.

Voici des instantanés de la même acquisition F OM en deux couleurs après l’arrière-plan, la soustraction et la transformation pour superposer les canaux gauche et droit. Les molécules individuelles peuvent être identifiées et localisées. Certaines molécules apparaissent plus brillantes dans le canal transmis et d’autres ont une distribution d’émission plus uniforme entre les deux canaux.

Cela indique la différence de spectres d’émission entre PAM cherry et DENDRA two respectivement et est utilisé dans l’analyse pour identifier ces deux espèces. L’histogramme présenté ici indique un rapport entre l’intensité du canal transmis rouge divisée par l’intensité totale pour toutes les molécules localisées après application des tolérances. Les pixels apparaissent en blanc dans l’image en bas à gauche et en rouge dans l’image fusionnée finale illustrée en bas à droite, tandis que ceux de la région verte sont affichés en blanc dans l’image en haut à droite et apparaissent en vert dans l’image fusionnée finale illustrée en bas à droite.

Les niveaux de seuil choisis lors du rendu affectent grandement le degré de bruit et l’apparence de la colocalisation. Montré. Voici trois options différentes pour le rendu qui entraînent des degrés variables de saignement à travers les niveaux de seuil les plus conservateurs sont indiqués sur les deux inférieurs. Les histogrammes alpha de la paume de la main de la couleur F sont les meilleurs à interpréter lorsqu’il y a deux pics discernables dans l’image.

Bien que l’histogramme de gauche soit un bon candidat pour une analyse plus approfondie, les images résultant des deux autres histogrammes seront beaucoup plus difficiles à interpréter suite à cette procédure. Des méthodes telles que la réflexion interne totale, la microscopie et l’imagerie de cellules vivantes peuvent être mises en œuvre afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’organisation des protéines à l’échelle nanométrique dans les membranes cellulaires vivantes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de configurer votre propre microscope FAR et de l’utiliser pour acquérir des données.

N’oubliez pas que travailler avec des lasers peut être extrêmement dangereux et qu’une formation à la sécurité doit être suivie avant de tenter cette procédure.