Préparation, imagerie, et la quantification de la surface bactérienne motilité dosages

La motilité de l’essaimage est influencée par des facteurs physiques et environnementaux. Nous décrivons un protocole en deux phases et des lignes directrices pour contourner les défis généralement associés à la préparation des essais en essaim et à la collecte de données. Une technique d’imagerie macroscopique est utilisée pour obtenir des informations détaillées sur le comportement de l’essaim qui ne sont pas fournies par les techniques d’analyse actuelles.

L’objectif global de cette procédure est de visualiser et de quantifier la motilité de surface bactérienne appelée essaimage de manière standard et reproductible. Ceci est accompli en préparant et en durcissant d’abord les plaques de motilité de surface. La deuxième étape consiste à inoculer les plaques de test de motilité de surface avec des bactéries et à incuber ces plaques dans un environnement contrôlé.

Ensuite, les modèles de croissance bactérienne sur les dosages sur plaque sont imagés en temps réel. La dernière étape de la procédure consiste à traiter les images pour la quantification. En fin de compte, cette procédure fournit un protocole standardisé pour la préparation du test de motilité de surface afin de générer des informations dynamiques quantitatives telles que le taux d’expansion de l’essaim ou la distribution de la densité du bioproduit pour les bactéries modales de surface.

De nombreux groupes effectuent des tests de motilité de surface. Le principal avantage de cette technique est que nous fournissons un protocole systématique qui minimise les multiples variables qui peuvent conduire à des incohérences. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la motilité de surface bactérienne, comme la façon dont les bactéries colonisent différents types de surfaces.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la motilité de l’essaimage des pseudomonas avec quelques modifications, elle peut également être appliquée pour étudier d’autres bactéries modales de surface. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés car de petits changements dans le protocole ou l’environnement de laboratoire peuvent grandement influencer les résultats des tests en essaim. La démonstration de la procédure sera assurée par Morgan, un étudiant diplômé de mon laboratoire.

Pour commencer le protocole, préparez un mélange agricole en combinant 200 millilitres de milieu d’essaim de sulfate d’ammonium moins FAB, 0,9 gramme d’agar noble et 0,2 gramme d’acides de caïno dans une bouteille de milieu de 500 millilitres. À l’aide d’une plaque à mélanger, mélangez soigneusement le média. Ensuite, stérilisez le milieu dans un autoclave réglé à 121,1 degrés Celsius pendant 22 minutes avec une option d’évacuation rapide.

Immédiatement après la stérilisation, serrez le bouchon de la bouteille de média pour éviter l’évaporation de l’eau. Placez le support sur une plaque d’agitation magnétique et refroidissez le DAE à 50 degrés Celsius dans un environnement à température ambiante avec agitation active. Si la gélose doit être utilisée à un moment expérimental ultérieur, elle peut être maintenue au chaud dans un bain-marie à 60 degrés Celsius ou dans un incubateur pendant 15 heures sans agitation active.

Lorsque le milieu atteint environ 50 degrés Celsius à deux millilitres de glucose stérilisé par filtre, en utilisant des techniques stériles standard, mélangez soigneusement avec la barre d’agitation magnétique pour éviter la formation de bulles dans le média. Dans une hotte, utilisez une pipette sérologique stérile pour aliquote 7,5 millilitres de l’edia dans des boîtes de Pétri individuelles de 60 millimètres. Si une plus grande surface d’essaimage est souhaitée, aliquote 25 litres d’edia dans des boîtes de Pétri de 100 millimètres.

Laissez tous les plats non empilés et vérifiez la hotte avec un niveau d’œil de bœuf pour assurer une surface horizontale uniforme sur laquelle la gélose peut se solidifier. Pour les plaques de 60 millimètres, mettez de côté les couvercles des plats et faites durcir la gélose découverte dans la hotte pendant 30 minutes. Les boîtes plus grandes de 100 millimètres nécessiteront un temps de durcissement plus long.

L’humidité, le débit d’air et la température d’un laboratoire donné peuvent nécessiter de tester le temps de durcissement pour un essaimage optimal de votre bactérie. Après le séchage, les APL doivent être immédiatement inoculées avec des cellules qui ont été pré-cultivées séparément pour la phase de croissance souhaitée. Pour commencer, prélevez une colonie bactérienne isolée dans une plaque LB fraîche et inocuculez-la dans six millilitres de culture. Média.

Incuber la culture pendant la nuit à 37 degrés Celsius en secouant horizontalement. Le lendemain, inoculez un à cinq microlitres de la culture de nuit sur les plaques de gélose en essaim séchées en piquant la surface de la gélose avec un cure-dent stérile ou une aiguille d’inoculation en fil, selon la souche bactérienne, transférez les plaques de test en essaim dans un incubateur avec une température réglée à 30 degrés Celsius, 37 degrés Celsius, ou 42 degrés Celsius. Inversez les plaques de manière à ce que l’excès d’humidité se condense sur le couvercle de la plaque et non sur la gélose, équilibrez les bactéries à des températures spécifiques à la souche pendant deux ou quatre heures juste avant l’imagerie en accéléré.

Ensuite, transférez les plaques dans l’unité d’imagerie in vivo de sorte que les bactéries à la surface agricole soient orientées vers le bas vers la caméra inversée de l’unité. Remplissez tous les couvercles de boîtes de Pétri avec une petite quantité d’eau. Placez ensuite chaque couvercle avec le côté de l’eau vers le haut sur les plaques AER inversées.

À l’intérieur de l’unité d’imagerie, scellez le boîtier d’imagerie pour maintenir un niveau d’humidité constant, ajustez les paramètres d’imagerie de l’unité d’imagerie et commencez l’imagerie en accéléré de l’activité d’essaimage. Après l’imagerie en temps réel, la dynamique d’essaimage des bactéries peut être analysée à l’aide d’une analyse d’image standard telle que l’image J dans une expérience de motilité de surface. Le dosage de la teneur en humidité de la gélose juste avant l’inoculation est crucial pour obtenir des résultats d’essaimage réussis.

De manière optimale, les plaques AER faciliteront un point d’inoculation serré et amélioreront l’activité d’essaimage bactérien, tandis que les plaques trop séchées supprimeront la motilité de surface en plus de la teneur en humidité, la présence ou l’absence d’additifs de milieu peut également affecter l’activité d’essaimage des bactéries en fonction de la température d’incubation en utilisant des souches bactériennes, exprimant la luminescence ou les protéines fluorescentes. La dynamique de compétition en essaimage entre deux espèces de bactéries différentes peut être capturée dans une vidéo en accéléré. De plus, les changements dans la densité cellulaire locale et le taux de biosynthèse des lipides favorisant la mobilité au sein de l’essaim de bactéries peuvent également être déterminés et quantifiés par microscopie fluorescente à intervalle de temps.

En suivant cette procédure. D’autres méthodes telles que la microscopie confocale peuvent être employées afin de répondre à des questions sur le comportement cellulaire individuel afin de générer une analyse détaillée, microscopique et microscopique de la motilité de surface bactérienne. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un essai d’essaim standard et reproductible et d’obtenir une analyse complète de la motilité de surface bactérienne en préparant, en durcissant et en inoculant des tests de motilité de surface, puis en traitant et en analysant le résultat dans des modèles de croissance bactérienne.