Imagerie multicolore simultanée de structures biologiques avec microscopie de localisation par photoactivation de fluorescence

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir simultanément des images de plusieurs espèces protéiques avec une précision nanométrique dans des cellules fixées ou vivantes. Cela est réalisé en ajustant d'abord la position d'une caméra et de l'optique jusqu'à ce qu'une image nette provenant du microscope soit projetée sur la puce de la caméra. La deuxième étape consiste à aligner les faisceaux laser de manière à ce qu'ils soient directement superposés sur l'échantillon placé sur la platine du microscope.

Ensuite, l'échantillon cellulaire préparé est illuminé et une cellule exprimant les protéines souhaitées est sélectionnée. La dernière étape consiste à imager la cellule par microscopie de localisation à activation photo-fluorescente en illuminant l'échantillon avec des lasers, puis en dirigeant la fluorescence cellulaire vers la puce de la caméra afin d'acquérir un jeu de données. En définitive, la microscopie de localisation à activation photo-fluorescente permet de visualiser la localisation de plusieurs espèces protéiques à l'échelle spatiale du nanomètre, dans des cellules fixées ou vivantes, en champ large ou en utilisant la fluorescence par réflexion totale interne pour isoler une fine région de l'échantillon.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la microscopie confocale ou électronique est qu'elle permet d'observer simultanément plusieurs protéines avec une résolution nanométrique dans des cellules fixées ou vivantes. Les étapes suivantes font référence à un système de numérotation illustré ici, qui constitue un schéma du dispositif F Om multicolore fourni en figure 1 du protocole accompagnant le texte pour aligner le microscope : commencez par placer une échelle de calibration ou un radical sur la platine du microscope, avec un objectif 10 x en place et la lampe réglée pour la lumière transmise. Centrez la ligne verticale au centre du champ de vision.

Ensuite, ajustez le microscope pour une illumination coaxiale en fermant le diaphragme de champ et en regardant à travers les oculaires vers le vertical. Si les bords du diaphragme de champ sont flous, ajustez la hauteur du condenseur jusqu'à ce que le diaphragme de champ et le réticule soient tous deux au point. Réglez ensuite la position latérale du diaphragme de champ pour le centrer par rapport au champ de vision, puis fermez le diaphragme de champ jusqu'à ce que seul le quadrillage central du réticule soit éclairé.

Lors du premier assemblage de ces composants, ajustez les longueurs de trajet de chaque canal afin qu'elles soient égales. Pour réaliser ce réglage, redirigez la lumière vers la puce de la caméra en ajustant les miroirs sept et neuf, et fermez l'ouverture de détection afin d'éviter tout recouvrement spatial entre les deux canaux. Mettez ensuite au point l'image du radical dans le canal de lumière réfléchie, puis vérifiez si elle est également nette dans le canal de lumière transmise.

Si l'image dans le canal de lumière transmise n'est pas nette, déplacez le miroir neuf jusqu'à ce que l'image radicale soit nette simultanément dans les deux canaux. Commencez l'alignement des lasers en retirant la lentille un du trajet du laser et en bloquant les faisceaux d'activation et de lecture. Placez ensuite une carte blanche contre le miroir quatre, ouvrez l'obturateur du microscope et focalisez jusqu'à ce que l'image radicale se projette sur la carte située devant le miroir quatre.

Ensuite, débloquez le faisceau de lecture et ajustez le miroir un pour centrer le laser de lecture sur les réticules de l'image du radical située sur le miroir quatre. Une fois centré, projetez l'image du radical sur le miroir cinq et ajustez le miroir quatre jusqu'à ce que le faisceau soit centré sur les réticules de l'image du miroir cinq. Le faisceau de lecture doit maintenant être centré à la fois sur M quatre et M cinq.

Ensuite, bloquez le faisceau de lecture en fermant l'obturateur un. Puis, projetez l'image du radical sur le miroir trois. Retirez l'expandeur de faisceau du trajet du laser et débloquez le laser d'activation.

Réglez maintenant le miroir deux pour centrer le faisceau d'activation sur les réticules de l'image du radical située sur le miroir trois. Une fois le faisceau centré, remettez en place l'expansateur de faisceau entre les miroirs deux et trois, puis ajustez la position de l'expansateur jusqu'à ce que le faisceau soit centré sur les réticules de l'image du radical. Sur le miroir trois, projetez l'image du radical sur le miroir cinq et effectuez la mise au point.

À l’aide de la molette de mise au point du microscope, ajustez l’angle du miroir dichroïque numéro un jusqu’à ce que le faisceau d’activation soit centré sur l’image rouge. Ensuite, bloquez le laser d’activation en fermant l’obturateur deux, sans objectif en place et avec l’obturateur du microscope ouvert. Ouvrez l’obturateur de lecture, obturateur un, et projetez le laser à travers l’ouverture arrière du microscope.

Réglez le miroir cinq jusqu'à ce que le faisceau émerge du microscope, de sorte qu'il quitte le microscope verticalement avec la lentille un et l'objectif remis en place. Placez un échantillon contenant 100 micromolaire de brome B sur la platine, le laser d'activation étant bloqué. Projetez le laser de lecture à travers un objectif 60 x et dans le colorant.

Avec le gain de multiplication électronique désactivé. Envoyez cette image à la caméra. Ensuite, focalisez l'objectif dans l'échantillon.

Ouvrez l'ouverture suffisamment pour permettre l'acquisition du profil complet du faisceau. Ensuite, déplacez latéralement l'ouverture de manière à ce que le centre du profil du faisceau et celui de l'ouverture soient concentriques. À l'aide du logiciel de la caméra, sélectionnez la région d'intérêt afin d'obtenir la plus petite zone de lecture de la caméra englobant les deux canaux, puis enregistrez ces coordonnées.

À ce stade, enregistrez une seule image afin de représenter le profil du faisceau de lecture. Ensuite, bloquez le laser de lecture en fermant l'obturateur un et ouvrez l'obturateur deux. Afin de commencer à mesurer le profil du faisceau d'activation, projetez le laser d'activation sur l'échantillon ; si nécessaire, utilisez un gain multiplicateur électronique inférieur à 100 et ajustez le premier miroir dichroïque jusqu'à ce que le faisceau soit centré dans chaque champ de vision.

Ensuite, enregistrez une image du profil du faisceau d'activation afin de commencer l'acquisition d'images F palm multicolores. Éliminez toute lumière ambiante. Ensuite, projetez la lampe au mercure via le support basculant sur les cellules transfectées et changez le cube de filtres pour un cube contenant la longueur d'onde d'excitation appropriée de l'état préalable au commutage photo.

Une fois la cellule choisie, abaisser le support pivotant afin de laisser passer les lasers dans le microscope, puis changer la tourelle de filtres pour utiliser celle contenant le miroir dichroïque approprié pour l'imagerie, comme décrit dans le protocole textuel associé. Ensuite, projeter cette image sur la caméra afin de distinguer les cellules transfectées de la fluorescence de fond et de confirmer que les molécules sont photoactivables. Illuminer brièvement l'échantillon avec une faible puissance inférieure à 10 micro watts provenant du laser d'activation.

Ensuite, préparez le logiciel de la caméra pour l'acquisition de séries cinétiques en réglant le gain multiplicateur d'électrons à 200 et le nombre souhaité d'images entre cinq et 10 000. Réglez également le temps d'exposition entre 10 et 30 millisecondes. Puis, bloquez le faisceau d'activation, débloquez le faisceau de lecture et projetez l'image de la cellule illuminée sur la caméra.

Choisissez un plan focal proche de la membrane cellulaire inférieure en déplaçant le focus vers le bas jusqu'à ce que les molécules individuelles ne soient plus visibles. Ensuite, remontez progressivement le focus jusqu'à ce que les molécules deviennent visibles pour la première fois. Désactivez maintenant le faisceau d'activation et éclairez l'échantillon avec une intensité inférieure à un watt par centimètre carré.

Commencez à acquérir ces données à l’aide du logiciel de la caméra tout en maintenant une densité de 0,1 à une molécule photoactivable visible par micron carré, en ajustant dynamiquement le filtre neutre placé devant le laser d’activation. Pour l’imagerie par fluorescence en réflexion totale, montez le miroir cinq et la lentille un sur une même platine de translation afin de les déplacer latéralement juste derrière l’entrée du microscope. Lorsque le miroir cinq et la lentille un sont translatés, les lasers sortant vers le haut à travers l’objectif et l’échantillon s’inclinent progressivement sur un côté ; continuez à déplacer la platine jusqu’à ce que l’angle des lasers atteigne 90 degrés par rapport à la verticale.

À ce stade, le laser émergent disparaîtra lui-même et le laser entrant sera réfléchi en arrière dans l'ouverture, se propageant en sens antiparallèle au faisceau entrant et décalé sur le côté. Vous devriez observer une réduction du fond lorsque l'échantillon entre en fluorescence par réflexion totale interne après l'achèvement des acquisitions d'images ; fermez immédiatement l'obturateur du microscope et bloquez les deux faisceaux. Désactivez le gain multiplicateur électronique.

Réglez la caméra pour enregistrer une seule image et définissez la zone de lecture de la caméra à sa taille maximale. Enfin, masquez un canal en plaçant une carte devant F trois ou F quatre, avec un filtre passe-long monté sur la lampe du microscope. Éclairez l'échantillon et projetez cette image sur la caméra.

Enregistrez une image de la cellule en lumière transmise afin de représenter l'ensemble de la cellule. On voit ici un exemple d'acquisition F palm en deux couleurs d'une cellule NIH trois T trois exprimant à la fois DENDRA deux hémagglutinine et l'actine PAM Cherry. Le canal transmis à gauche contient des longueurs d'onde plus longues que le canal réfléchi à droite.

Des instantanés issus de la même acquisition en deux couleurs en MOF sont présentés ici, après soustraction du fond, et transformation pour superposer les canaux gauche et droit. Des molécules individuelles peuvent être identifiées et localisées. Certaines molécules apparaissent plus brillantes dans le canal transmis, tandis que d'autres présentent une répartition plus équilibrée de l'émission entre les deux canaux.

Cela indique la différence entre les spectres d'émission respectifs de PAM cherry et de DENDRA deux, et est utilisé lors de l'analyse pour identifier ces deux espèces. L'histogramme présenté ici indique le rapport entre l'intensité du canal rouge transmis et l'intensité totale pour toutes les molécules localisées, après application des tolérances. Les pixels apparaissent blancs sur l'image en bas à gauche et apparaissent rouges sur l'image finale fusionnée, montrée en bas à droite, tandis que ceux situés dans la région verte sont affichés en blanc sur l'image en haut à droite et apparaissent verts sur l'image finale fusionnée, montrée en bas à droite.

Les niveaux seuils choisis lors du rendu influencent fortement le degré de bruit et l'apparence de la colocalisation. Trois options différentes de rendu sont présentées ici, produisant des degrés variables de recouvrement ; les niveaux seuils les plus conservateurs sont indiqués dans les deux cas inférieurs. Les histogrammes de couleur F palm alpha sont plus faciles à interpréter lorsqu'il existe deux pics distincts dans l'image.

Bien que l'histogramme de gauche soit un bon candidat pour une analyse plus poussée, les images résultant des deux autres histogrammes seront beaucoup plus difficiles à interpréter selon cette procédure. Des méthodes telles que la microscopie par réflexion totale interne et l'imagerie de cellules vivantes peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la manière dont les protéines sont organisées à l'échelle nanométrique dans les membranes cellulaires vivantes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de configurer votre propre microscope FAR et de l'utiliser pour acquérir des données.

N'oubliez pas que le travail avec des lasers peut être extrêmement dangereux, et une formation en sécurité doit être suivie avant de tenter cette procédure.