Stimulation à courant continu et multi-réseau d'électrodes d'enregistrement de la capture comme activité chez la souris Cerveau Slice Préparation

L'objectif général de cette procédure expérimentale est d'évaluer la disposition des électrodes dans la chambre d'enregistrement permettant une stimulation par courant continu d'une coupe cérébrale et ses effets sur l'activité de type épileptique enregistrée à l'aide d'une matrice multielectrodes. Cela peut aider à répondre à des questions clés concernant la stimulation par courant continu et l'enregistrement d'activités de type épileptique au moyen d'une matrice multielectrodes sur des tranches de cerveau de souris. Un avantage de cette technique est que les effets de la stimulation par courant continu peuvent être évalués dans une voie spécifique de la tranche cérébrale de souris.

La procédure sera démontrée par Hsiang Chin et Wei-Jen Chang, techniciens de mon laboratoire. Dans cette procédure, stérilisez tous les instruments chirurgicaux avec une solution d'éthanol à 75 % avant l'expérience. Ensuite, exposez le crâne de l'animal et retirez les muscles résiduels.

Ensuite, détacher la surface dorsale du crâne à l’aide de rongeurs et découper les côtés. Puis, à l’aide d’une spatule, sectionner les bulbes olfactifs et les connexions nerveuses le long de la surface ventrale du cerveau avant de l’extraire. Transférer rapidement le cerveau dans un bécher rempli d’ACSF glacée, oxygénée et saturée en oxygène.

Pour préparer des tranches contenant la voie MT-ACC, effectuez une coupe sagittale située à 2 mm latéralement par rapport à la ligne médiane dans chaque hémisphère, afin de visualiser l'anatomie sous-corticale. Ensuite, réalisez une coupe transversale angulée parallèlement au faisceau de fibres visible dans le striatum. Effectuez la deuxième coupe transversale angulée depuis la connexion entre le cervelet et le cortex visuel jusqu'au point médian entre la commissure antérieure et le tractus optique, situés en position ventrale et parallèlement à la voie cingulée du thalamus.

Ensuite, fixez le bloc de cerveau sur une plaque angulaire à l’aide d’un adhésif cyanoacrylate. Effectuez une incision juste au-dessus du point de virage du trajet. Ensuite, dépliez la plaque, aplatissez-la et collez-la sur la platine de la chambre d’un vibratome.

Ensuite, sectionnez les tranches de cerveau à une épaisseur de 500 micromètres et conservez-les dans du ACSF glacé et oxygéné. Transférez une tranche dans la chambre d’enregistrement à 32 degrés Celsius avec une perfusion continue de ACSF oxygéné pendant une heure. Vérifiez le positionnement d'une sonde MEA sur le système multicanal.

Utilisez un tube pour diriger l'ACSF dans la chambre MEA et l'autre tube pour en diriger l'écoulement hors de la chambre. Perfusez continuellement le prélèvement avec de l'ACSF chaud et oxygéné à 30 degrés Celsius. À l’aide d’un coton-tige humide, transférez une tranche de cerveau vers la MEA.

Déplacez soigneusement la tranche de cerveau de manière à positionner le cortex cingulaire antérieur (ACC) au-dessus des électrodes, puis stabilisez la tranche de cerveau à l’aide d’un ancrage pour garantir une bonne connexion électrique entre la tranche et les électrodes. Ensuite, placez l’électrode anodique à proximité du cortex cingulaire antérieur (ACC) et l’électrode cathodique à distance du cortex cingulaire antérieur (ACC). Enregistrez l’intensité du champ selon les deux orientations du champ de la MEA.

Ensuite, appliquez les courants électriques à l’aide d’un stimulateur. Réglez la distance entre les deux électrodes en chlorure d’argent à environ 1,5 à 2 cm et ajustez l’intensité du courant du stimulateur de manière à obtenir un DCS compris entre 0,5 et 2 milliampères. Dans cette procédure, placez une électrode en tungstène dans le MT et appliquez des impulsions provenant du stimulateur à la région thalamique de la coupe.

Ensuite, utilisez différentes intensités de courant pour déterminer le seuil provoquant une réponse du cortex cingulaire antérieur (ACC). Déplacez l'électrode en tungstène le long de la voie thalamo-cingulaire afin d'obtenir un profil de réponse optimal. Enregistrez 1 à 20 réponses de l'ACC et utilisez le logiciel pour moyenner automatiquement l'ensemble des réponses de l'ACC induites par la stimulation du MT.

Pour induire une activité semblable à une crise, ajouter 250 micromolaire de 48P et 5 micromolaire de bicuculline à la solution de perfusion, puis continuer à perfuser la coupe pendant deux à trois heures. Maintenir la pompe à un débit de perfusion relativement rapide, ce qui peut aider à prévenir la formation d'un gradient de pH. Ensuite, placer l'électrode en tungstène au niveau du MT et appliquer une stimulation électrique afin d'obtenir un profil de réponse du cortex cingulaire antérieur.

Enregistrez 10 à 20 balayages et faites la moyenne des réponses. Ensuite, remplacez la solution de préfusion par du LCR frais afin de laver les médicaments. Au cours de cette procédure, assurez-vous de générer des champs électriques uniformes en faisant passer un courant entre deux fils en argent revêtus de chlorure d'argent, placés parallèlement à l'intérieur de la chambre MEA.

S'il n'y a pas de problème, le DCS doit rester compris entre 0,5 et 2 milliampères. Ensuite, éteignez le DCS et stimulez le thalamus à l'aide d'une électrode en tungstène. Pour obtenir des réponses synaptiques maximales dans le cortex cingulaire antérieur, enregistrez 10 à 20 réponses, puis faites-en la moyenne.

Ensuite, allumez le DCS et stimulez simultanément le thalamus. Évaluez les changements d'amplitude de la réponse du cortex cingulaire antérieur induite par la stimulation thalamique pendant le DCS. Maintenant, éteignez le DCS, ajoutez 250 micromolaire de 48P et 5 micromolaire de bicuculline à la solution de perfusion, puis attendez 2 à 3 heures.

Si les médicaments affectent la tranche cérébrale, celle-ci devrait produire des réponses épileptiques corticales. Ensuite, enregistrez 10 à 20 réponses corticales du cortex cingulaire antérieur et mesurez l'amplitude et la durée des réponses épileptiques corticales évoquées électriquement. Puis, allumez la DCS et stimulez simultanément le thalamus.

Évaluer les changements d'amplitude et de durée des réponses corticales évoquées par les crises pendant l'application de la DCS. Ensuite, remplacer la solution de perfusion par de l'ACSF fraîche afin de laver les médicaments. Cette figure montre différentes réponses évoquées, incluant les réponses évoquées par la stimulation thalamique dans le ACC, l'activité de type crise induite par les médicaments, ainsi que l'activité de type crise induite à la fois par la stimulation thalamique et par les médicaments.

Cette figure illustre l'effet de différentes orientations en DCS, telles que différentes orientations dans le champ électrique, les réponses évoquées par la stimulation thalamique avec DCS, et l'effet de la DCS cathodique sur l'activité de type crise. Dans cette figure, 15 minutes de DCS cathodique ont montré qu'elles induisaient efficacement une dépression à long terme et réduisaient les réponses évoquées. La durée des crises a été significativement diminuée après 15 minutes de DCS cathodique par rapport à l'absence d'application de DCS.

plus rapide, cela peut techniquement être réalisé en quatre heures si la procédure est correctement effectuée. Après cette étape, d'autres interventions, telles que la stimulation magnétique transcrânienne, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme proposer des approches non invasives pour contrôler les crises résistantes. Grâce à ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs spécialisés dans les thérapies non invasives pour explorer des traitements contre les crises dans des modèles animaux.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser la stimulation électrique pour évaluer l'activité de type crise dans des tranches de cerveau.