Name: LIRM fonctionnelle optogénétiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Découvrez l'IRM fonctionnelle optogénétique pour cartographier les circuits neuronaux avec spécificité cellulaire dans le cerveau vivant. Cette méthode combine stimulation optogénétique et imagerie haute résolution.

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Ce travail a été soutenu par le financement du NIH/NIBIB R00 Award (4R00EB008738), de l’Okawa Foundation Research Grant Award, du NIH Director’s New Innovator Award (1DP2OD007265), du NSF CAREER Award (1056008) et de la Alfred P. Sloan Foundation Research Fellowship. J.H.L. tient à remercier Karl Deisseroth pour avoir fourni les plasmides d’ADN utilisés pour les expériences optogénétiques. Les auteurs tiennent également à remercier Andrew Weitz et Mankin Choy pour l’édition du manuscrit et tous les membres du Lee Lab pour leur aide dans les expériences d’IRM.

<ol><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+local+fMRI+signals+driven+by+neurons+defined+optogenetically+by+type+and+wiring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global and local fMRI signals driven by neurons defined optogenetically by type and wiring.</a> Nature. 465 (7299), 788-792 (2010).</li>
<li>Weitz, A. J., Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+with+optogenetic+functional+MRI+and+its+translational+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Neurol%22%5BJournal%5D)">Progress with optogenetic functional MRI and its translational implications.</a> Future Neurol. 8 (6), 691-700 (2013).</li>
<li>Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Informing+brain+connectivity+with+optogenetic+functional+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Informing brain connectivity with optogenetic functional magnetic resonance imaging.</a> NeuroImage. 62 (4), 2244-2249 (2012).</li>
<li>Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+Activity+Across+the+Whole+Brain+Neural+Network+with+Optogenetic+Functional+Magnetic+Resonance+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neuroinform%22%5BJournal%5D)">Tracing Activity Across the Whole Brain Neural Network with Optogenetic Functional Magnetic Resonance Imaging.</a> Front. Neuroinform. 5 (October), 1-7 (2011).</li>
<li>Kahn, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Functional+MRI+Response+Temporal+Linearity+via+Optical+Control+of+Neocortical+Pyramidal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Functional MRI Response Temporal Linearity via Optical Control of Neocortical Pyramidal Neurons.</a> J. Neurosci. 31 (42), 15086-15091 (2011).</li>
<li>Takata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+Activation+of+CA1+Pyramidal+Neurons+at+the+Dorsal+and+Ventral+Hippocampus+Evokes+Distinct+Brain-Wide+Responses+Revealed+by+Mouse+fMRI%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Optogenetic Activation of CA1 Pyramidal Neurons at the Dorsal and Ventral Hippocampus Evokes Distinct Brain-Wide Responses Revealed by Mouse fMRI.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0121417(2015).</li>
<li>Iordanova, B., Vazquez, A. L., Poplawsky, A. J., Fukuda, M., Kim, S. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+and+hemodynamic+responses+to+optogenetic+and+sensory+stimulation+in+the+rat+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Neural and hemodynamic responses to optogenetic and sensory stimulation in the rat somatosensory cortex.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 35 (6), 922-932 (2015).</li>
<li>Weitz, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+fMRI+reveals+distinct%2C+frequency-dependent+networks+recruited+by+dorsal+and+intermediate+hippocampus+stimulations%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Optogenetic fMRI reveals distinct, frequency-dependent networks recruited by dorsal and intermediate hippocampus stimulations.</a> NeuroImage. 107, 229-241 (2015).</li>
<li>Desai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+brain+networks+in+awake+mice+using+combined+optical+neural+control+and+fMRI%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Mapping brain networks in awake mice using combined optical neural control and fMRI.</a> J. Neurophysiol. 105 (December 2010), 1393-1405 (2011).</li>
<li>Liang, Z., Watson, G. D. R., Alloway, K. D., Lee, G., Neuberger, T., Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+functional+network+of+medial+prefrontal+cortex+by+combining+optogenetics+and+fMRI+in+awake+rats%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Mapping the functional network of medial prefrontal cortex by combining optogenetics and fMRI in awake rats.</a> NeuroImage. 117 (0), 114-123 (2015).</li>
<li>Byers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+in+vivo+assessment+of+human+stem+cell+graft-host+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Direct in vivo assessment of human stem cell graft-host neural circuits.</a> NeuroImage. 114 (0), 328-337 (2015).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Carter, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+arousal+with+optogenetic+modulation+of+locus+coeruleus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons.</a> Nat. Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).</li>
<li>Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2+and+optical+control+of+excitable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells.</a> Nat. Methods. 3 (10), 785-792 (2006).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat. Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li>
<li>Ogawa, S., Lee, T. M., Kay, A. R., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+magnetic+resonance+imaging+with+contrast+dependent+on+blood+oxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Brain magnetic resonance imaging with contrast dependent on blood oxygenation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (24), 9868-9872 (1990).</li>
<li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+signal+changes+accompanying+sensory+stimulation%3A+functional+brain+mapping+with+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intrinsic signal changes accompanying sensory stimulation: functional brain mapping with magnetic resonance imaging.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5951-5955 (1992).</li>
<li>Kwong, K. K., Belliveau, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+magnetic+resonance+imaging+of+human+brain+activity+during+primary+sensory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic magnetic resonance imaging of human brain activity during primary sensory stimulation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5675-5679 (1992).</li>
<li>Canals, S., Beyerlein, M., Murayama, Y., Logothetis, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+stimulation+fMRI+of+the+perforant+pathway+to+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Electric stimulation fMRI of the perforant pathway to the rat hippocampus.</a> Magn. Reson. Imaging. 26, 978-986 (2008).</li>
<li>Antal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+artifacts+induced+by+electrical+stimulation+during+conventional+fMRI+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Imaging artifacts induced by electrical stimulation during conventional fMRI of the brain.</a> NeuroImage. 85 (3), (2014).</li>
<li>Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ReaChR%3A+a+red-shifted+variant+of+channelrhodopsin+enables+deep+transcranial+optogenetic+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation.</a> Nat. Neurosci. 16 (10), 1499-1508 (2013).</li>
<li>Christie, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRI+response+to+blue+light+delivery+in+the+na%C3%AFve+brain%3A+Implications+for+combined+optogenetic+fMRI+studies%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">FMRI response to blue light delivery in the naïve brain: Implications for combined optogenetic fMRI studies.</a> NeuroImage. 66, 634-641 (2013).</li>
<li>Aravanis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+neural+interface%3A+in+vivo+control+of+rodent+motor+cortex+with+integrated+fiberoptic+and+optogenetic+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology.</a> J. Neural Eng. 4, S143-S156 (2007).</li>
<li>Pashaie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+brain+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Optogenetic brain interfaces.</a> IEEE Rev. Biomed. Eng. 7, 3-30 (2014).</li>
<li>Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+deconstruction+of+parkinsonian+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry.</a> Science. 324, 354-359 (2009).</li>
<li>Rivard, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+intubation+and+ventilation+for+surgical+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Surg%22%5BJournal%5D)">Rat intubation and ventilation for surgical research.</a> J. Invest. Surg. 19, 267-274 (2006).</li>
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<li>Kim, D. H., Adalsteinsson, E., Spielman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+analytic+variable+density+spiral+design%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Simple analytic variable density spiral design.</a> Magn. Reson. Med. 50, 214-219 (2003).</li>
<li>Friston, K. J., Harrison, L., Penny, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+causal+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Dynamic causal modeling.</a> Neuroimage. 19, 1273-1302 (2003).</li>
<li>Alkire, M. T., McReynolds, J. R., Hahn, E. L., Trivedi, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamic+microinjection+of+nicotine+reverses+sevoflurane-induced+loss+of+righting+reflex+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Thalamic microinjection of nicotine reverses sevoflurane-induced loss of righting reflex in the rat.</a> Anesthesiology. 107 (2), 264-272 (2007).</li>
<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Mol. Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li>
<li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Transduction+Efficiency%2C+Tropism+and+Axonal+Transport+of+AAV+Serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+8+and+9+in+the+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Analysis of Transduction Efficiency, Tropism and Axonal Transport of AAV Serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the Mouse Brain.</a> PLoS ONE. 8 (9), 1-16 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency-selective+control+of+cortical+and+subcortical+networks+by+central+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Frequency-selective control of cortical and subcortical networks by central thalamus.</a> eLife. 4, e09215(2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Mouvement du sujet lors de l&#39;imagerie est une source importante d&#39;artefact qui peut conduire à la corruption de données. assurer de manière appropriée l&#39;animal sur le berceau d&#39;imagerie peut minimiser ces artefacts comme on le maintien des niveaux d&#39;anesthésie appropriés. Ici, nous avons utilisé l&#39;isoflurane, mais anesthésiques alternatifs, tels que la médétomidine ou la kétamine et xylazine, devraient également être considérés. Cependant, les niveaux et les choix d&#39;anesthésique peuvent influencer de nombreux paramètres dans le cerveau, y compris la réponse GRASSE 28. L&#39; isoflurane peut provoquer des changements dans l&#39; excitabilité neuronale 29. D&#39; autres anesthésiques peuvent également affecter GABA inhibition synaptique 30. Ainsi, le choix de l&#39;anesthésie est important lors de l&#39;exécution ofMRI compte tenu de sa capacité d&#39;influer sur l&#39;activité neuronale. ofMRI en l&#39;absence d&#39;anesthésie est possible, mais peut être difficile à une augmentation de mouvement de l&#39;animal, qui peut être réduit si l&#39;animal est habitué; ces études se réveillent ofMRI ont déjà été réalisées unnd éviterait l&#39;effet confusionnel de l&#39; anesthésie sur le cerveau 9,10. Post-traitement des algorithmes de correction de mouvement peuvent être utilisés pour atténuer fortement les effets du mouvement. Plusieurs de ces méthodes existent, y compris l&#39;inverse algorithme de Gauss-Newton employé dans ce protocole, ce qui minimise la somme des carrés fonction des coûts de l&#39;image de référence et de l&#39;image sous-correction. L&#39;algorithme est utile car elle permet une correction de mouvement rapide et robuste, en utilisant une conception de plate - forme parallèle du GPU pour réduire les délais de traitement 27. Pour la reconstruction de données dans ce protocole, le logiciel personnalisé écrit dans un environnement MATLAB a été utilisé pour la reconstruction du maillage en deux dimensions, où les échantillons en spirale sont reconstruits dans l&#39; espace k en images quadrillées 31-33. les données de séries temporelles ont été générées en calculant le pour cent modulation du signal BOLD de chaque voxel par rapport à la période de référence ont été recueillies avant la stimulation. Voxels dont les séries chronologiques ont été synchronisée à des blocs de stimulation optogenetic d&#39;une valeur de cohérence de 0,35 ou plus ont été définis comme des voxels activés; cette valeur de cohérence correspond à une valeur inférieure à 10 -9 P 8. Les valeurs de cohérence ont été calculées à l&#39;amplitude de la transformée de Fourier à la fréquence de cycles de stimulation répétées divisé par les carrés de somme de toutes les composantes de fréquence 8,27. erreur de l&#39;peut être contrôlé à l&#39;aide de la correction de Bonferroni pour les comparaisons multiples. D&#39;autres méthodes d&#39;analyse peuvent être utilisés, y compris les tests statistiques paramétriques tels que les modèles linéaires généraux (MLG). La méthode de cohérence exige une connaissance moins avant du FRH par rapport au modèle linéaire général classique. Par conséquent, il est avantageux lors de l&#39;exploration des données en utilisant ofMRI. Cependant, la méthode de cohérence ne peut être utilisé pour les données avec des dessins de blocs ou sélectionné des dessins liés à l&#39;événement avec un fixe interstimulus intervalle et ne peuvent être utilisées dans les données ofMRI avec d&#39;autres événements related conçoit ou dessins mixtes. Par la suite, la modélisation dynamique de causalité (DCM) peut être utilisé pour analyser les interactions entre les régions cérébrales identifiées par ofMRI. DCM est une technique statistique bayésienne développé pour l&#39; analyse de la connectivité fonctionnelle des réponses du système aux entrées expérimentales pendant IRMf 34. préoccupations techniques supplémentaires pour les ofMRI sont discutés ici. Les implants peuvent être endommagés ou tombent, ce qui conduit à l&#39;élimination de l&#39;animal atteint de l&#39;étude. chirurgies Re-implantation ne sont pas recommandés en raison de l&#39;incertitude supplémentaire de cibler le même retour sur investissement dans la chirurgie d&#39;implantation originale et en raison de problèmes de protection des animaux. En raison de la quantité importante de temps et les ressources investis dans chaque sujet animal, l&#39;examen de la résistance du matériau est une préoccupation importante lors du choix d&#39;un ciment dentaire adapté pour une utilisation dans les études ofMRI. La chirurgie d&#39;implantation est un facteur critique pour maximiser la longévité du IMPLANt et sujet animal. Par exemple, faire en sorte que le crâne est sec avant d&#39;appliquer le ciment dentaire et en plaçant une quantité suffisante de ciment autour de l&#39;implant de virole en céramique peut assurer sur la stabilité de long mois potentiel chronologie de l&#39;animal pendant l&#39;étude. En outre, les conceptions de cages alternatives peuvent être explorées et discutées avec le centre de protection des animaux pour éviter des cages avec des sommets de fil de maintien de la nourriture et de l&#39;eau qui dépassent souvent dans la cage et offrir des possibilités pour l&#39;animal d&#39;endommager l&#39;implant. Fait important, le ciment dentaire doit être choisi avec soin pour réduire les artefacts d&#39;imagerie et qui affectent les ciments alternatifs peuvent être testés par application sur un fantôme et l&#39;imagerie dans un scanner avant de les utiliser dans des expériences sur des animaux. Essai et erreur avec divers ciments dentaires a montré que le ciment utilisé dans ce protocole donne relativement peu d&#39;artefacts. Un autre défi technique dans l&#39;exécution de ofMRI est la précision du placement de la fibre optique au ROI prévu, compte tenu de l&#39;extremely faibles distances qui peuvent exister entre les noyaux 35 dans le cerveau. Après avoir terminé les chirurgies d&#39;implantation, les analyses anatomiques T2 peuvent être utilisés pour déterminer le placement correct en superposant sur un atlas du cerveau. La compétence du chirurgien et de la pratique d&#39;effectuer ces chirurgies peut améliorer les taux de placement corrects. La spécificité et l&#39;expression du opsin au ROI prévu peuvent être vérifiées à l&#39;issue de l&#39;étude de perfuser l&#39;animal et fixant le cerveau, en utilisant l&#39;immunohistochimie ou la fluorescence endogène d&#39;une protéine rapporteur marqué à l&#39;opsine pour la visualisation. Ces protéines rapporteuses peuvent également être colocalisées avec d&#39; autres protéines pour assurer que le opsine est exprimé dans les types de cellules neurales souhaitées 1,8,15,25. Comme mentionné précédemment, les artefacts peuvent survenir lors de l&#39; exécution ofMRI en raison de l&#39; échauffement des tissus de la livraison de lumière 22. Le chauffage des tissus provoque une modification des temps de relaxation, résultant en faux signal BOLD. Pour veiller à ce que cativation résultant de la stimulation lumineuse pendant ofMRI est pas due à cet artefact, les contrôles opsin négatifs doivent être effectués dans laquelle une solution saline injectée animaux ou des animaux injectés avec des vecteurs de contrôle fluorophores (comme AAV-CaMKIIa-EYFP) subissent ofMRI. En outre, la fibre seulement bien construit implants optiques avec une bonne efficacité de transmission de la lumière devraient être utilisés pour éliminer la nécessité d&#39;utiliser des puissances laser élevées. Des études ont été réalisées ofMRI dans lequel fausse activation due à l&#39; échauffement des tissus n&#39;a pas été un problème 1,6-8,10,11. En ce qui concerne le choix du vecteur pour introduire les gènes optogénétiques requis dans les neurones pour l&#39;expression, les AAV ne sont pas connus pour provoquer des maladies chez l&#39;homme et sont donc une option pratique, compte tenu du niveau de biosécurité inférieur requis pour utiliser ces agents (BSL-1). En outre, une multitude de noyaux de vecteurs AAV transporter emballés avec divers gènes optogénétiques en stock et avec plusieurs sérotypes. Le sérotype de AAV doit être choisi belon sur la cible de la population de cellules destinées à assurer des niveaux d&#39;expression optimaux 36,37. Les lentivirus peuvent également être utilisés, mais exigent un niveau plus élevé de biosécurité. La période de temps requise pour une expression suffisante des gènes optogénétiques est variable en fonction du modèle animal spécifique utilisé, de l&#39;AAV particulier utilisé et sur le paradigme expérimental spécifique. Dans ce protocole, les rats Sprague Dawley à l&#39;âge de 11 semaines sont utilisées et les études optogénétiques commencent quatre à six semaines après l&#39;injection de virus. Des souris transgéniques peuvent également être utilisées dans des études optogénétiques. Il est nécessaire d&#39;effectuer des expériences pilotes pour déterminer la quantité de temps spécifique requis pour une expression suffisante des opsins. paradigmes de stimulation peut varier en fonction de l&#39;opsine spécifique utilisé. Dans ce protocole, AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP est utilisé et le paradigme de stimulation est de 20 sec sur / 40 sec off. Si vous utilisez un SSFO, le paradigme de stimulation varie parce que le SSFO exige seulement une brève impulsion de lumière pour être actionné puis une brève impulsion de lumière à une autre longueur d&#39;onde pour mettre fin. Une préoccupation essentielle supplémentaire lors de l&#39;exécution ofMRI empêche les fuites de lumière à partir de l&#39;interface de l&#39;implant de la virole avec le câble de raccordement de fibre optique lors de la stimulation optogenetic pour empêcher un signal du cerveau de confusion provenant de la stimulation visuelle, même lorsque l&#39;animal est anesthésié. Cônes de ruban électrique noir peuvent être utilisés pour bloquer la lumière des viroles et pour couvrir les yeux de l&#39;animal. Fait important, les valeurs physiologiques , y compris expiratoire CO 2 et la température du corps du sujet doivent être bien entretenus pendant toute la durée de l&#39;imagerie. CO expiratoire 2 doit être maintenue entre 3 - 4% et la température du corps à 37 ° C. En outre, les séquences de calage afin de réduire autant que possible l&#39;inhomogénéité du champ magnétique avant le démarrage ofMRI balaye fortement détermine la qualité des données résultantes BOLD. Le contrôle de ces facteursest essentiel dans la production de données fiables ofMRI. Dans ce protocole, les lasers à SSAD sont utilisés comme source de lumière pour la stimulation optogenetic. Parce que la lumière laser est cohérente, plus qu&#39;assez de puissance peut être facilement fournie par la fibre optique. sources de lumière LED couplées à la fibre optique sont disponibles auprès de fournisseurs commerciaux, mais présentent l&#39;inconvénient d&#39;une diminution de la puissance de transmission de la lumière. La source de lumière laser nécessite l&#39;alignement à chaque câble de raccordement de fibre optique particulier, mais avec la pratique, l&#39;alignement peut être réalisé en quelques secondes à quelques minutes. Les applications futures de ofMRI comprennent l&#39;utilisation de opsins prochaine génération tels que opsins rouge décalée pour permettre la stimulation non-invasive lors de l&#39;imagerie. En outre, l&#39;implantation de l&#39;EEG compatible avec l&#39;IRM ou des électrodes d&#39;enregistrement semblables le long de l&#39;implant à fibre optique pourrait permettre l&#39;acquisition de données à haute résolution temporelle, en plus des données à haute résolution spatiale de l&#39;IRM. ofMRI avec electrophysiolenregistrement ogi pourrait fournir des informations détaillées sur la connectivité fonctionnelle du cerveau. En résumé, la puissance de ofMRI pour surveiller l&#39;ensemble du cerveau en réponse à la stimulation des populations de cellules spécifiques définies par l&#39;identité génétique ou anatomique fait ofMRI un outil essentiel à utiliser dans l&#39;étude des maladies neurologiques et des connectomique du cerveau en bonne santé.

L&#39; imagerie par résonance magnétique fonctionnelle optogénétiques (ofMRI) est une nouvelle technique qui combine la résolution spatiale de haut champ IRMf avec la précision de la stimulation optogenetic 1-11,38, permettant la cartographie spécifique de type cellulaire des circuits neuronaux fonctionnels et leur dynamique dans l&#39;ensemble cerveau. Optogenetics permet de types cellulaires spécifiques à cibler pour la stimulation par l&#39;introduction de canaux de conductance trans-membranaires, appelées opsins sensibles à la lumière. Les éléments spécifiques de circuits neuronaux sont génétiquement modifiées pour exprimer ces canaux, ce qui permet la milliseconde calendrier modulation de l&#39; activité dans le cerveau intact 1-15. IRMf fournit une méthode non-invasive de la détermination de la réponse dynamique globale du cerveau à la stimulation optogenetic des circuits neuronaux spécifiques grâce à la mesure du signal en oxygène du sang en fonction du niveau (BOLD) 16-18, qui fournit une mesure indirecte de l&#39; activité neuronale. La combinaison de ces deux techniques, appelée imagerie par résonance magnétique fonctionnelle optogenetic (ofMRI), est avantageuse par rapport à d&#39;autres méthodes de l&#39;activité cérébrale d&#39;enregistrement au cours de la stimulation tels que électrophysiologie, car il peut fournir une vue de l&#39;ensemble du cerveau à une résolution spatiale relativement élevée. Ceci permet à la détection d&#39; une activité neuronale en réponse à une stimulation ciblée sur de grandes distances à partir du site de stimulation sans qu&#39;il soit nécessaire pour l&#39; implantation d&#39;électrodes d&#39;enregistrement invasives 1-11. ofMRI est avantageuse par rapport à la méthode plus traditionnelle d&#39;effectuer la stimulation électrique pendant l&#39; IRMf, qui peut recruter différents types de cellules à proximité de l&#39;électrode et confondre l&#39;influence causale de chaque population 19 ainsi. En outre, les électrodes utilisées pour la stimulation électrique et le courant généré peut produire des artefacts lors de l&#39; IRM 20. En effet, ofMRI permet l&#39;observation de l&#39;influence sur l&#39;activité globale du cerveau de la modulati spécifiquesur une grande variété de types de cellules par l&#39;utilisation de techniques de ciblage génétique avancées telles que le système Cre-Lox chez des animaux transgéniques ou bien l&#39;utilisation de promoteurs. contrôle optique combinatoire avec une surveillance du cerveau entier est possible avec ofMRI par l&#39;utilisation de deux NPHR pour inhiber CHR2 et pour exciter des types cellulaires spécifiques. La boîte à outils de optogenetic disponibles pour une utilisation dans ofMRI améliore aussi rapidement au fil du temps avec l&#39;introduction de opsins avec sensibilité à la lumière accrue ou une cinétique améliorée, des stabilisées opsins fonction de l&#39;étape (de SSFOs) ou de opsins rouge décalé qui peut annuler l&#39;exigence de la fibre implantée optique, permettant une stimulation non-invasive lors de l&#39; imagerie 21. Ces possibilités ne sont pas disponibles avec la stimulation électrique. Cependant, les artefacts de signal résultant de l&#39; échauffement des tissus en raison de la livraison de la lumière dans le cerveau ont été rapportés 22, où a été montré la modification des temps de relaxation induite par la température pour produire pseufaire activation. Les chercheurs du spectacle ofMRI doivent donc être conscients de ce potentiel confondre. Avec la mise en place et des contrôles adéquats, le problème peut être résolu. Par ailleurs, relativement faible résolution temporelle consistant à mesurer la réponse hémodynamique à IRMf peut être un facteur limitant pour certaines applications de cette technique. Ce protocole décrit tout d&#39; abord la construction des implants de fibres optiques qui permet de fournir des longueurs d&#39; onde spécifiques de la lumière profondément dans le cerveau in vivo. Le protocole décrit ensuite la livraison du vecteur viral opsin codant pour une région du cerveau précise en utilisant la chirurgie stéréotaxique. Suivant le protocole décrit le processus de l&#39;ensemble du cerveau IRM fonctionnelle lors de la stimulation lumineuse simultanée. Enfin, le protocole décrit l&#39;analyse des données de base des données acquises. À noter, l&#39;optogénétique décrit ici nécessite un implant chronique pour la livraison de la lumière. Cependant, les implants à fibres optiques sont stables et biocompatible, permettant le balayage longitudinal et l&#39; investigation des circuits neuronaux sur une période de mois 23,24. En résumé, la stimulation précise et la capacité de surveillance du cerveau entier de ofMRI sont des facteurs cruciaux pour faire ofMRI un outil puissant pour l&#39;étude des connectomique du cerveau. En outre, il peut fournir un nouvel aperçu sur les mécanismes de maladies neurologiques 25 lorsqu&#39;il est associé aux différents modèles animaux. En effet, ofMRI a été utilisé pour élucider l&#39;activité de réseau de sous - régions de l&#39; hippocampe distincts associés à des saisies 8. Par conséquent, les laboratoires intéressés à répondre aux questions des neurosciences au niveau des systèmes trouveront cette technique d&#39;importance.

<table><tbody><tr><td>Scanner 7 Tesla</td><td>Agilent Technologies</td><td>Discovery MR901 Système</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley rats</td><td>Charles River</td><td>Crl :SD</td><td>11 semaines</td></tr><tr><td>couperet à fibre optique</td><td>Fujikura</td><td>CT-05</td><td></td></tr> fibre <tr><td>optique multimode</td><td>Thor Labs</td><td>AFS105/125Y</td><td></td></tr><tr><td>décapant de fibre&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Thor Labs</td><td>T08S13</td><td></td></tr><tr><td>manchon fendu en céramique</td><td>Precision Fiber Products</td><td>SM-CS1140S</td><td></td></tr><tr><td>colle époxy</td> Thor <td>Labs</td><td>G14250</td><td></td></tr><tr><td>applicateurs à embout en coton</td><td>Stoelting Co.</td><td>50975</td><td></td></tr><tr><td>viroles en céramique multimode en zircone</td><td>Precision Fiber Products</td><td>MM-FER2002</td><td></td></tr><tr><td>connecteur multimode FC / PC</td><td>Thor Labs</td><td>30128C3</td><td></td></tr><tr><td>disque de polissage de fibre optique</td><td>Precision Fiber Products</td><td>M1-80754</td><td></td></tr><tr><td>feuille de rodage en oxyde d’aluminium, 0.3 & micro ; m</td><td>Thor Labs</td><td>LFG03P</td><td></td></tr><tr><td>feuille de rodage en oxyde d’aluminium, 1 & micro ; m</td><td>Thor Labs</td><td>LFG1P</td><td></td></tr><tr><td>feuille de rodage en oxyde d’aluminium, 3 & micro ; m</td><td>Thor Labs</td><td>LFG3P</td><td></td></tr><tr><td>microscope biologique binoculaire 40X-1,000X</td><td>Amscope</td><td>B100</td><td></td></tr><tr><td>lunettes de sécurité laser</td><td>Kentek</td><td>KXL-62W01</td><td></td></tr><tr><td>473 nm DPSS laser</td><td>Laserglow</td><td>LRS-0473</td><td></td></tr><tr><td>594 nm DPSS laser</td><td>Laserglow</td><td>LRS-0594</td><td></td></tr><tr><td>Allen jeu</td><td></td><td></td> <td>de clés hexagonales2,0 mm (5/64") pour l’alignement de la pointe de la fibre sur le point focal du coupleur dans le wattmètre laser</td></tr><tr><td>, capteur Si, 400-1 100 nm</td><td>Thor Labs</td><td>PM121D</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (Isothesia)</td><td>Henry Schein²nbsp ;</td><td>50033</td><td></td></tr><tr><td>vaporisateur d’isoflurane avec chambre à induction</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil 100 &micro ; l seringue</td><td>World Precision Instruments</td><td>NANOFIL-100</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump avec contrôleur SYS-Micro4</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr><tr><td>générateur de fonction</td><td>A.M.P.I.&nbsp ;</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>stéréotaxe pour petits animaux</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modèle 940&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Modèle 683 ventilateur pour petits animaux&nbsp ;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>550000</td><td></td></tr><tr><td>Type 340 capnographe&nbsp ;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>733809</td><td></td></tr><tr><td>foret dentaire (kit de micromoteur rotatif)</td><td>Foredom Electric Co.</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>pommade ophtalmique (larmes artificielles)</td><td>Rugby</td><td>00536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>stérilisateur d’instrument</td><td>CellPoint Scientific</td><td>Germinator 500</td><td>stérilisateur à billes</td></tr><tr><td>de verre antibiotique en poudre</td><td>Pfizer</td><td>NEO-PREDEF sulfate de</td><td>néomycine, acétate d’isofluprédone et chlorhydrate de tétracaïne</td></tr><tr><td>buprénorphine analgésique</td><td>Hospira</td><td>NDC:0409-2012</td><td>substance contrôlée de l’annexe III, 0,3 mg/ml stock</td></tr></tbody></table>

l&#39;irm fonctionnelle optogénétiques

Optogenetic Functional MRI

L’étude de la connectivité fonctionnelle de circuits neuronaux précis dans l’ensemble du cerveau intact peut être réalisée grâce à l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle optogénétique (IRMo), qui est une nouvelle technique qui combine la résolution spatiale relativement élevée de l’IRMf à haut champ avec la précision de la stimulation optogénétique. Les fibres optiques qui permettent de délivrer des longueurs d’onde spécifiques de lumière profondément dans le cerveau in vivo sont implantées dans des régions d’intérêt afin de stimuler spécifiquement des types de cellules ciblées qui ont été génétiquement induites à exprimer des canaux de conductance transmembranaire sensibles à la lumière, appelés opsines. L’IRMf est utilisée pour fournir une méthode non invasive de détermination de la réponse dynamique globale du cerveau à la stimulation optogénétique de circuits neuronaux spécifiques par la mesure du signal dépendant du niveau d’oxygène dans le sang (BOLD), qui fournit une mesure indirecte de l’activité neuronale. Ce protocole décrit la construction d’implants à fibres optiques, les chirurgies d’implantation, l’imagerie avec photostimulation et l’analyse des données nécessaires à la réalisation réussie de l’IRM. En résumé, la stimulation précise et la capacité de surveillance de l’ensemble du cerveau de l’IRMf sont des facteurs cruciaux pour faire de l’IRM un outil puissant pour l’étude de la connectomique du cerveau dans les états sains et malades.

<html> Les figures 1 et 2 montrent des données représentatives résultant de 20 Hz (15 ms de largeur d&#39;impulsion, 473 nm, le rapport cyclique de 30%) , la stimulation optogenetic du cortex moteur. Un paradigme de stimulation de 30 secondes de référence suivie par 20 secondes sur / 40 sec éteint pendant six minutes a été utilisé. Des études antérieures ont montré que ce modèle de signal produit solide GRASSE de 1,8 optogenetic stimulation. La figure 1 montre les voxels activés détectée à la fois sur le site local de la stimulation (cortex moteur) et dans le thalamus, en raison de la longue portée des connexions synaptiques entre ces régions. la figure 2 montre que l&#39; information temporelle peut être glanée à partir HRF, car la réponse est retardée thalamique (pente initiale plus faible) par rapport à la réponse du cortex moteur après stimulation optogenetic. p_upload / 53346 / 53346fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Activation Plan de BOLD Signal induite par optogénétiques Stimulation de CaMKIIa exprimant des cellules dans Motor Cortex. Valeurs de cohérence des voxels actifs, identifiés comme étant ceux de manière significative synchronisée aux stimulations répétées, sont montrées superposées sur une tranche coronale anatomique pondérée en T2. Les données recueillies sur un six min, 30 période de sec (initial de référence de 30 secondes et six stimulation cycles de 20 sec sur / 40 sec au large avec 473 nm de lumière, 20 Hz, 15 msec largeur d&#39;impulsion) sont condensés en une seule carte d&#39;activation. Tranches séquentielles sont de 0,5 mm de distance et l&#39;emplacement de l&#39;implant à fibre optique est désignée par le triangle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53346/53346fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53346/53346fig2.jpg" /> <strong&gt; Figure Fonction 2. Réponse hémodynamique. (gauche) Le pour cent de modulation du signal BOLD par rapport à la ligne de base est indiquée pour voxels actifs dans le cortex moteur et thalamus pendant la stimulation optogenetic du cortex moteur (six cycles de stimulation de 20 s sur / 40 sec off avec 473 nm de lumière, 20 Hz, 15 msec largeur d&#39;impulsion). barres d&#39;erreur gris ombrés indiquent l&#39;erreur standard sur voxels activés au sein de ROI. (Droit) Réponses moyennes temporelles sont données par les fonctions de réponse hémodynamique (FRH). Thalamus FRH montre une réponse retardée par rapport au cortex moteur stimulé. Les barres bleues indiquent les périodes de 473 nm photostimulation. Barres d&#39;erreur gris ombrés indiquent l&#39; erreur standard sur six cycles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53346/53346fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Ce protocole décrit les étapes et l’analyse des données nécessaires pour réaliser avec succès l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle optogénétique (IRMo). L’IRMf est une nouvelle technique qui combine la lecture de l’IRMf à haut champ avec la stimulation optogénétique, permettant une cartographie spécifique au type cellulaire des circuits neuronaux fonctionnels et de leur dynamique dans l’ensemble du cerveau vivant.

L&#39;IRM fonctionnelle optogénétiques

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

L'objectif général de cette procédure d'imagerie est de combiner l'IRM fonctionnelle avec une stimulation optogénétique afin de cartographier de manière spécifique aux types cellulaires les circuits neuronaux fonctionnels et leurs dynamiques dans l'ensemble du cerveau vivant. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, comme déterminer le rôle d'éléments spécifiques des circuits cérébraux dans l'activation globale du cerveau. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet une stimulation spécifique aux types cellulaires et une lecture de l'activité cérébrale globale avec une résolution spatiale relativement élevée.La démonstration de cette procédure sera effectuée par Jia Liu et Zhongnan Fang, étudiants diplômés dans mon laboratoire. Après avoir anesthésié l'animal comme décrit dans le protocole écrit, raser la tête à l'aide d'un rasoir électrique et effectuer un triple nettoyage chirurgical de la peau à l'aide de Bétadine et d'un rinçage à 70 % d'éthanol. Ensuite, immobiliser le crâne de l'animal dans un appareil stéréotaxique.Utilisez un scalpel pour réaliser une incision médiane du cuir chevelu de 15 à 20 millimètres. Rétractez le cuir chevelu à l’aide d’hémostats chirurgicaux fixés au périoste. Identifiez les positions de Lambda et de Bregma sur le crâne, puis positionnez le foret au-dessus de la région d’intérêt, ou ROI.Pratiquer une petite craniotomie au-dessus de la région d'intérêt (ROI) à l'aide d'une fraise dentaire, en prenant soin de ne pas percer le cerveau. Insérer lentement une aiguille fixée à la seringue microlitrique à travers la craniotomie jusqu'à la région d'intérêt dans le cerveau. Utiliser ensuite un contrôleur de pompe à microsérine pour injecter deux microlitres de la solution vectorielle dans la région d'intérêt.Une fois l'injection terminée, attendez 10 minutes, puis retirez lentement la seringue à une vitesse de 0,5 millimètre par minute. Après l'injection, séchez la surface du crâne. Vérifiez les coordonnées de la région d'intérêt (ROI) et insérez l'implant de ferrule à la profondeur cible à une vitesse de 0,5 millimètre par minute.Enfin, fixez l'implant de ferrule sur le crâne à l'aide de ciment dentaire. Une fois que le ciment dentaire est solidifié, refermez l'incision par des points de suture autour du capuchon de ciment dentaire. Commencez par raccorder le câble de raccordement en fibre optique à une source lumineuse laser, puis mesurez la puissance émise à l'extrémité du manchon du câble de raccordement à l'aide d'un puissancemètre.Réglez le niveau de puissance approprié pour produire la sortie souhaitée à l'extrémité du câble en fibre optique, qui est implanté à l'intérieur du cerveau. Évitez les fuites de lumière depuis l'implant en couvrant les yeux de l'animal. Ensuite, placez la bobine au-dessus de la tête de l'animal.Utilisez un manchon de ferrule pour maintenir le câble en fibre optique contre l'implant de ferrule. Insérez le berceau contenant l'animal dans l'alésage du scanner. Surveillez la fréquence respiratoire, le CO2 tidal et la température corporelle tout au long de l'expérience en ajustant le ventilateur artificiel afin de maintenir les valeurs physiologiques dans des limites appropriées.Connectez des câbles BNC depuis le port de déclenchement du scanner IRM vers le générateur de fonctions. Sélectionnez une séquence de positionnement et cliquez sur « scan » dans la fenêtre de fonctionnement. Cliquez sur « continue » pour visualiser la position de la tête de l'animal.Si le cerveau n'est pas au centre isocentrique, ajustez la position de la tête de l'animal et répétez l'acquisition de positionnement jusqu'à ce que le cerveau soit au centre isocentrique. Acquérez une image anatomique de haute résolution afin de vérifier l'intégrité globale du cerveau et de confirmer l'emplacement de l'implant de fibre optique. Ensuite, sélectionnez une séquence pondérée en T2.Ajustez le nombre de tranches, puis cliquez sur «&nbsp;scan&nbsp;» pour acquérir les images anatomiques coronales haute résolution pondérées en T2. Enfin, sélectionnez une séquence d'écho de gradient multi-tranches, puis cliquez sur «&nbsp;continuer&nbsp;» pour acquérir l'image fonctionnelle. Ce protocole utilise l'IRM fonctionnelle optogénétique pour stimuler le cortex moteur dans un modèle animal.Cette carte d'activation montre les voxels activés dans le cortex moteur et le thalamus, indiquant des connexions synaptiques à longue distance entre ces régions. Ici, le signal en gras représente les voxels actifs dans le cortex moteur et le thalamus durant la stimulation optogénétique du cortex moteur. La fonction de réponse hémodynamique thalamique présente une réponse retardée par rapport à celle du cortex moteur après la stimulation.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer des chirurgies d'implantation et d'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle optogénétique. Une fois maîtrisée, cette procédure d'imagerie peut être réalisée en deux heures. Lors de la réalisation de cette procédure, il est très important de surveiller l'animal et de maintenir sa physiologie dans des limites normales.Après cette procédure, des méthodes complémentaires peuvent être utilisées, comme l'électrophysiologie pour étudier la dynamique temporelle de l'activité neuronale, ou l'immunohistochimie pour valider l'expression et la spécificité de l'opsine. Le développement de cette technique a ouvert la voie aux neuroscientifiques pour explorer la connectivité fonctionnelle dans un cerveau vivant intact. N'oubliez pas que travailler avec un appareil d'IRM peut être extrêmement dangereux.Des précautions telles que le maintien d'un éloignement suffisant des équipements magnétiques par rapport au scanner doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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