Name: Un préclinique modèle murin de métastases hépatiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Découvrez une technique d'injection hémi-splénique pour modéliser les métastases hépatiques du cancer du pancréas chez la souris. Cette méthode préclinique permet d'étudier la progression tumorale et d'évaluer de nouvelles thérapies.

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KF et KO sont co premiers auteurs avec KS Ce travail a été financé en partie par le AHPBA Fellowship (KS), NIH K23 CA148964-01 (LZ), Johns Hopkins School of Medicine Bourse de recherche clinique scientifique (LZ), Fondation Viragh et Cancer Center Passer Viragh pancréas à l&#39;Université Johns Hopkins (EMJ et LZ), le pancréas Fondation nationale (LZ), la Fondation de la famille Lefkofsky (LZ), la SPORE NCI dans Gastrointestinal Cancers CA062924 P50 (EMJ, LZ), la Fondation Lustgarten (LZ), et les subventions Sol Goldman pancréas Cancer Center (KS , BHE, LZ).

Toutes les expériences sur les animaux étaient conformes aux lignes directrices du soin et l&#39;utilisation des animaux Comité de l&#39;Université Johns Hopkins, et les animaux ont été maintenus en conformité avec les directives de l&#39;Association pour l&#39;évaluation et l&#39;accréditation des soins de laboratoire (AAALAC). La procédure chirurgicale est effectuée dans des conditions stériles dans une salle d&#39;opération qui est soumis à un minimum de quinze renouvellements d&#39;air par heure. Tous les instruments sont stérilisés par autoclavage avant la procédure et à nouveau avec de l&#39;éthanol à 70% entre chacune des souris au cours de la procédure. Toutes les souris qui ne devraient pas survivre à l&#39;intervention chirurgicale sont euthanasiés sous CO 2 pendant 3 min puis par dislocation cervicale tout en restant sous anesthésie. 1 Préparation des cellules <ol><li> Remettre en suspension les cellules cultivées Panc02 dans un tampon phosphate salin à 2 x10 7 cellules / ml, et garder sur la glace. </li></ol> 2 Préparation de la souris <ol><li> Administrer la kétaminee (100 mg / kg) en mélange avec la xylazine (10 mg / kg) par voie intrapéritonéale à 8-12 semaines les souris C57BL / 6 de souris femelles en doses fractionnées. </li><li> Vérifiez que la pointe retrait de pincement réflexe est aboli afin de s&#39;assurer que la souris est totalement anesthésié. </li><li> Administrer des doses supplémentaires de kétamine (100 mg / kg) en mélange avec xylazine (10 mg / kg) comme nécessaire pour anesthésier les souris complètement. </li><li> Appliquer Puralube Vet onguent pour les yeux des souris pour éviter le dessèchement tandis que les souris sont sous anesthésie. </li><li> Raser la région chirurgicale de la souris afin d&#39;éviter la contamination de la plaie. </li><li> Prep la région sous-costale gauche de l&#39;incision avec 70% d&#39;éthanol et de l&#39;iode. </li><li> Placez un drap chirurgical autour de l&#39;abdomen pour maintenir la stérilité. </li></ol> 3. laparotomie <ol><li> Faire une incision sous-costale gauche en ligne avec l&#39;oreille gauche à travers la peau et à travers le péritoine à l&#39;aide d&#39;un scalpel. </li><li> Exprimez la rate à travers l&#39;incision en appliquant p numérique simultanéeression long des aspects crânienne et caudale de l&#39;incision. </li><li> Localiser les vaisseaux sanguins de la rate, à la fin inférieure de la rate. </li><li> Divisez la rate en plaçant deux Horizon taille moyenne clips ligature dans le centre de la rate en prenant soin de ne pas endommager les vaisseaux sanguins spléniques aux pôles de la rate. </li><li> Placer le pôle supérieur de la rate de nouveau dans le péritoine pour éviter la contamination. </li></ol> 4. tumorale par injection <ol><li> Dresser 150 pi de tampon phosphate salin dans un 26 G x 5/8 &quot;seringue. </li><li> Dresser 100 pi de Panc02 (2 x 10 6 cellules) dans la même seringue en maintenant la seringue en position verticale pendant toute la durée de l&#39;injection. </li><li> Tremper l&#39;aiguille dans une solution d&#39;éthanol à 70%. L&#39;aiguille est immergée dans de l&#39;éthanol à 70% pour assurer la stérilité. </li><li> Injecter les cellules lentement dans le hemispleen exposée étant que la seringue est maintenu en position verticale en tout temps. Le biseau de la Syringe doit être respecté en toutes circonstances par la capsule splénique pour éviter d&#39;injecter les cellules dans la rate. Un blanchiment de la rate et les vaisseaux sanguins doit être observée lors de l&#39;injection. </li><li> Élever la rate et d&#39;appliquer un milieu Horizon pince sous la rate pour obturer les vaisseaux sanguins spléniques. </li><li> Appliquer une petite pince Horizon à l&#39;aspect le plus distale du pancréas et vaisseaux spléniques. </li><li> Ligaturer le pancréas et les vaisseaux spléniques de la hemispleen en coupant au-dessus des clips Horizon. </li><li> Placez la souris sur son «côté, et irriguer l&#39;incision avec de l&#39;eau distillée. </li></ol> 5. abdominale fermeture et récupération de l&#39;anesthésie <ol><li> Fermez le péritoine avec un point 4-0 de course. </li><li> Appliquer deux à trois clips de la peau pour fermer l&#39;incision de la peau. </li><li> Administrer 0,1 mg / kg de buprénorphine ou 5-10 mg / kg par voie sous cutanée Carprofen pour soulager la douleur post-opératoire. </li><li> Placez la souris sur un coussin chauffant pour recovery jusqu&#39;à mobile et la souris montre les modes de respiration réguliers. Animaux ne sont retournés à la compagnie d&#39;autres animaux après avoir récupéré complètement de l&#39;intervention chirurgicale. </li></ol> 6 L&#39;autopsie examen et récolte du foie <ol><li> Entre 30 à 60 jours après l&#39;opération, les souris vont commencer à montrer des symptômes cliniques de métastases et nécessiteront l&#39;euthanasie. Les signes de la maladie métastatique nécessitant euthanasie comprennent abdomen élargie et le développement de l&#39;ascite. Euthanasier les souris par inhalation de CO 2. </li><li> En cas d&#39;inhalation, effectuer dislocation cervicale. </li><li> Après que l&#39;animal a été déterminée comme étant non recevable, faire une incision à travers le péritoine d&#39;exposer l&#39;abdomen avec des ciseaux. </li><li> En utilisant des pinces et ciseaux, couper délicatement le foie de l&#39;abdomen. </li><li> Placer le foie dans le composé PTOM, et le flash geler l&#39;aide d&#39;azote liquide. Conservez le foie à -80 ° C. Alternativement, le directr peut être fixé à 16% du formol tamponné neutre à la température ambiante pendant 24 heures et inclus en paraffine. </li></ol>

<ol><li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cancer+Facts+%26+Figures%22">Cancer Facts & Figures</a>. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).</li>
<li>Clark, C. E., Beatty, G. L., Vonderheide, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosurveillance+of+pancreatic+adenocarcinoma%3A+insights+from+genetically+engineered+mouse+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+letters%22%5BJournal%5D)">Immunosurveillance of pancreatic adenocarcinoma: insights from genetically engineered mouse models of cancer.</a> Cancer letters. 279, 1-7 (2009).</li>
<li>Rhim, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMT+and+dissemination+precede+pancreatic+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EMT and dissemination precede pancreatic tumor formation.</a> Cell. 148, 349-361 (2012).</li>
<li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mouse+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Maximizing mouse cancer models.</a> Nature reviews. Cancer. 7, 645-658 (2007).</li>
<li>Corbett, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+chemotherapeutic+response+of+two+transplantable+ductal+adenocarcinomas+of+the+pancreas+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Induction and chemotherapeutic response of two transplantable ductal adenocarcinomas of the pancreas in C57BL/6 mice.</a> Cancer research. 44, 717-726 (1984).</li>
<li>Leao, I. C., Ganesan, P., Armstrong, T. D., Jaffee, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+depletion+of+regulatory+T+cells+allows+the+recruitment+of+mesothelin-specific+CD8+T+cells+to+the+antitumor+immune+response+against+a+mesothelin-expressing+mouse+pancreatic+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+translational+science%22%5BJournal%5D)">Effective depletion of regulatory T cells allows the recruitment of mesothelin-specific CD8 T cells to the antitumor immune response against a mesothelin-expressing mouse pancreatic adenocarcinoma.</a> Clinical and translational science. 1, 228-239 (2008).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+a+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor-transduced+tumor+vaccine+and+systemic+interleukin-2+in+the+treatment+of+murine+colorectal+cancer+hepatic+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+surgical+oncology%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-transduced tumor vaccine and systemic interleukin-2 in the treatment of murine colorectal cancer hepatic metastases.</a> Annals of surgical oncology. 10, 810-820 (2003).</li>
<li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+targeting+of+antitumor+immune+responses+with+engineered+live-attenuated+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Selective targeting of antitumor immune responses with engineered live-attenuated Listeria monocytogenes.</a> Cancer research. 66, 1096-1104 (2006).</li>
<li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+attenuated+Listeria+monocytogenes+effectively+treats+hepatic+colorectal+cancer+metastases+and+is+strongly+enhanced+by+depletion+of+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Live attenuated Listeria monocytogenes effectively treats hepatic colorectal cancer metastases and is strongly enhanced by depletion of regulatory T cells.</a> Cancer research. 67, 10058-10066 (2007).</li>
<li>Olino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+antigen+expressing+Listeria+monocytogenes+induces+effective+primary+and+memory+T-cell+responses+against+hepatic+colorectal+cancer+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+surgical+oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated antigen expressing Listeria monocytogenes induces effective primary and memory T-cell responses against hepatic colorectal cancer metastases.</a> Annals of surgical oncology. 19, Suppl 3. 597-607 (2012).</li>
<li>Hingorani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trp53R172H+and+KrasG12D+cooperate+to+promote+chromosomal+instability+and+widely+metastatic+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice.</a> Cancer cell. 7, 469-483 (2005).</li>
<li>Marion, A., Aoudi, W., Basarab, A., Delachartre, P., Vray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+evaluation+in+high-frequency%2C+40+MHz+imaging%3A+a+comparative+study+of+four+vector+velocity+estimation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasonics%22%5BJournal%5D)">Blood flow evaluation in high-frequency, 40 MHz imaging: a comparative study of four vector velocity estimation methods.</a> Ultrasonics. 50, 683-690 (2010).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+23+phosphorylation-dependent+cell-surface+localization+of+annexin+A2+is+required+for+invasion+and+metastases+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Tyrosine 23 phosphorylation-dependent cell-surface localization of annexin A2 is required for invasion and metastases of pancreatic cancer.</a> PloS one. 6, e19390(2011).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêt pertinent de divulguer.

Ce modèle murin préclinique de la métastase du cancer du pancréas dans le foie via une technique d&#39;injection de hemispleen est le premier modèle qui reflète décrit un grand nombre de conditions cliniques et immunologiques de patients ayant une maladie métastatique au foie. Ce modèle offre plusieurs avantages par rapport à d&#39;autres modèles murins. Tout d&#39;abord, à la différence des modèles transgéniques de cancer du pancréas, dans lequel seulement 30% des souris développent des métastases vers le foie et le mo...

Canalaire pancréatique adénocarcinome (PDA) est la quatrième cause de décès liés au cancer aux États-Unis 1. La survie à cinq ans pour les patients atteints de PDA métastatique est 2-12% 1. Bien que la chimiothérapie adjuvante et néoadjuvante pour cancer du pancréas est plus efficace que jamais, il reste encore un besoin désespéré de nouvelles thérapies. Le développement de nouveaux produits thérapeutiques requiert des modèles animaux précliniques fiables. Bien que les modèles de tumeurs sous-cutanées sont simples à utiliser, les inconvénients comprennent l&#39;incapacité de ces tumeurs et de métastases imiter la progression de la tumeur et des microenvironnements vu dans les cancers humains. Des modèles génétiquement modifiés, tels que la souris transgénique contenant Kras et p53 knock-in mutations oncogéniques (le modèle KPC) 2 et le modèle KPC avec une lignée traceur YFP (le modèle de PKCY) 3 permettent l&#39;étude des tumeurs d&#39;origine naturelle dans immunocompetesouris NT. En outre, le micro-environnement de la tumeur n&#39;est pas modifiée et ressemble plus étroitement à celle observée dans la progression tumorale humaine. Malheureusement, le calendrier de développement de la tumeur est variable dans ces modèles, ce qui rend difficile l&#39;étude de thérapies expérimentales. En outre, le rétrocroisement de ces souris nécessite une quantité importante de temps et d&#39;engagement financier, qui n&#39;est pas toujours possible. Enfin, les modèles de xénogreffe de souris implantées PDA nécessitent du souris, qui ont modifié ou micro-environnements tumoraux absents immunodéprimés. Par conséquent, l&#39;efficacité des thérapies expérimentales démontré dans plusieurs modèles précliniques sont souvent pas reproductible dans quatre essais cliniques humains. Ce modèle de souris de hemisplenectomy utilise des cellules tumorales qui sont Panc02, une lignée cellulaire de tumeur hautement tumorigène induit par le méthylcholanthrène pancréatique provenant de souris C57BL / 6 5, 6. En outre, d&#39;autres lignées cellulaires murines PDA dérivées de la micro KPCe peut être utilisé dans ce modèle. Schulick et al. Ont déjà mis au point une technique de hemisplenectomy et créé un modèle de souris syngéniques de métastases du cancer du côlon 7. Ce modèle de hemisplenectomy (figure 1) offre inoculation de la tumeur cohérent et égal chez les souris immunocompétentes se prêtant à la recherche de nouveaux agents thérapeutiques 7-10.

<table><tbody><tr><td>Les milieux de culture cellulaire et les composants</td><td></td><td></td><td>varient en fonction de la lignée cellulaire</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 15 ml</td><td></td> Ciseaux opératoires <td>incurvés Corning</td> 430052 <td></td></tr><tr><td></td><td>Surgical Store Roboz Surgical Store</td><td>RS-6835</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissection Graefe Forceps</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-5130</td><td></td></tr><tr><td>Porte-aiguille (régulier)</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td></td><td></td> 3-0 ou 4-0 <td>avec l’aimable autorisation du département de chirurgie, Johns Hopkins</td></tr><tr><td>Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, petit, coudé</td><td>Teleflex</td><td>137085</td><td></td></tr><tr><td>Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, moyen, coudé</td><td></td><td>Teleflex 237115</td><td></td></tr><tr><td>Weck Horizon medium clips ligaturants</td><td>Teleflex</td><td>002200</td><td></td></tr><tr><td>Weck Horizon petits clips ligaturants</td><td>Teleflex</td><td>001200</td><td></td></tr><tr><td>Seringue, 1 cc, seringue tb, embout coulissant 3/8 »</td><td>Becton Dickinson</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>seringue, 1 cc, seringue tb, embout coulissant 5/8 »</td><td>Becton Dickinson</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>9 mm Applicateur autoclip</td><td>Mikron</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>9 mm Autoclip</td><td>Becton Dickinson</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Sunbeam</td><td>CAT93</td><td></td></tr><tr><td>70 % Ethanol</td><td></td><td></td><td>vendu par de nombreux vendeurs Chlorhydrate</td></tr><tr><td>de kétamine&nbsp ;</td><td>Hospira</td><td>22395DD</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de xylazine</td><td>Sigma</td><td>X1251</td><td></td></tr></tbody></table>

un préclinique modèle murin de métastases hépatiques

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

De nombreux modèles murins ont été développées pour étudier les cancers humains et de faire progresser la compréhension du traitement du cancer et le développement. Ici, un modèle préclinique murin pancréas tumeur des métastases hépatiques par une injection de cellules syngéniques de hemispleen tumorales pancréatiques de souris est décrit. Ce modèle imite un grand nombre de conditions cliniques chez les patients ayant une maladie métastatique au foie. Souris développent constamment des métastases dans le foie qui permet d&#39;observer le processus métastatique, les essais de thérapie expérimentale, et la recherche en immunologie tumorale.

Cellules tumorales Panc02 injectés dans le hemispleen (figure 1) des métastases hépatiques en forme 100% des souris, alors que pulmonaires et péritonéales métastases ne sont pas respectées, même si la technique est réalisée correctement. Cette technique a été effectuée sur plus d&#39;une centaine de souris en utilisant des cellules Panc02 dans plusieurs expériences indépendantes, et reproductible, toutes les souris non traitées meurent de métastases hépatiques entre 30 et 60 jours après la procédure de ...

Un modèle murin de métastases hépatiques préclinique réalisée par une technique d&#39;injection de hemispleen.

Un préclinique modèle murin de métastases hépatiques

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

L'objectif général de cette procédure est de créer un modèle préclinique de métastases hépatiques du cancer du pancréas par la technique de la demi-rate. Cela est réalisé en premier lieu en préparant une suspension monocellulaire de cellules tumorales pan O2 cultivées. La deuxième étape de la procédure consiste à exposer et diviser la rate d'une souris entièrement anesthésiée.Les étapes suivantes consistent à injecter des cellules tumorales dans une moitié de rate (hémisplène) et à retirer l'hémisplène injecté. L'étape finale consiste à fermer l'abdomen et à réveiller la souris de l'anesthésie. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus afin de montrer les différences dans la progression de la maladie métastatique en surveillant la survie, suivie d'une nécropsie du foie et d'examens d'imagerie non invasifs supplémentaires.Ces techniques peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le cancer, telles que l'identification de facteurs essentiels dans le processus métastatique, l'évaluation de nouveaux agents thérapeutiques et la réalisation de recherches en immunologie tumorale. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie

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