Name: Coculture Assays pour étudier macrophage et microglie Stimulation de glioblastome Invasion (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Découvrez les essais de coculture pour étudier l'invasion du glioblastome stimulée par les macrophages et la microglie. Cette méthode in vitro permet d'évaluer les interactions tumorales et d'identifier des traitements potentiels.

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Nous tenons à remercier le Dr Konstantin Dobrenis d’avoir fourni une microglie murine pour ces études.

1. Le marquage fluorescent des cellules Des lignées de cellules de glioblastome étiquettes et microglie avec des colorants fluorescents 9: NOTE. En variante, générer des lignées cellulaires qui expriment constitutivement les protéines fluorescentes telles que la GFP / DP comme décrit dans le 14. <ol><li> cellules de la plaque sur une plaque à 6 puits de telle sorte qu&#39;ils seront 70 - 80% de confluence le jour de la coloration. Pour la lignée murine de cellules de glioblastome GL261 et cellules de glioblastome ligne U87 humaine, plaque 1 x 10 6 et 1,5 x 10 6 cellules, respectivement sur une boîte de 6 cm 24 heures avant la coloration. </li><li> Préparer la solution de colorant fluorescent tache de cellules dans du DMSO et ajouter 5 uM de colorant aux médias, soit rpmi (RPMI) ou macrophage milieu sans sérum (MSFM), vortex bien. </li><li> Incuber les cellules avec le colorant pendant 30 min à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Retirez le support contenant des colorants et ajouter du milieu frais (RPMI ou MSFM) aux cellules. </li><li> Incuber les cellules pendant 30 min. Note: Les cellules sont désormaisteinté et prêt à être utilisé dans l&#39;expérience. </li></ol> 2. Dosage prélaqué Matrice chambre coculture Invasion <ol><li> Différencier cellules THP-1 en utilisant l&#39; acétate de phorbol myristate (PMA) 15. <ol><li> Planche 2 - 3 x 10 5 cellules THP-1 dans 1,5 ml de RPMI / 10% de FBS dans une plaque de culture 6 puits. Immédiatement après le placage ajouter 100 nM de PMA et incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 48 heures. NOTE: Après 48 h, THP-1 cellules qui ont subi avec succès la différenciation seront adhérentes et se propager au fond du puits prenant une morphologie ronde. </li><li> Retirer PMA par lavage une fois avec PBS 1x et remplacer avec des produits frais RPMI / 10% de FBS. Attendre une autre 48 heures jusqu&#39;à ce que les cellules sont prêtes à l&#39;emploi dans le test. </li></ol></li><li> Equilibrer la matrice des chambres de pré-revêtues en les plaçant dans un puits contenant 500 ul de milieu seul (sans sérum) et en ajoutant 500 ul de milieu seul vers le haut. Incuber les chambres pendant 2 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. <br/&gt; NOTE: chambres pré-revêtues ont été achetées auprès du fabricant; voir le tableau des matériaux / équipement. </li><li> Pour les cellules (lignées cellulaires de glioblastome marquées par fluorescence et les microglie / macrophages) détacher doucement, retirer les supports des cellules par aspiration. Laver les cellules sur le plat avec 2 mM EDTA / PBS. Ajouter 500 ul de 2 mM d&#39; EDTA / PBS et incubation pendant 5 - 10 min dans un incubateur de cellules à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Resuspendre les cellules dans 5 ml de milieu contenant 0,3% de sérumalbumine bovine (BSA). </li><li> Centrifuger pendant 5 min à 120 x g. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans MSFM / 0,3% de milieu de BSA (pour les cellules de GL261 et la microglie) ou RPMI / 0,3% de SAB (pour U87 et cellules THP-1) , de telle sorte que la concentration des cellules est égale à 1 x 10 6 cellules / ml . Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules. </li><li> Ajouter 500 ul media / 0,3% de BSA par puits de plaque à 24 puits. </li><li> Retirez le support de chambres qui ont été équilibrées pendant au moins 2 h (étape 2.2). Lieu chambers en puits contenant 500 ul media / 0,3% de BSA (étape 2.7). </li><li> Si les inhibiteurs sont utilisés pour étudier leur effet sur macrophage / microglie stimulé l&#39;invasion de gliome, ajouter la concentration appropriée à la fois le fond et les parties supérieures de la chambre. NOTE: Les concentrations de CSF-1R inhibiteur utilisé pour inhiber totalement la microglie stimulée GL261 glioblastome invasion peut être trouvée dans la référence 9. </li><li> Selon les lignées cellulaires utilisées, ajouter des cellules à la chambre supérieure comme décrit dans les deux étapes suivantes: glioblastome de la souris (2.10.1) et glioblastome humain (2.10.2). <ol><li> Mélanger 1,5 x 10 5 GL261 (glioblastome) cellules (150 pi) et 5 x 10 4 microglies de souris (50 pi) (voir l&#39; étape 2.6 pour plus de détails dans les médias). Amener le volume à 500 pi en ajoutant 300 ul MSFM / 0,3% de BSA. Ajouter le mélange de cellules dans la chambre supérieure et faire incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 48 heures. NOTE: microglie murin sont isolées à partir de souris néonatales comme décrit in 1 6. </li></ol></li></ol> Mélanger 7,5 x 10 4 U87 (glioblastomes) des cellules (75 pi) et 2,5 x 10 4 THP1 (macrophage) des cellules (25 pi). Amener le volume dans 500 ul en ajoutant 400 pl RPMI / 0,3% de BSA. Ajouter le mélange de cellules à la chambre supérieure. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 24 heures. <ol><li> Après incubation, éliminer les cellules du haut de la chambre par aspiration douce et fixer des chambres en plaçant dans 3,7% de formaldéhyde dans du PBS. Les chambres permettent de rester dans un fixatif pendant 15 min à température ambiante (ou pendant une nuit à 4 ° C). Retirer fixateur par aspiration douce et le remplacer par 500 ul 1x PBS. Passez à la section 4 pour l&#39;analyse d&#39;image. NOTE: L&#39;expérience peut être interrompue à ce moment et enregistré pour l&#39;imagerie dans PBS 1x. des signaux de colorant fluorescent peut être détectée pendant jusqu&#39;à 2 semaines après la fixation. </li></ol> 3. Invasion Assay &quot;3D&quot; -embedding gliome et Macrophages / microglie dans Matrix <ol><li>Décongeler mélange de matrice à 4 ° C pendant une nuit. Effectuer toutes autres manipulations à l&#39;aide de la matrice sur la glace dans la hotte. </li><li> Préparer 10 mg / ml de concentration de la matrice dans les médias (MSFM ou RPMI) avec 0,3% de BSA sur la glace. NOTE: la concentration du stock de matrice est généralement autour de 15 mg / ml. </li><li> Pour préparer les cellules (marquées à l&#39;étape 1) de suspension dans la matrice, retirer les supports des cellules par aspiration. Laver les cellules sur le plat avec 2 mM EDTA / PBS. Ajouter 500 ul de 2 mM d&#39; EDTA / PBS aux cellules et incuber pendant 5 - 10 min dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Resuspendre les cellules dans 5 ml de milieu contenant 0,3% de BSA. </li><li> Centrifuger pendant 5 min à 120 x g. </li><li> Aspirer le surnageant de pastille. Resuspendre le culot dans du milieu / 0,3% de BSA , de telle sorte que la concentration des cellules est égale à 1 x 10 6 cellules / ml. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules. </li><li> Ajouter 1,5 x 10 5 cellules GL261 (dans 150 ul) + 5 x 10 4 cellules microgliales (dans 50 ul) dans un tube de 1,5 ml.Ajouter 2 x 10 5 cellules GL261 (200 pi) dans un tube de 1,5 ml microfuge séparé. NOTE: les cellules GL261 seul sans microglie sert de contrôle. </li><li> cellules de spin dans microcentrifugeuse pendant 5 min à 120 x g. </li><li> Resuspendre les cellules dans 200 pi matrice froide sur la glace. </li><li> 50 ul de la plaque (50.000 cellules) sur le centre du compartiment supérieur de la chambre 8 pm de taille de pore insert. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 30 minutes pour la polymérisation de se produire. </li><li> Ajouter du milieu sans sérum 200 ul de la chambre supérieure et contenant un milieu de croissance cellulaire 700 ul de sérum dans le puits inférieur. </li><li> Incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 48 heures. </li><li> Après incubation, éliminer les cellules du haut de la chambre par aspiration douce et fixer des chambres en plaçant dans 3,7% de formaldéhyde dans du PBS. Les chambres permettent de rester dans un fixatif pendant 15 min à température ambiante (ou pendant une nuit à 4 ° C). Retirer fixateur par aspiration douce et le remplacer par 500 ul 1x PBS. Passez à la section 4 foanalyse de l&#39;image r. </li></ol> 4. Imagerie Assays <ol><li> Retirer les chambres de 3,7% de formaldéhyde et laver à puits contenant 500 ul frais 1x PBS. REMARQUE: Ne laissez pas les chambres à sécher. </li><li> L&#39;aide d&#39;un coton-tige, nettoyer doucement les cellules non-invasives de la partie supérieure du filtre (côté tourné vers l&#39;intérieur de la chambre), en grattant la surface du filtre. Commencez doucement et augmenter progressivement la pression. Pour ce faire, au moins 3 fois par chambre. </li><li> Placez chambres soit dans un plat à fond de verre ou de laisser dans une plaque 24 puits. </li><li> Placer l&#39; échantillon sur la scène d&#39;un épifluorescence ou laser confocal microscope à fluorescence équipé d&#39; une caméra et la capture d&#39; image logiciel 9,10. </li><li> Prenez plusieurs 10X ou 20X images de champs représentatifs. </li><li> En utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image, comme ImageJ, compter le nombre de cellules de glioblastome qui ont traversé le filtre sur le côté inférieur 9,10. </li><li> Si l&#39;imagerie de la &quot;3D. &quot;Essai d&#39;invasion (décrit dans la section 3), générer une série Z de pile à l&#39; aide d&#39; un laser fluorescent microscope confocal 5-6 Pour l&#39; image de la population cellulaire invasive sur la face inférieure du filtre, suivez les étapes du protocole 04/02 à 04/06 décrit ci - dessus. </li></ol>

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<li>Dobrenis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+cell+culture+and+in+transplantation+therapy+for+central+nervous+system+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease.</a> Methods. 16 (3), 320-344 (1998).</li>
<li>Coniglio, S. J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+microglia+stimulated+glioblastoma+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion.</a> Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).</li>
<li>See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+regulatory+T+cells+and+microglia+in+glioblastoma-associated+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression.</a> J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La nature hautement invasive des astrocytomes de haut grade et glioblastome rendre ces cancers du cerveau très meurtrière. Il est donc d&#39;une importance primordiale pour comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de l&#39;invasion de glioblastome. On a beaucoup appris sur le processus de glioblastome invasion déjà 17. En utilisant les formats d&#39;analyse détaillés dans ce document, notre laboratoire a montré à la fois la souris et des modèles humains que les macrophages associés aux tumeurs pe...

Le glioblastome multiforme est un cancer du cerveau humain agressif avec une survie médiane d&#39;environ 12 mois à partir du moment du diagnostic 1,2. Glioblastome est l&#39;un des cancers les plus mortels et cliniquement difficile car il est réfractaire à une chimiothérapie standard et la résection chirurgicale. Le caractère diffus de glioblastome permet aux cellules tumorales de se propager dans le cerveau normal rendant la tumeur avancée pratiquement impossible de chirurgicalement réséquer complètement. Cet aspect très invasive est une caractéristique marque de glioblastome et d&#39;autres astrocytomes avancées. Par conséquent, l&#39;objet de beaucoup de recherches a été mis sur le mécanisme moléculaire de l&#39;invasion des cellules de glioblastome. Le microenvironnement glioblastome tumorale joue un rôle essentiel dans l&#39; établissement d&#39;une tumeur maligne 3-6. Tumeur associée macrophages / microglie se sont révélés être responsable de la promotion glioblastome invasion 7,8. La plupart de ces études ont cependant mesuré l&#39;effet des macrophages / microglie utilisantdes essais qui les séparent physiquement à partir des cellules de glioblastome. Notre laboratoire a défini pour générer des tests améliorés qui nous permettent d&#39;étudier la façon dont l&#39;invasion de glioblastome dépend de macrophages / microglie dans cocultures et nous permettent à l&#39;image de l&#39;interaction physique entre eux lors de l&#39;invasion. tests classiques pour mesurer l&#39;invasion des cellules comprennent les Boyden chimiotaxie &quot;standard&quot; de la chambre et les formats de chemoinvasion. Ici, les cellules à étudier sont plaquées dans une chambre en matière plastique qui contient un filtre en polycarbonate sur le fond qui comporte des pores d&#39;une taille donnée (généralement comprise entre 0,4 et 8 um de diamètre). Le processus d&#39;invasion cellulaire implique une barrière physique, habituellement composé de protéines de la matrice extracellulaire. Dans l&#39;essai de chemoinvasion, la matrice utilisée est préférée Matrigel (ci-après dénommée «matrice»), un mélange de protéines de la matrice extracellulaire sécrétée par Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) des cellules de sarcome de souris et se compose essentiellement de colType lagen IV et la laminine. Les chambres sont ensuite placées dans une culture bien de tissu qui contient des milieux de culture de cellules avec ou sans facteurs de croissance qui sont soupçonnés de stimuler l&#39;invasion. Les cellules qui ont une capacité d&#39;invasion ultérieure va envahir à travers la matrice extracellulaire filtre revêtu à une fréquence supérieure et adhèrent à la face inférieure du filtre. Nous avons modifié cet essai afin d&#39;évaluer le rôle de la microglie et des macrophages associés à une tumeur sur l&#39;invasion des cellules de glioblastome. Nous avons été en mesure de déterminer en utilisant des tests de coculture décrits dans le présent document que les microglies peuvent stimuler l&#39;invasion de deux lignées de cellules de glioblastome par 5-10 fois 9,10. Cela reflète ce que l&#39;on observe dans les modèles animaux de glioblastome. En outre, nous avons développé un essai de trois invasion dimensions où les interactions entre les cellules de glioblastome et les macrophages / microglie peuvent être examinés plus directement. L&#39;étendue de l&#39;invasion des cellules stimulées par le glioblastome macrophaGes / microglie dans le test 3D est comparable à ce qui est vu en utilisant l&#39;approche de la chambre de matrice recouverte. Des essais similaires ont déjà été mis au point pour étudier les interactions de carcinome du sein avec les macrophages lors de l&#39; invasion 11-13. Les deux procédés décrits dans le présent document devraient contribuer à la capacité à disséquer les mécanismes moléculaires (s) de macrophages / microglies invasion stimulée par des cellules de glioblastome.

<table><tbody><tr><td>Chambre d’invasion Corning BioCoat Matrigel : avec matrice BD Matrigel</td><td>Corning/Fisher Scientific</td><td>Chat : 354481</td><td></td></tr><tr><td>Milieu sans sérum de macrophage (MSFM) (500 ml)</td><td>Life Technologies</td><td>12065-074</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red CMTPX Dye</td><td>Life Technologies/Sondes moléculaires</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Life Technologies/Sondes moléculaires</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>Lignée cellulaire GL261</td><td>National Cancer Institute (NCI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U87 Lignée cellulaire</td><td>American Tissue Type Culture Collection</td><td>HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 Lignée cellulaire</td><td>American Tissue Type Culture Collection</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (500 ml)</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Inserts de culture cellulaire à membrane polycarbonate Corning Transwell (8 & micro ; M pore) 48 par paquet.</td><td>Corning</td><td>CLS3422</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Matrice de culture 3D Facteur de croissance réduit Extrait de membrane basale, PathClear</td><td>Trevigen</td><td>3445-005-01</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>Cat : 10500064</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin Albumine, fraction V, Traité par choc</td><td>thermique Fisherscientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>0,5 m EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8139-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

coculture assays pour étudier macrophage et microglie stimulation de glioblastome invasion

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Le glioblastome multiforme (grade IV gliome) est un cancer très agressif humain avec une survie médiane de diagnostic 1 an après. En dépit de la meilleure compréhension des événements moléculaires qui donnent lieu à des glioblastomes, ce cancer reste encore très réfractaire au traitement conventionnel. La résection chirurgicale des tumeurs cérébrales de haut grade est rarement complète en raison de la nature hautement infiltrant des cellules de glioblastome. Les approches thérapeutiques qui atténuent l&#39;invasion des cellules de glioblastome est donc une option intéressante. Notre laboratoire et d&#39;autres ont montré que la tumeur des macrophages et des cellules microgliales (macrophages résidents du cerveau) stimulent fortement l&#39;invasion de glioblastome sont associés. Le protocole décrit dans le présent document est utilisé pour modéliser le glioblastome-macrophage / microglie interaction en utilisant des tests de culture in vitro. Cette approche peut grandement faciliter le développement et / ou la découverte de médicaments qui perturbent la communication avec les macrophages qui permet à cette behav maligneIOR. Nous avons établi deux essais d&#39;invasion de coculture robustes où microglie / macrophages stimulent l&#39;invasion des cellules de gliome par 5-10 fois. les cellules de glioblastome marquées avec un marqueur fluorescent ou exprimant constitutivement une protéine fluorescente sont plaquées sans et avec les macrophages / microglie en polycarbonate inserts de chambre de matrice revêtue ou enrobée dans une matrice à trois dimensions. L&#39;invasion cellulaire est évaluée en utilisant la microscopie de fluorescence à l&#39;image et compter uniquement les cellules invasives sur le côté inférieur du filtre. L&#39;utilisation de ces essais, plusieurs inhibiteurs pharmacologiques (JNJ-28312141, PLX3397, géfitinib et Semapimod), ont été identifiés qui bloquent les macrophages / microglie stimulé l&#39;invasion de glioblastome.

En utilisant les méthodes décrites ici, nous avons montré que la microglie et les macrophages peuvent stimuler considérablement l&#39;invasion des cellules de glioblastome. Deux tests d&#39;invasion différents sont utilisés et sont représentés sur la figure 1. Sur la figure 2, les cellules qui expriment constitutivement GL261 la protéine fluorescente mCherry ont été étalées sur des chambres de pré-enduit avec ou sans microglie pendant 48 heures. cellules...

Pour comprendre le comportement malin du cancer, il faut créer des modèles précis de la façon dont les cellules tumorales interagissent avec les composants du microenvironnement tumoral, tels que les macrophages. Ici, nous décrivons deux méthodes pour étudier l’interaction des cellules de glioblastome avec les macrophages associés aux tumeurs et la microglie où l’effet sur l’invasion du glioblastome est évalué.

Coculture Assays pour étudier macrophage et microglie Stimulation de glioblastome Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

L'objectif général de cette expérience est de modéliser l'interaction entre les cellules de glioblastome et les microglies ainsi que les macrophages durant l'invasion, dans un test in vitro. Cette méthode peut donc aider à répondre à des questions clés dans le domaine du microenvironnement tumoral, telles que quels composés ou traitements peuvent interférer avec l'interaction du cancer avec les macrophages, un type cellulaire du microenvironnement durant la progression vers la malignité. L'un des principaux avantages de cette technique est qu'elle est relativement facile à réaliser, peut être menée en un temps raisonnable et semble modéliser fidèlement l'invasion du glioblastome in vivo.Commencez par différencier la lignée cellulaire d'intérêt à l'aide de myristate d'acétate de phorbol, comme suit. Dans un premier temps, ensemencez deux à trois fois 10 puissance 5 cellules THP-1 dans 1,5 millilitre de milieu dans une plaque de culture à six puits. Immédiatement après l'ensemencement, ajoutez 100 nanomolaires de PMA et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % CO2 pendant 48 heures.Après 48 heures, retirez le PMA en aspirant le milieu, rincez une fois avec du PBS 1X et ajoutez du milieu frais. Incubez pendant encore 48 heures jusqu'à ce que les cellules soient prêtes à être utilisées dans le test. Ensuite, équilibrez les chambres pré-recouvertes de matrice en les plaçant dans un puits contenant 500 microlitres de milieu sans sérum, puis ajoutez 500 microlitres de milieu sans sérum dans la partie supérieure.Incuber les chambres pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % CO₂. Ensuite, aspirer délicatement le milieu des récipients de culture contenant les lignées cellulaires de glioblastome marquées au fluorochrome ainsi que les microglies et les macrophages. Puis ajouter 500 microlitres de PBS contenant 2 millimolaire de EDTA et incuber de cinq à dix minutes dans l’incubateur de culture tissulaire.Recueillir les cellules dans cinq millilitres de milieu contenant 0,3 % d'albumine sérique bovine et centrifuger pendant cinq minutes à 120 × g. Après la centrifugation, aspirer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans le milieu approprié à une concentration de 1 × 10⁶ cellules par millilitre. Utiliser un hémocytomètre pour dénombrer les cellules. Ensuite, ajouter 500 microlitres du milieu approprié contenant 0,3 % de BSA dans les puits d'une plaque de 24 puits.Ensuite, retirez le milieu des chambres équilibrées et placez les chambres dans les puits de la plaque 24 puits. Si des inhibiteurs sont utilisés pour étudier leur effet sur l'invasion du gliome stimulée par les macrophages ou les microglies, ajoutez la concentration appropriée dans les compartiments inférieur et supérieur de la chambre. Selon la lignée cellulaire utilisée, mélangez les cellules de glioblastome et les microglies de souris, ou les cellules de gliome et les cellules macrophages, conformément aux détails indiqués dans la partie écrite du protocole.Ajouter le mélange cellulaire dans la chambre supérieure et incuber de 24 à 48 heures, selon le type cellulaire. Après l'incubation, retirer les cellules situées en haut de la chambre par aspiration douce. Ensuite, placer les chambres dans du formaldéhyde à 3,7 % dans du PBS pour fixation.Laisser les chambres dans le fixateur pendant 15 minutes à température ambiante. Enfin, éliminer délicatement le fixateur par aspiration et remplacer par 500 microlitres de PBS à un-X. Tout d'abord, décongeler le mélange matriciel à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Ensuite, préparez une concentration de 10 milligrammes par millilitre de matrice dans le milieu approprié sur de la glace. Puis, récoltez les cellules marquées pour suspension dans la matrice comme indiqué précédemment. Ensuite, pipetez 1,5 fois 10 à la puissance 5 cellules GL261 dans un volume de 150 microlitres ainsi que 5 fois 10 à la puissance 4 cellules de microglie dans 50 microlitres dans un tube microfuge de 1,5 millilitre.Ajoutez deux fois 10 puissance 5 cellules GL261 dans un volume de 200 microlitres dans un tube microfuge séparé de 1,5 millilitre. Faites centrifuger les cellules dans un microfuge pendant cinq minutes à 120 fois g. Ensuite, remettez en suspension les cellules dans 200 microlitres de matrice froide sur de la glace. Pour cette étape, il est crucial d'avoir un bac à glace prêt dans la hotte, de garder les tubes sur de la glace, les pointes au réfrigérateur, et de s'assurer que tout soit refroidi afin d'éviter la polymérisation prématurée du gel mature.Après la resuspension, déposez 50 000 cellules en un volume de 50 microlitres au centre du compartiment supérieur d'un insert de chambre ayant des pores de huit micromètres. Incubez ensuite à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes afin de permettre la polymérisation. Après 30 minutes, ajoutez 200 microlitres de milieu sans sérum dans la chambre supérieure et 700 microlitres de milieu de croissance cellulaire contenant du sérum dans le puits inférieur.Après une incubation de 48 heures, retirez les cellules situées dans la partie supérieure de la chambre par aspiration douce. Fixez les chambres comme précédemment, puis remplacez le fixateur par 500 microlitres de PBS 1X avant d'observer les cellules. Cette image représentative montre des cellules GL261 exprimant mCherry en invasion en l'absence de microglie.Les cellules ont été ensemencées dans des chambres recouvertes de matrice et incubées pendant 48 heures. Les images ont été prises avec un objectif 10X et l'échelle représente 400 microns. Ici, les cellules GL261 ont été associées à des microglies.Le nombre de cellules GL261 invasives ayant traversé le filtre a été quantifié. Comme on le voit ici, la culture mixte de la lignée cellulaire de glioblastome murin GL261 avec des microglies augmente son invasion jusqu'à 10 fois dans le test en 2D. Cette image montre l'effet d'inhibiteurs pharmacologiques sur l'invasion de GL261 stimulée par les microglies, comparée au témoin DMSO.Les données présentées proviennent de six expériences indépendantes. Cet essai a également été utilisé avec succès avec des lignées cellulaires humaines. Des cellules U87 ensemencées dans des chambres revêtues de matrice et colorées avec le CMFDA vert sont montrées après une incubation de 24 heures.Ici, les cellules U87 ont été mises en culture avec des macrophages THP1 différenciés. Cette image montre la quantification de l'essai, en comptant uniquement les cellules U87 invasives. La lignée cellulaire humaine de macrophages THP1 stimule l'invasion des cellules de glioblastome U87.Les données présentées correspondent aux valeurs moyennes obtenues à partir de 10 expériences indépendantes. Cette image issue d'un test d'invasion en 3D d'une coculture de GL261 et de microglies est un composé provenant d'une série Z d'images et montre des cellules GL261 marquées en vert avec CMFDA intégrées dans la matrice uniquement. Ici, les cellules GL261 ont été cultivées en coculture avec des microglies murines marquées en rouge avec CMPTX.Ici, les cellules GL261 situées sur la face inférieure du filtre, considérées comme invasives, sont illustrées. Le nombre total de cellules GL261 envahissantes a été déterminé et normalisé par rapport à celui des cellules GL261 en monoculture. Les données présentées représentent la moyenne de trois expériences indépendantes réalisées en double. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée de bout en bout en environ deux heures. Les résultats finaux de l'expérience peuvent être obtenus après 48 heures. Lors de l'exécution de cette technique, il est très important que tout soit refroidi et à quatre degrés, y compris les tubes et les pipettes.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'établir des glioblastomes dans des tests d'invasion en coculture macrophage-microglie.

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