Photostimulation par balayage laser de circuits du cerveau antérieur ciblés optogénétiquement

L’objectif global de cette procédure est d’appliquer des techniques optogénétiques modernes pour photostimuler des voies neuronales ciblées dans des préparations de coupes in vitro. Ceci est accompli en exprimant d’abord le bâtonnet de canal Dossin dans les lignées cellulaires neuronales d’intérêt. La deuxième étape de la procédure consiste à faire des préparations de coupes aiguës des structures cérébrales pertinentes à étudier.

L’étape suivante consiste à enregistrer les réponses des neurones dans la préparation de la tranche en réponse à la photostimulation du canal, bâtonnet exprimant les fibres de Dossin. La dernière étape consiste à imager la distribution des neurones et des fibres exprimant l’opsine. En fin de compte, cette approche permet d’évaluer la topographie fonctionnelle et les propriétés synaptiques des circuits neuronaux à l’aide de la photostimulation par balayage laser de composants neuronaux ciblés optogénétiquement.

Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes traditionnelles de stimulation électrique sont la capacité de cibler et de stimuler spécifiquement des types de cellules neuronales particuliers et d’examiner leurs projections à longue portée in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuroscience des systèmes, telles que l’organisation fonctionnelle des douilles de guerre complexes. Préparez une seringue et une aiguille pour injecter la solution virale, qui contient quatre microgrammes par millilitre de poly pour améliorer la transfection.

Ensuite, injectez sous pression 200 nanolitres de la solution à l’aide de la pompe à seringue, deux à trois semaines plus tard, il y aura une expression adéquate de la tranche de Dossin à tige de canal. La préparation doit être effectuée le plus rapidement possible Après avoir retiré le cerveau injecté, faites un bloc du cerveau dans l’orientation souhaitée à l’aide d’une lame de rasoir propre. Ensuite, fixez la surface bloquée du cerveau à l’étape de coupe à l’aide d’une colle adhésive instantanée.

Transférez ensuite l’étage dans une chambre de coupe vibrante réfrigérée par congélateur et versez de la glace A CSF dans la chambre de coupe. Coupez les sections de cerveau à l’aide d’un viome en sections de quatre à 500 microns d’épaisseur. Transférez les tranches de cerveau dans une chambre de rétention oxygénée et laissez-les incuber à 30 degrés Celsius pendant au moins une heure avant de poursuivre l’expérience.

Lorsque vous êtes prêt à commencer l’expérience, transférez la tranche de cerveau sur la scène du banc d’enregistrement électrophysiologique. Enregistrez un neurone à l’aide de techniques standard de patch clamp de cellules entières. Positionnez brièvement la pipette d’enregistrement par le neurone tout en appliquant une pression positive sur la pipette.

Une fois le contact avec la cellule établi, relâchez la pression et appliquez l’aspiration pour former le giga joint. Ensuite, appliquez une brève aspiration pour briser la membrane pour une configuration de cellule entière et prenez des enregistrements en mode pince de tension ou de courant. Faites fonctionner le scanner laser à l’aide d’un logiciel d’acquisition de données d’ondes de marée ou d’EFA.

Le logiciel doit être calibré sur la photodiode avant d’être utilisé pour contrôler la puissance du laser. Une roue à densité neutre variable est placée sur son chemin. La rotation de la molette ajuste la puissance du laser en mesurant au niveau du plan focal arrière.

La puissance est généralement réglée entre 25 et D milliwatts. Le paramètre d’impulsion de l’obturateur contrôle la durée et le moment de la stimulation dans le logiciel. Une image de la région à stimuler peut être réalisée à partir de la fonction de capture vidéo.

Ensuite, réglez la grille de stimulation telle qu’une grille de 16 par 16 avec un espacement de 80 microns. Superposez ensuite la grille sur l’image acquise et ajustez les coordonnées XY et le degré de décalage pour optimiser l’orientation afin de démarrer la stimulation. Activez la fonction carte.

Les données sont conservées et peuvent être analysées à l’aide du programme d’analyse hors ligne en raz-de-marée, ou elles peuvent être analysées à l’aide du programme d’analyse cartographique du logiciel EFAs. Après avoir terminé les enregistrements physiologiques sur la tranche, le profil d’expression de l’opsine du canal marqué YFP peut être documenté. Tout d’abord, fixez la tranche pendant la nuit dans 4 % de PFA dans 0,01 PBS molaire à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, transférez la tranche dans une solution de 30 % de saccharose 4 % de PFA pour une protection cryogénique de nuit. Le lendemain, coupez des sections de 50 microns de la tranche sur un cryostat. Rincez les tranches dans du PBS et montez-les pour l’imagerie avec un milieu anti-décoloration au microscope confocal.

Après avoir trouvé la région d’intérêt en lumière blanche, utilisez une longueur d’onde excitatrice de 514 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 527 nanomètres. Pour imager la construction virale YFPA qui pilote l’expression de la tige de canal Dobson, EYFP. Dans l’excitation, les neurones glutamatergiques ont été injectés dans le cortex visuel primaire d’une souris BSY.

L’expression virale a été trouvée dans les traces entre les cortex visuels primaire et secondaire, et dans les fibres thalamiques cortico du LGN l’enregistrement d’un neurone du cortex visuel secondaire marqué par l’étoile a révélé des PSC. Suite à la photostimulation par balayage laser du canal, la tige Dossin exprimant les fibres dans les couches inférieures de V deux projections thalamiques cortico à partir de la couche six du cortex somatosensoriel primaire. Le noyau postérieur ventral a été étudié à l’aide d’une approche CRE LAX pour exprimer la dossine des bâtonnets de canal dans les neurones thalamiques cortico de la couche six, et dans leurs projections comme prévu, la transfection par une construction en V floquée dans une souris transgénique CRE a entraîné l’expression de la dosine des bâtonnets de canal dans les neurones ciblés de la couche six et leurs fibres s’étendant à la couche quatre.

L’expression de Dobson, EYFP a également été notée dans les fibres projetant vers VP des enregistrements physiologiques à partir d’un neurone VP. L’utilisation d’un patch clamp de cellule entière a révélé que les CSP pouvaient être induites à la suite d’une photostimulation près du neurone enregistré, qui est marqué par l’étoile. L’analyse hors ligne décrit l’amplitude moyenne de réponse à la photostimulation dans VP Résectionné de 50 microns de neurones thalamiques cortico de couche six exprimant le canal Rodin EYFP a révélé un motif fin de fibres marquées traversant de la couche six à la couche quatre où elles se terminent et arborent largement.

De plus, des fibres thalamiques cortico ont été observées pénétrant dans la substance blanche et se dirigeant vers le thalamus. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’appliquer des techniques optogénétiques modernes pour photostimuler des voies neuronales ciblées dans des préparations de tranches in vitro. N’oubliez pas que travailler avec des lasers peut être extrêmement dangereux lorsque vous effectuez des étapes d’étalonnage associées à cette procédure.

Portez des lunettes de protection.