Calcification vasculaire des cellules musculaires lisses et imagerie de Aortic calcification et Inflammation

L'objectif général de cette procédure est de visualiser ex vivo la calcification vasculaire aortique et de modéliser in vivo la calcification vasculaire à l'aide de cellules musculaires lisses aortiques primaires murines en culture. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie des maladies vasculaires en fournissant un modèle in vitro pour étudier les mécanismes moléculaires de la calcification vasculaire et en permettant l'évaluation de la calcification vasculaire et de l'inflammation des macrophages in vivo. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet une quantification sensible et la co-localisation de l'activité des macrophages avec les dépôts de calcium dans les lésions athéroscléreuses, même aux stades précoces de la maladie.

En plus de Caitlin et moi-même, cette procédure sera démontrée par Robert Tainsh, un technicien de notre laboratoire. Pour commencer cette procédure, désinfectez la queue à l’aide d’un tampon imbibé d’alcool et repérez les veines latérales de la queue. Ensuite, appliquez une légère pression vers l’avant sur la seringue tandis qu’une aiguille de calibre 30 est introduite dans la queue sans résistance.

Ensuite, injecter 100 microlitres de calcium NIR et/ou 100 microlitres de cathepsine NIR à un débit constant. Retirer l'aiguille après cinq secondes, puis prélever les aortes entre trois et 24 heures après l'injection. Sous un microscope stéréo, enlever le péritoine afin de découvrir les organes abdominaux.

Ensuite, retirez les organes gastro-intestinaux en prenant soin de ne pas sectionner l'aorte. Puis, pratiquez une incision latérale dans le diaphragme antérieur et prolongez l'incision sur toute la longueur de l'abdomen. À l'aide de ciseaux de dissection, libérez la cage thoracique en coupant les côtés des côtes et en retirant les tissus mous adhérents à la partie supérieure du sternum.

Ensuite, retirez la cage thoracique et exposez les poumons. Retirez délicatement les poumons. Puis retirez la trachée et l'œsophage avec précaution en veillant à ce que l'aorte reste intacte.

Retirer ensuite les tissus mous entourant l'aorte depuis la bifurcation iliaque jusqu'à l'arc aortique. Faire attention lors du retrait de la graisse péri-aortique. Ensuite, éliminer la graisse résiduelle et les tissus mous entourant l'aorte thoracique et les grosses branches de l'arc aortique.

Ensuite, retirer le thymus. Retirer maintenant le cœur de la cavité thoracique en le détachant soigneusement de l'aorte proximale. Puis sectionner l'aorte distale au niveau de la bifurcation iliaque.

À l’aide d’une aiguille à insuline, injecter du sérum physiologique dans l’aorte à partir de l’arc aortique afin de laver les cellules sanguines résiduelles. Détacher l’aorte ainsi que les vaisseaux de l’arc aortique et la retirer complètement du corps. Placer l’aorte dans une solution de sérum physiologique sur de la glace jusqu’au moment de l’imagerie.

À cette étape, placer les aortes dans du HBSS froid jusqu'à la fin des dissections. Dans une hotte de culture tissulaire stérile, transférer les aortes dans la solution de digestion aortique contenue dans les boîtes de culture tissulaire de 35 × 10 millimètres. Incuber ensuite à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avec un balancement intermittent doux.

Après la digestion, les aortes doivent présenter un aspect étiré ou effiloché. Sous un microscope stéréo, retirez la couche adventice externe d'une aorte tout en conservant la couche médiale intacte. Pour ce faire, décollez la couche externe de l'aorte à une extrémité et retirez-la de la couche médiale sous-jacente comme on enlève une chaussette.

Une fois la couche adventice retirée, incuber l'aorte restante dans une nouvelle boîte de culture avec du milieu de culture cellulaire à 37 degrés Celsius pendant deux à quatre heures. Ensuite, découper l'aorte en anneaux d'un à deux millimètres de large. Transférer les anneaux dans une nouvelle boîte de culture tissulaire contenant une solution de digestion aortique et incuber à 37 degrés Celsius avec un balancement intermittent doux pendant 120 minutes.

Pendant l'incubation, pipetez la solution plusieurs fois vers le haut et vers le bas afin de resuspendre les cellules. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de milieu de culture cellulaire tiède à la solution de digestion et transférez-la dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez le tube pendant cinq minutes à 200 ×g. Aspirez ensuite le milieu et resuspendez les cellules dans le volume souhaité de milieu de culture cellulaire.

Pour induire la calcification dans les cellules musculaires lisses vasculaires, transférez les cellules dans une plaque de culture à six puits et laissez-les adhérer. Ensuite, remplacez le milieu par un milieu de calcification. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant au moins sept jours.

Ensuite, aspirez le milieu de la plaque de culture cellulaire. Lavez les cellules une fois avec de l'eau ionisée. Fixez les cellules en les plaçant dans un millilitre de formol à 10 % à température ambiante pendant 20 minutes.

Ensuite, retirez le formol et lavez les cellules fixées avec de l'eau distillée pendant cinq minutes. Incubez ensuite les cellules dans un millilitre de solution de nitrate d'argent à 5 % sous une ampoule de 60 à 100 watts pendant une à deux heures. Après cela, aspirez la solution de nitrate d'argent et lavez avec de l'eau distillée pendant cinq minutes.

Après cinq minutes, éliminer l'argent non réagi en plaçant les cellules dans un millilitre de solution de thiosulfate de sodium à 5 % dans de l'eau distillée pendant cinq minutes. Ensuite, rincer les cellules avec de l'eau distillée pendant cinq minutes. Les cellules colorées selon la méthode de von Kossa sont désormais prêtes à être observées par microscopie optique inversée classique.

Dans cette figure, des souris de type sauvage, des souris invalidées pour MGP et des souris invalidées pour LDLR ont reçu une injection intraveineuse par la queue de calcium NIR et de Cathepsin NIR, puis leurs aortes ont été prélevées 24 heures plus tard et analysées par imagerie de fluorescence en proche infrarouge. Les souris de type sauvage présentent pratiquement aucune calcification aortique ni présence de macrophages. Les aortes des souris invalidées pour LDLR présentent une calcification étendue qui co-localise avec l'accumulation de macrophages.

En revanche, les souris invalidées pour MGP présentent une calcification aortique survenant en l'absence d'infiltration de macrophages. Dans cette expérience, des VSMC aortiques cultivés ont été isolés à partir de souris invalidées pour MGP et infectés avec un adénovirus exprimant soit GFP, soit MGP. Des VSMC aortiques isolés à partir de souris de type sauvage ont été transfectés soit avec un ARNi contrôle désordonné, soit avec un ARNi ciblant MGP.

Les cellules ont été cultivées dans le milieu de calcification A pendant sept jours, puis fixées et colorées selon la méthode de von Kossa. La coloration du calcium a été quantifiée à l’aide du logiciel ImageJ après soustraction du fond. Après leur mise au point, ces techniques ont permis aux scientifiques d’imager l’athérosclérose et la calcification vasculaire ex vivo.

Et pour modéliser la calcification vasculaire in vitro. Cela ouvre la possibilité de tester les effets de nouveaux traitements médicamenteux sur les maladies vasculaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler des aortes en cellules musculaires lisses vasculaires aortiques primaires de souris, de visualiser les plaques athéroscléreuses à l'aide de sondes d'imagerie fluorescente proche infrarouge et des muscles lisses vasculaires calcifiés in vitro.