Name: Photostimulation par balayage laser de circuits du cerveau antérieur ciblés optogénétiquement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Découvrez la photostimulation laser de circuits cérébraux antérieurs par optogénétique in vitro. Cette méthode permet d'évaluer la topographie fonctionnelle et les propriétés synaptiques des circuits neuronaux avec précision.

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Ce travail a été soutenu par la subvention NIH/NIDCD R03 DC 011361, la subvention SVM CORP LAV3202, la subvention NSF-LA EPSCoR PFUND86, et une subvention de publication de Leica Microsystems (CCL) et la subvention NIH/NIDCD R01 DC 008794 (SMS).

1. Chirurgie et injections
<ol>
	<li>Anesthésier les souris à l’aide d’une injection intrapéritonéale (aiguille de 22 à 25 g recommandée) de kétamine (100 à 120 mg/kg) et de xylazine (7,5 à 16 mg/kg).
	<ol>
		<li>Évaluez la sédation à l’aide de fortes pincements des orteils jusqu’à ce qu’aucune réponse ne soit obtenue. Pour toutes les procédures animales décrites, modifiez-les pour suivre les directives locales de l’IACUC si nécessaire.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Placez les souris sous sédation dans un appareil stéréotaxique en fixant la tête et les oreilles dans leurs supports respectifs.
	<ol>
		<li>Lubrifiez les yeux avant de placer l’animal dans le dispositif stéréotaxique avec une pommade ophtalmique stérile.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rasez le cuir chevelu avec un rasoir et stérilisez la zone avec des cotons-tiges de bétadine.</li>
	<li>À l’aide d’un scalpel, coupez une incision médiane et réfléchissez la peau et les muscles sous-jacents au-dessus de la zone à injecter.</li>
	<li>Faites pivoter une lame de scalpel comme un trépan pour effectuer une craniotomie au-dessus de la région à exposer. Vous pouvez également utiliser un petit foret attaché à un Dremel pour effectuer la craniotomie.
	<ol>
		<li>Pour effectuer la craniotomie, placez la lame du scalpel ou le foret sur la surface du crâne et tournez lentement jusqu’à ce qu’une quantité suffisante d’os ait été excavée pour révéler la pie-mère en dessous.</li>
		<li>Une fois l’excavation initiale effectuée, agrandissez la craniotomie à l’aide de pinces fines pour retirer soigneusement l’os des bords.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Remplissez une seringue de 1 μl avec la solution virale à injecter (UNC Vector Core).
	<ol>
		<li>Pour améliorer l’efficacité de la transfection, préparer une solution virale avec 4 μg/ml de polybrène.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Abaissez l’aiguille dans la zone à injecter et perférez sous pression 200 nl de solution contenant le virus à l’aide d’un pousse-seringue.
	<ol>
		<li>Laissez la seringue reposer pendant 10 minutes avant de retirer l’aiguille.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Suturez la peau avec du nylon monofilament non résorbable et couvrez l’incision avec une pommade antibiotique.
	<ol>
		<li>Les sutures doivent être retirées après 7 à 10 jours.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Injecter de la buprénorphine (0,05-0,1 mg/kg) pour l’analgésie postopératoire.</li>
	<li>Laisser les animaux se rétablir après l’opération pendant 14 à 21 jours pour permettre une expression adéquate de la rhodopsine de canal.</li>
</ol>
2. Préparation des tranches
<ol>
	<li>Après la période de récupération, anesthésier profondément l’animal avec une anesthésie à l’isoflurane, comme en témoigne l’absence de réflexe de retrait lorsque la patte arrière et/ou les orteils sont fermement pincés.</li>
	<li>Disséquer le cerveau par décapitation suivie de coupures médianes et frontales du crâne.</li>
	<li>Séparez le crâne de la ligne médiane pour exposer le cerveau.</li>
	<li>Retirez soigneusement le cerveau à l’aide d’une spatule fine pour séparer les nerfs crâniens de la base du cerveau.</li>
	<li>Placez rapidement le cerveau disséqué dans un petit bécher de 100 ml contenant du liquide céphalo-rachidien artificiel réfrigéré et glacé (ACSF ; en mM : 125 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 25 NaHCO3, 25 glucose).</li>
	<li>Retirez le cerveau de l’ACSF et placez-le sur une lame de microscope recouverte de papier filtre pré-humidifié avec de l’ACSF.</li>
	<li>Faites une coupe bloquante du cerveau dans l’orientation souhaitée à l’aide d’une lame de rasoir propre.</li>
	<li>Fixez la surface bloquée du cerveau à l’étape de coupe à l’aide d’une colle adhésive instantanée.</li>
	<li>Transférer l’étape dans une chambre de coupe vibrante (conservée au congélateur jusqu’à ce qu’elle soit prête à être coupée).</li>
	<li>Versez l’ACSF glacé dans la chambre de coupe.</li>
	<li>Coupez des sections de cerveau à 400-500 μm à l’aide d’une trancheuse à tissus vibrants.</li>
	<li>Transférez les tranches de cerveau dans une chambre de rétention contenant de l’ACSF oxygéné et incubez à 30 °C pendant au moins 1 heure avant l’expérience.</li>
</ol>
3. Enregistrement physiologique
<ol>
	<li>Après la période d’incubation, transférez une tranche dans une chambre d’enregistrement sur une platine de microscope modifiée.</li>
	<li>Fixez la tranche dans le bain pendant l’expérience à l’aide de quelques fils de filaments de nylon attachés à un porte-tranche de fil de platine.</li>
	<li>Perfuser constamment la tranche avec de l’ACSF.</li>
	<li>Tirer les pipettes d’enregistrement jusqu’à une résistance de pointe de 3 à 6 MΩ lorsqu’elles sont remplies d’une solution intracellulaire contenant les éléments suivants (en mM) : 127 K-gluconate, 3 KCl, 1 MgCl2, 0,07 CaCl2, 10 HEPES, 2 Na2-ATP, 0,3 Na-GTP, 0,1 EGTA. La solution intracellulaire doit avoir un pH de 7,3, ajusté avec du KOH ou de l’acide gluconique et une osmolalité de 280-290 mOsm.</li>
	<li>À l’aide d’une configuration standard d’enregistrement de cellules entières visualisées, placez la pipette d’enregistrement près du neurone à enregistrer tout en appliquant une pression positive22,23.</li>
	<li>Relâchez la pression positive tout en appliquant l’aspiration pour former le joint Gigaohm.</li>
	<li>Appliquez une brève aspiration pour briser la membrane et former un enregistrement de configuration de cellule entière.</li>
	<li>Enregistrez les réponses des neurones dans une pince de tension ou de courant.</li>
</ol>
4. Photostimulation par balayage laser
<ol>
	<li>Logiciel et matériel d’acquisition de données de démarrage, décrits dans les rapports précédents23-29. 
	Remarque : Nous avons utilisé à la fois les programmes d’acquisition Tidelwave25 et, plus récemment, Ephus26, écrits dans Matlab et développés par le laboratoire de Karel Svboda chez Janelia Farms30. Pour une description complète de la photostimulation par balayage laser chez Ephus, voir Suter et al.26 et le guide étape par étape30. 
	Remarque : La configuration décrite dans cet article est dérivée de celle décrite par Shepherd (2012)23. Le faisceau laser est guidé par un système de miroirs à faisceau ouvert vers l’orifice supérieur du microscope à travers la lentille de l’objectif sur la tranche (Figure 2).</li>
	<li>Déviez une petite partie du laser sur une photodiode à l’aide d’une lamelle de microscope placée dans la trajectoire du laser et utilisez le courant de sortie de cette photodiode pour surveiller l’intensité du laser pendant les expériences.
	<ol>
		<li>Étalonnez le courant de sortie de la photodiode enregistré dans le logiciel en fonction de la puissance laser mesurée au niveau du plan focal arrière de l’objectif à l’aide d’un wattmètre lors de la configuration de l’équipement23.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Contrôlez la puissance du laser en tournant une roue à densité neutre variable. La puissance laser utilisée a varié entre 25 et 70 mW (dans le plan focal arrière) dans nos expériences.</li>
	<li>Réglez la durée et le moment de la stimulation laser en modifiant les paramètres d’impulsion du laser et de l’obturateur. La stimulation laser dure généralement 2 ms.</li>
	<li>Capturez l'image de la région à stimuler à l'aide de la fonction « Grab Video ».</li>
	<li>Sélectionnez la grille de stimulation en fonction des dimensions souhaitées. Nous utilisons généralement un réseau de stimulation de 16 x 16 avec un espacement de 80 μm entre les rangées et les colonnes adjacentes.</li>
	<li>Superposez la grille de mappage avec l’image acquise et ajustez le décalage x, y et en degrés à l’emplacement et à l’orientation souhaités.</li>
	<li>Activez la fonction 'Map' pour lancer la stimulation et l'acquisition de données.</li>
	<li>Après l'acquisition des réponses évoquées par photostimulation, effectuer l'analyse des données cartographiées à l'aide du programme d'analyse cartographique hors ligne de Tidelwave25 ou du programme « MapAnalysis » d'Ephus26.</li>
</ol>
5. Imagerie de tranche fixe
<ol>
	<li>Après les enregistrements, transférer la tranche de cerveau à 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans 0,01 M PBS (pH 7,4) pendant la nuit à 4 ºC.</li>
	<li>Transférez la tranche dans 30 % de saccharose dans 4 % de PFA/0,01 M PBS pendant une nuit à 4 ºC.</li>
	<li>Découper des sections de 50 μm à l’aide d’un cryostat et collecter dans du PBS de 0,01 m.</li>
	<li>Rincer deux fois les sections dans 0,01 M PBS à température ambiante.</li>
	<li>Montez les sections et la lamelle dans un support anti-décoloration approprié.</li>
	<li>Transférez les coupes dans le microscope confocal.</li>
	<li>Concentrez-vous sur le retour sur investissement à l’aide de la lumière blanche.</li>
	<li>Choisissez la longueur d’onde, la taille de l’image et la répétition pour l’acquisition de l’image. Pour YFP, nous utilisons 514 nm (Ex)/527 nm (Em).</li>
</ol>

<ol><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13, 251-266 (2012).</li>
<li>Bernstein, J. G., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+tools+for+analyzing+the+neural+circuits+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cog.+Sci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior.</a> Trends Cog. Sci. 15, 592-600 (2011).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71, 9-34 (2011).</li>
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<li>Olsen, S. R., Bortone, D. S., Adesnik, H., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain+control+by+layer+six+in+cortical+circuits+of+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gain control by layer six in cortical circuits of vision.</a> Nature. 483, 47-52 (2012).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits%3A+technology+for+probing+mammalian+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).</li>
<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Na.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Na. Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li>
<li>Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway-specific+feedforward+circuits+between+thalamus+and+neocortex+revealed+by+selective+optical+stimulation+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons.</a> Neuron. 65, 230-245 (2010).</li>
<li>Lee, C. C., Lam, Y. W., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracortical+convergence+of+layer+6+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Intracortical convergence of layer 6 neurons.</a> Neuroreport. 23, 736-740 (2012).</li>
<li>Mancuso, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+probing+of+functional+brain+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic probing of functional brain circuitry.</a> Exp. Physiol. 96, 26-33 (2011).</li>
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<li>Lee, C. C., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+and+physiology+of+ascending+streams+in+the+auditory+tectothalamic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 372-377 (2010).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.
L’auteur (CCL) a reçu une bourse de publication de Leica Microsystems, qui produit un instrument utilisé dans ce tournage de ce protocole.

Le protocole décrit détaille une approche pour l’évaluation in vitro de la topographie fonctionnelle et de la physiologie des circuits neuronaux, qui ne se limite pas à l’étude des circuits du cerveau antérieur, c’est-à-dire ceux du thalamus et du cortex. Plusieurs constructions virales pour la transfection optogénétique ont été mises à la disposition de la communauté scientifique et peuvent être facilement obtenues à partir du Vector Core de l’UNC. Pour une description des constructions virales facilement disponibles, consultez le UNC Vector Core31, la page de ressources en optogénétique du laboratoire Deisseroth de l’Université de Stanford32 et le laboratoire de neurobiologie synthétique Boyden du MIT33. Des variantes de ces opsines ont été développées par ces laboratoires et permettent de disposer d’un large éventail de modes pour contrôler l’excitabilité neuronale1,2. L’obtention de ces vecteurs à partir du noyau vectoriel de l’UNC nécessite un accord de transfert de matériel de la part des laboratoires d’origine. Dans ce protocole, nous notons que l’ajout de polybrène améliore l’efficacité de la transfection. De plus, une autre variable influençant l’expression est la période de récupération post-chirurgicale, dont on note qu’une période d’au moins 14 jours est suffisante pour obtenir une expression robuste dans les voies du cerveau antérieur des souris.
Pour la transfection ciblée de groupes neuronaux spécifiques, plusieurs lignées de souris transgéniques Cre ont été développées, qui peuvent être utilisées en combinaison avec des constructions virales à cadre de lecture ouvert inversé « floxé » qui ont été développées11. Plusieurs souches pertinentes pour la recherche en neurosciences sont disponibles par l’intermédiaire des Mutant Mouse Regional Resource Centers34. Des atlas des profils d’expression de la Cre-recombinase dans ces lignées transgéniques sont proposés dans la base de données GENSAT35. De plus, Jackson Labs propose plusieurs souches transgéniques Cre, ainsi que d’autres qui expriment constitutivement des opsines dans des groupes neuronaux spécifiques. Une étape critique de l’utilisation de ces lignées de souris est de prendre en compte le temps nécessaire à l’obtention et à l’établissement d’une colonie de reproduction, qui peut varier en fonction de la souche d’intérêt.
Pour la photostimulation, nous avons utilisé et adapté la configuration développée par le Shepherd Lab de l’Université Northwestern, décrite dans un protocole récent29. Bien qu’optimisée pour le décannage du glutamate, cette configuration se prête également à la photostimulation de la channelrhodopsine sans modification. Cette configuration permet un contrôle spatial précis et un positionnement des loci de photostimulation, ce qui permet une évaluation de la topographie fonctionnelle de l’innervation de la channelrhodopsine des neurones enregistrés. Bien que le contrôle spatial soit amélioré avec cette méthode de photostimulation, son coût est plus prohibitif que les méthodes utilisant un éclairage de champ basé sur des LED20. De plus, la non-uniformité du tissu cérébral est une limitation de l’optogénétique, ou de toute technique impliquant une manipulation de la lumière. Dans la pratique, cependant, il s’agit rarement d’un facteur, car les résultats sont interprétés principalement de manière qualitative. Dans le cas où une comparaison plus quantitative entre les régions du cerveau est nécessaire, on peut toujours utiliser l’intensité lumineuse maximale pour obtenir des réponses « saturées ».
De plus, nous avons utilisé les logiciels Tidelwave et Ephus écrits dans Matlab pour contrôler la photostimulation à balayage laser et l’acquisition de données25,26. Cependant, il est recommandé à ceux qui mettent en place un système similaire d’utiliser le logiciel Ephus26, plus récent, qui bénéficie d’un support disponible via le site de développement de Janelia Farms30. Une étape clé consiste à choisir lequel de ces progiciels utiliser, car leurs exigences matérielles diffèrent légèrement. De plus, les programmes d’analyse cartographique sont adaptés à leurs programmes respectifs d’acquisition de données.
Plusieurs de ces étapes peuvent être modifiées pour s'adapter à la configuration particulière du praticien. Les injections de solutions virales peuvent être effectuées à l’aide de mécanismes d’administration autres qu’une seringue, par exemple des pipettes en verre capillaire tirées à des diamètres d’extrémité de ~40 μm fonctionnent également bien. Pour les chirurgies, un support de tête non stéréotaxique peut être substitué si ces coordonnées ne sont pas nécessaires pour guider les injections. De plus, les compositions d’ACSF et de solutions intracellulaires peuvent être modifiées en fonction des exigences expérimentales particulières, par exemple en remplaçant une solution intracellulaire de césium ou à haute teneur en chlorure pour isoler les courants inhibiteurs. De plus, une alternative à l’imagerie des motifs d’expression dans des coupes fixes peut également être réalisée dans la tranche vivante sur un banc d’imagerie approprié avec un système de perfusion par bain.
En résumé, ce protocole permettra au praticien de caractériser la topographie fonctionnelle et la physiologie synaptique des projections in vitro, ce qui peut ne pas être possible avec des méthodes standard, par ex. caractériser des projections à longue portée qui ne peuvent pas être conservées dans une tranche. Le protocole de transfection décrit peut être appliqué aux expériences optogénétiques in vivo 1-3,12,14, puisque le mécanisme d’administration est le même. Enfin, bien que ce protocole décrit la transfection de souris, de nombreux vecteurs viraux disponibles peuvent être utilisés pour transfecter et exprimer théoriquement ces opsines dans un large éventail d’espèces de mammifères, permettant ainsi une myriade d’études comparatives et spécifiques à l’espèce1-3.

Le circuit élaboré du cerveau antérieur des mammifères pose un défi expérimental pour disséquer les rôles fonctionnels de ses composants entrelacés. Le démêlage de ces relations a été récemment facilité par le développement de méthodes optogénétiques permettant d’exciter et d’inhiber spécifiquement les populations neuronales et leurs projections1-3. Ces approches utilisent l’expression génétiquement contrôlée des canaux membranaires sensibles à la lumière4-6. Il convient de noter en particulier que la channelrhodopsine, un canal ionique photodébilisé, dépolarise les membranes neuronales à la suite d’une stimulation optique, entraînant une excitation du neurone exprimant et de ses projections4,7. À l’inverse, l’halorhodopine, une pompe à chlorure photocommandée, hyperpolarise la membrane, inhibant ainsi la projection ciblée6,8,9. Plusieurs variantes de ces opsines ont été conçues, de multiples vecteurs ont été produits pour la transfection et l’expression dans les populations neuronales d’intérêt, et des lignées de souris transgéniques ont été modifiées pour exprimer constitutivement ces opsines ou qui permettent le contrôle de leur expression par l’intermédiaire de cre-lox1,2,10,11.
L’utilité de ces méthodes et matériaux optogénétiques a révolutionné les neurosciences expérimentales modernes, permettant de disséquer le rôle de circuits neuronaux spécifiques dans la physiologie et le comportement de l’organisme12-15. En particulier, ces méthodes peuvent être puissamment appliquées à la dissection fonctionnelle des circuits cérébraux à l’aide de préparations de coupes in vitro 16-20. Dans ce contexte, l’un des principaux avantages de cette méthode est la possibilité de caractériser la physiologie de projections à longue portée qui sont difficiles, voire impossibles, à conserver dans une tranche épaisse, comme les connexions commissurales entre les hémisphères corticaux cérébraux16. De plus, cette technologie permet des manipulations impossibles avec d’autres méthodes, telles que l’inhibition sélective des projections avec une précision temporelle fine à l’aide de l’halorhodopsine6,8,9. De plus, l’expression spécifique de ces opsines permet aux composants isolés d’un circuit neuronal d’être stimulés ou inhibés de manière sélective1,2,11,15,21. En tant que tels, ces nouveaux outils optogénétiques permettent l’analyse sans précédent des contributions neuronales à la physiologie et au comportement.
Ici, nous décrivons un protocole d’expression de la channelrhodopsine dans le cerveau de la souris à l’aide de vecteurs viraux adéno-associés (AAV)1,2. La transfection spécifique de populations neuronales ciblées peut être réalisée à l'aide de ce protocole, avec le choix approprié de constructions promotrices ou de souris transgéniques qui expriment la Cre-recombinase dans les neurones ciblés d'intérêt et une construction virale « floxée »1,11,15,21 (Figure 1). À titre d’exemples, nous examinons les projections corticocorticales entre le cortex visuel primaire (V1) et le cortex visuel secondaire (V2) et nous étudions également la projection corticothalamique de couche 6 du cortex somatorsensoriel primaire (S1) vers le noyau médial ventropostérieur (VPm). Nous combinons cette expression spécifique avec la photostimulation par balayage laser in vitro pour évaluer la physiologie synaptique et la topographie fonctionnelle. La configuration présentée ici permet un positionnement spatial précis et un contrôle des lieux de photostimulation. Enfin, nous décrivons la visualisation des motifs d’expression à l’aide de la microscopie confocale.

<table><tbody><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC134220</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde 32 % solution</td><td>EMS</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD</td><td>Vector Labs</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>AAV Constructions virales</td><td>UNC Vector Core</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Souris casque stéréotaxique</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Injecteur Nanocool</td><td>Harvard Appareil</td><td>703040</td><td></td></tr><tr><td>Laser UV : 355 nm, Nd :YVO4 ; 1 W ;</td><td>DPSS Lasers, Inc</td><td>3500</td><td></td></tr><tr><td>Galvonomètres</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6210</td><td></td></tr><tr><td>miroirs</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6m2003S-A</td><td></td></tr><tr><td>mount</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6102103L</td><td></td></tr><tr><td>câble</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6010-19-120</td><td></td></tr><tr><td>driver/controller</td><td>Cambridge Scanning</td><td>67121-1</td><td></td></tr><tr><td>Obturateur - Revêtement ZM (compatible UV)</td><td>Uniblitz</td><td>L23-ZM2</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur d’obturateur</td><td>Uniblitz</td><td>VMM-D1</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur de courant</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR570</td><td></td></tr><tr><td>6713 carte</td><td>National Instruments</td><td>777741-01</td><td></td></tr><tr><td>2110 boîte de dérivation</td><td>National Instruments</td><td>777643-01</td><td></td></tr><tr><td>PCI-MIO-16E-4</td><td>National Instruments</td><td>777383-01</td><td></td></tr><tr><td>BNC-2090</td><td>National Instruments</td><td>777270-01</td><td></td></tr><tr><td>Câbles</td><td>National Instruments</td><td>184749-01</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCS SP2</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

photostimulation par balayage laser de circuits du cerveau antérieur ciblés optogénétiquement

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

Le cerveau antérieur sensoriel est composé de types de cellules étroitement liées, dont les propriétés fonctionnelles n’ont pas encore été entièrement élucidées. La compréhension des interactions de ces circuits cérébraux antérieurs a été facilitée récemment par le développement de méthodes optogénétiques pour la modulation de l’activité neuronale par la lumière. Ici, nous décrivons un protocole pour examiner l’organisation fonctionnelle des circuits du cerveau antérieur in vitro en utilisant la photostimulation par balayage laser de la channelrhodopsine, exprimée optogénétiquement via la transfection à médiation virale. Cette approche exploite également l’utilité de la recombinaison cre-lox chez les souris transgéniques pour cibler l’expression dans des types de cellules neuronales spécifiques. Après la transfection, les neurones sont physiologiquement enregistrés dans des préparations de coupes à l’aide d’un patch clamp de cellules entières pour mesurer leurs réponses évoquées à la photostimulation par balayage laser des fibres exprimant la channelrhodopsine. Cette approche permet d’évaluer la topographie fonctionnelle et les propriétés synaptiques. Des corrélats morphologiques peuvent être obtenus en imageant l’expression neuroanatomique des fibres exprimant la channelrhodopsine à l’aide de la microscopie confocale de la tranche vivante ou du tissu post-fixé. Ces méthodes permettent des investigations fonctionnelles des circuits du cerveau antérieur qui s’étendent à des approches plus conventionnelles.

La photostimulation par balayage laser des projections entre l'aire visuelle primaire (V1) et l'aire visuelle secondaire (V2) chez la souris a été réalisée après injection de pAAV-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP dans V1 d'une souris Balb/C (Figure 3). Le promoteur CaMKIIa présent dans ce vecteur viral induit une expression spécifique de la channelrhodopsine-EYFP dans les neurones glutamatergiques excitateurs1,15. Après préparation des tranches pour l'enregistrement physiologique, l'expression des fibres de channelrhodopsine-EYFP, c'est-à-dire la fluorescence épifluorescente de l'EYFP conjugué, a été observée traversant de V1 vers V2 (Figure 3A). De plus, les fibres corticothalamiques présentes dans le noyau géniculé latéral (LGN) ont également été observées (Figure 3A). Des enregistrements en configuration whole-cell par patch-clamp réalisés sur un neurone de V2 ont révélé des courants postsynaptiques excitateurs (EPSC) déclenchés suite à la photostimulation par balayage laser des fibres exprimant la channelrhodopsine-EYFP dans les couches inférieures de V2 (Figure 3B).
Dans un autre exemple, la photostimulation par balayage laser des projections corticothalamiques provenant de la couche 6 du cortex somatosensoriel primaire (S1) vers le noyau ventropostérieur (VP) a été réalisée à l’aide de ce protocole. Ici, nous avons utilisé une approche Cre-Lox afin de cibler spécifiquement l’expression de la channelrhodopsine dans les neurones de la couche 6 et les projections corticothalamiques d’intérêt. Plus précisément, nous avons injecté le vecteur pAAV-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA dans le S1 de souris B6.Cg-Tg(Ntsr1-cre)GN220Gsat/Mmcd (Figures 1 et 4). Cette souche transgénique exprime la recombinase Cre spécifiquement dans les neurones corticothalamiques de la couche 621, ce qui conduit donc à l’expression de ChR-YFP uniquement dans ces neurones après transfection par le vecteur AAV « floxé ». Après préparation des tranches, des fibres exprimant la channelrhodopsine-EYFP ont été observées dans les neurones de la couche 6 ainsi que dans les fibres projetant vers la couche 4 et le VP (Figures 4A et 4B). Un enregistrement physiologique réalisé sur un neurone du noyau ventropostéro-médian (VPm) par la technique de patch-clamp en configuration tout-cellule a révélé que des courants postsynaptiques excitateurs (EPSC) pouvaient être déclenchés par la photostimulation au laser à balayage à proximité du neurone enregistré (Figures 4C et 4D).
La morphologie des fibres marquées a été évaluée plus facilement après les enregistrements physiologiques. Ici, nous avons réalisé de nouvelles coupes (50 μm) de préparations en tranches présentant une expression de channelrhodopsine-EYFP dans les neurones corticothalamiques de la couche 6 (Figure 5). Cela a révélé un réseau fin de fibres marquées traversant la couche 6 vers la couche 4, où elles se terminaient et s'arborisaient de manière extensive (Figure 5A). De plus, des fibres corticothalamiques ont été observées pénétrant dans la substance blanche et se dirigeant vers le thalamus (Figures 5A et 5B).
<img alt="Schéma d'édition génique utilisant Cre-loxP pour une expression ciblée de ChR-YFP dans un modèle murin." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig1.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1. Illustration schématique d'une expression ciblée de la channelrhodopsine par une approche Cre-Lox. Des souris transgéniques exprimant la Cre-récombinase dans les populations neuronales d'intérêt sont injectées avec un virus « floxé » codant pour la channelrhodopsine fusionnée à une protéine fluorescente, comme la YFP. Après transfection, seuls les neurones exprimant la Cre-récombinase produiront la channelrhodopsine-EYFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande</a>.
<img alt="Schéma de microscopie laser avec optique laser, miroir dichroïque, caméra CCD et dispositif de balayage." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig2.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2. Illustration schématique du dispositif de photostimulation. (A) Schéma du dispositif de photostimulation par balayage laser. Le faisceau laser traverse successivement un système de faisceau ouvert, un obturateur et un filtre à densité neutre (N.D.). Une lame séparatrice réfléchit une partie du faisceau vers une photodiode reliée à un amplificateur pour la mesure de la puissance laser. Des galvanomètres à miroir servent à positionner le faisceau laser à travers une lentille de balayage, qui dirige le faisceau par un port latéral situé en haut du microscope. Le faisceau est ensuite réfléchi vers le bas à travers l'objectif jusqu'à la préparation de tranches grâce à un miroir dichroïque. Pour plus de détails, voir Lam et Sherman23 et Shepherd29. (B) Exemple de motif de grille de photostimulation pour l'expérience représentative illustrée dans la Figure 3. La grille de stimulation 16 × 16 est superposée à une photomicrographie de la préparation de tranches. Une étoile rouge indique l'emplacement d'un neurone enregistré à l'aide d'une électrode en configuration whole-cell (enregistrement en « tout-cellule »). La position du faisceau laser est dirigée vers chacun des 256 points de la grille de stimulation par positionnement informatisé des galvanomètres à miroir. Les positions laser des 5 premiers sites de stimulation sont représentées sur la figure. Les réponses du neurone enregistré à la photostimulation à chacun de ces sites sont illustrées dans la Figure 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande</a>.
<img alt="Schéma de carte d'imagerie neurologique ; analyse du cortex visuel LGN, V1, V2 ; étude des connexions neuronales." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig3.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3. Photostimulation par balayage laser des projections cortico-corticales du cortex visuel primaire (V1) vers le cortex visuel secondaire (V2) chez la souris. (A) Image épifluorescente du prélèvement de coupe montrant les fibres de channelrhodopsine-EYFP de V1 à V2 et dans le noyau géniculé latéral (LGN). L'expression spécifique de la channelrhodopsine-EYFP dans les neurones glutamatergiques excitateurs est induite par un vecteur viral contenant le promoteur CaMKIIa. (B) Courants postsynaptiques excitateurs (EPSC) déclenchés dans un neurone de V2 suite à la photostimulation par balayage laser. L'étoile rouge indique le site d'enregistrement. Échelles : (A) 500 µm, (B) 200 pA, 100 msec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande</a>.
<img alt="Schéma des couches corticales avec analyse de la région VP ; cartographie de l'activité microélectrique ; données d'électrophysiologie." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig4.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4. Photostimulation par balayage laser des projections corticothalamiques depuis le cortex somatosensoriel primaire (S1) vers le noyau ventropostérieur (VP) chez la souris. (A) Image en épifluorescence du prélèvement de coupe montrant les fibres exprimant la channelrhodopsine-EYFP dans S1. (B) Image en épifluorescence des fibres marquées dans VP. (C) Courants postsynaptiques excitateurs (EPSC) induits dans un neurone de VP suite à la photostimulation par balayage laser. (D) Représentation graphique des EPSC moyens. L'étoile rouge indique le site d'enregistrement. Les tracés encadrés en (C) correspondent aux valeurs encadrées en (D). Échelles : (A) 250 µm, (B) 250 µm, (C) 100 pA, 100 msec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande</a>.
<img alt="Microscopie de fluorescence montrant des structures neuronales marquées par des marqueurs verts ; diagramme comparatif." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig5.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5. Imagerie de neurones de la couche 6 exprimant la channelrhodopsine-EYFP dans le cortex somatosensoriel primaire (S1) de la souris. (A-B) Neurones marqués dans la couche 6 et fibres projetant vers la couche 4 et la substance blanche. Échelles : (A) 250 µm, (B) 250 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig5highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir l'image en taille réelle</a>.

Nous décrivons une méthode pour caractériser la topographie fonctionnelle et les propriétés synaptiques des circuits du cerveau antérieur en utilisant une approche optogénétique pour photostimuler les populations neuronales in vitro.

Photostimulation par balayage laser de circuits du cerveau antérieur ciblés optogénétiquement

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

L'objectif général de cette procédure est d'appliquer des techniques optogénétiques modernes afin de stimuler par la lumière des voies neuronales ciblées dans des préparations de tranches in vitro. Cela est réalisé en exprimant d'abord la channelrodopsine Dossin dans les lignées cellulaires neuronales d'intérêt. La deuxième étape de la procédure consiste à réaliser des préparations aiguës de tranches des structures cérébrales pertinentes à étudier.L'étape suivante consiste à enregistrer les réponses des neurones dans la préparation de tranches suite à la stimulation photoélectrique des fibres exprimant le canal rod Dossin. La dernière étape consiste à imager la distribution des neurones et des fibres exprimant l'opsine du canal. En définitive, cette approche permet d'évaluer la topographie fonctionnelle et les propriétés synaptiques des circuits neuronaux à l'aide d'une stimulation photoélectrique par balayage laser de composants neuronaux ciblés de manière optogénétique.Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes traditionnelles de stimulation électrique sont la possibilité de cibler spécifiquement et de stimuler des types cellulaires neuronaux particuliers, ainsi que d'examiner leurs projections à longue distance in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine des neurosciences des systèmes, telles que l'organisation fonctionnelle des complexes de douilles de guerre. Préparez une seringue et une aiguille pour injecter la solution virale, qui contient quatre microgrammes par millilitre de poly pour améliorer la transfection.Ensuite, injecter sous pression 200 nanolitres de la solution à l’aide de la pompe à seringue ; deux à trois semaines plus tard, une expression adéquate du canal rod Dossin dans la tranche sera observée. La préparation doit être effectuée aussi rapidement que possible. Après avoir retiré le cerveau injecté, découper un bloc de cerveau dans l’orientation souhaitée à l’aide d’une lame de rasoir propre. Puis, fixer la surface du bloc de cerveau sur le plateau de coupe à l’aide d’une colle adhésive instantanée.Ensuite, transférez la platine dans une chambre de coupe vibram refroidie au congélateur et versez du CSF A glacé dans la chambre de coupe. Sectionnez le cerveau à l’aide d’un viome en tranches de 4 à 500 micromètres d’épaisseur. Transférez les tranches cérébrales dans une chambre de maintien oxygénée et laissez-les incuber à 30 degrés Celsius pendant au moins une heure avant de poursuivre l’expérience.Lorsque vous êtes prêt à commencer l'expérience, transférez la coupe cérébrale sur la platine du dispositif d'enregistrement électrophysiologique. Enregistrez un neurone en utilisant des techniques standards de patch-clamp en configuration whole cell. Positionnez brièvement la pipette d'enregistrement près du neurone tout en appliquant une pression positive à l'intérieur de la pipette.Après avoir établi le contact avec la cellule, relâchez la pression et appliquez une aspiration pour former le scellement gigaohm. Ensuite, appliquez une brève aspiration pour rompre la membrane et obtenir la configuration en cellule entière, puis effectuez les enregistrements en modes blocage de tension ou de courant. Utilisez le scanner laser avec le logiciel d'acquisition de données tidal wave ou EFAs.Le logiciel doit être calibré en fonction de la photodiode avant utilisation afin de contrôler la puissance du laser. Une roue de densité neutre variable est placée sur son trajet. La rotation de la roue ajuste la puissance du laser en effectuant une mesure au niveau du plan focal arrière.La puissance est généralement réglée entre 25 et D milliwatts. Le paramètre d'impulsion de l'obturateur contrôle la durée et le moment de la stimulation dans le logiciel. Une image de la région à stimuler peut être obtenue à partir de la fonction de capture vidéo.Ensuite, configurez la grille de stimulation, par exemple une grille de 16 sur 16 avec un espacement de 80 microns. Superposez ensuite la grille à l'image acquise et ajustez les coordonnées XY et le degré de décalage pour optimiser l'orientation avant de commencer la stimulation. Activez la fonction de cartographie.Les données sont conservées et peuvent être analysées à l'aide du programme d'analyse hors ligne dans tidal wave, ou bien à l'aide du programme d'analyse de carte dans le logiciel EFAs. Après avoir terminé les enregistrements physiologiques sur la tranche, le profil d'expression de l'opsine canal marquée par YFP peut être documenté. Fixez d'abord la tranche toute une nuit dans du PFA à 4 % dans du PBS 0,01 molaire à quatre degrés Celsius.Le lendemain, transférer la coupe dans une solution de 30 % de saccharose et 4 % de PFA pour une cryoprotection nocturne. Le jour suivant, découper des sections de 50 micromètres de la coupe au cryostat. Rincer les coupes dans le PBS et les monter pour l'imagerie avec un milieu antifade au microscope confocal.Après avoir localisé la région d'intérêt en lumière blanche, utilisez une longueur d'onde d'excitation de 514 nanomètres et une longueur d'onde d'émission de 527 nanomètres. Pour imager la construction virale YFPA qui induit l'expression du canal rod Dobson, EYFP. Dans les neurones glutamatergiques excitateurs injectés dans le cortex visuel primaire d'une souris BSY.L'expression virale a été observée dans les trajets entre les cortèxes visuels primaire et secondaire, ainsi que dans les fibres corticothalamiques du LGN. Un enregistrement en configuration whole cell patch clamp réalisé sur un neurone du cortex visuel secondaire, marqué par l'étoile, a révélé des PSCe. Après stimulation photo-déclenchée par balayage laser du canal, des fibres exprimant la channelrodossine dans les couches inférieures de V2, des projections corticothalamiques provenant de la couche VI du cortex somatosensoriel primaire vers le noyau ventropostérieur, ont été étudiées à l'aide d'une approche CRE LAX afin d'exprimer la channelrodossine dans les neurones corticothalamiques de la couche VI et dans leurs projections. Comme prévu, la transfection par un vecteur AAV floxé introduit chez une souris transgénique CRE a entraîné une expression de la channelrodossine dans les neurones ciblés de la couche VI et dans leurs fibres s'étendant vers la couche IV.Des canaux en bâtonnets de Dobson, l'expression d'EYFP a également été observée dans des fibres projetant vers le VP lors d'enregistrements physiologiques à partir d'un neurone du VP. L'utilisation du blocage en configuration whole cell a révélé que des PSC pouvaient être déclenchées suite à une photo-stimulation près du neurone enregistré, marqué par l'étoile. Une analyse hors ligne représente l'amplitude moyenne de la réponse à la photo-stimulation dans le VP. L'examen de tranches résectionnées de 50 microns de neurones cortico-thalamiques de la couche six exprimant le canal Rodin EYFP a révélé un réseau fin de fibres marquées traversant la couche six vers la couche quatre, où elles se terminent et s'arborisent de manière extensive.En outre, des fibres corticothalamiques ont été observées pénétrant dans la substance blanche et se dirigeant vers le thalamus. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'appliquer des techniques optogénétiques modernes pour photo-stimuler des voies neuronales ciblées dans des préparations de tranches in vitro. N'oubliez pas que le travail avec des lasers peut être extrêmement dangereux lors de la réalisation des étapes d'étalonnage associées à cette procédure.Portez des lunettes de protection.

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Injections stéréotaxiques intracérébrales in vivo pour la stimulation optogénétique des entrées à longue portée dans les tranches de cerveau de souris

Avec la manipulation optogénétique de populations neuronales spécifiques ou de régions du cerveau, le comportement peut être modifié avec une résolution temporelle et spatiale élevée chez les animaux en mouvement libre. En utilisant différents outils optogénétiques en combinaison avec des fibres optiques implantées chroniquement, une variété de modulations neuronales et de tests comportementaux peuvent être effectuées.

Manipulation optogénétique de l’activité neuronale pour moduler le comportement chez les souris en mouvement libre

Telle qu’elle est actuellement mise en œuvre, l’optogénétique chez les primates non humains nécessite l’injection de vecteurs viraux dans le cerveau. Une méthode d’injection optimale doit être fiable et, pour de nombreuses applications, capable de cibler des sites individuels de profondeur arbitraire qui sont facilement et sans ambiguïté identifiés en histologie post-mortem. Une méthode d’injection avec ces propriétés est présentée.

Injections de vecteurs AAV pour l’optogénétique dans le cerveau de primates non humains anesthésiés et éveillés

Les méthodes décrites ici décrivent une procédure utilisée pour inverser optogénétiquement la plasticité induite par la cocaïne dans un circuit comportementalement pertinent chez le rat. La stimulation optique soutenue à basse fréquence des synapses thalamo-amygdales induit une dépression à long terme (LTD). La DLT optogénétique in vivo induite chez des rats ayant consommé de la cocaïne a entraîné une atténuation subséquente de la recherche de drogue motivée par des signaux.

Utilisation de l’optogénétique pour inverser la neuroplasticité et inhiber la recherche de cocaïne chez le rat

Ici, nous présentons deux protocoles d’enregistrement par micro-électrocorticographie à haute densité (μEcoG) chez le rat et la souris, y compris les méthodes chirurgicales, d’implantation et d’enregistrement. Les enregistrements μECoG sont effectués en combinaison avec l’enregistrement de polytrodes laminaires dans le cortex auditif du rat ou avec la manipulation optogénétique de l’activité neuronale dans le cortex somatosensoriel de la souris.

Études multi-échelles du traitement cortical par intégration de polytrodes laminaires et d’optogénétique avec micro-électrocorticographie chez les rongeurs

Découvrez la photostimulation laser de circuits cérébraux antérieurs par optogénétique in vitro. Cette méthode permet d'évaluer la topographie fonctionnelle et les propriétés synaptiques des circuits neuronaux avec précision.

Photostimulation par balayage laser de circuits du cerveau antérieur ciblés optogénétiquement

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