A Mimic du microenvironnement de la tumeur: Une méthode simple pour générer des populations de cellules enrichies et enquête intercellulaire Communication

L'objectif général de ce modèle simple de coculture in vitro est de reproduire les caractéristiques d'un microenvironnement tumoral in vivo, d'enrichir des populations cellulaires individuelles et d'étudier divers modes de communication intercellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l'oncologie et de la radiobiologie, notamment concernant les facteurs impliqués dans la formation des fibroblastes associés au cancer et les réponses aux agents thérapeutiques. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à générer des populations cellulaires individuelles à partir d'une culture cellulaire mixte, sans recourir à un marquage fluorescent ou à un tri cellulaire induisant un stress.

Commencez par laver la culture cellulaire d'intérêt deux fois avec cinq millilitres de PBS. Après le deuxième lavage, détachez les cellules à l'aide d'un millilitre de trypsine-EDTA à température ambiante pendant deux minutes à température ambiante. Ensuite, arrêtez la réaction avec neuf millilitres de milieu de croissance complet, en pipetant doucement le milieu sur la surface du flacon 10 fois pour dissocier les cellules.

Après le comptage, diluez les cellules à une concentration de 2,5 × 10⁵ cellules par millilitre dans du milieu frais, puis transférez les cellules dans un tube à centrifuge stérile de 15 millilitres. Centrifugez pour faire précipiter les cellules, puis resuspendez le culot dans du milieu de croissance frais supplémenté avec 50 % de sérum de veau fœtal, à une concentration de 2,5 × 10⁵ cellules par 70 microlitres de milieu. Ensuite, transférez les inserts de taille de pore expérimentale appropriée depuis leur emballage dans des puits individuels d'une plaque multi-puits, puis recouvrez la plaque.

Ensuite, tenant la boîte avec les deux mains, retournez délicatement la boîte jusqu'à ce que les fonds des inserts soient orientés vers le haut. Retirez le fond de la boîte. À l'aide de pinces stériles dans une main, maintenez un insert en place et utilisez l'autre main pour aspirer lentement 70 microlitres de cellules dans une pointe de micropipette.

Ensuite, distribuez lentement les cellules sur la surface de ce qui constitue désormais le côté supérieur de l'insert. Après avoir ensemencé chacun des inserts, remettez soigneusement en place le fond de la boîte et incubez la boîte inversée à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avec humidité pendant 30 à 45 minutes. À la fin de l'incubation, dans une hotte de sécurité biologique à flux laminaire, retournez soigneusement la boîte de manière à ce que les fonds des inserts soient désormais orientés vers le bas.

Ensuite, immergez lentement et soigneusement le fond de chaque insert dans deux millilitres de milieu complet préchauffé, puis replacez la boîte dans l’incubateur humidifié. Après 48 heures, remplacez le milieu dans le fond de chaque puits par deux millilitres de milieu de croissance frais. Une fois le milieu complètement renouvelé, semez 2,5 × 10⁵ cellules de la deuxième population d’intérêt sur la face supérieure des inserts dans un millilitre de milieu frais, puis remettez la boîte dans l’incubateur.

24, 48 et 96 heures plus tard, remplacez le milieu dans la partie supérieure de chaque insert par un millilitre de milieu complet frais. Et le milieu dans la partie inférieure de chaque puits par deux millilitres de milieu complet frais. Après 120 heures de coculture, transférez un insert à la fois dans des boîtes de culture cellulaire individuelles de 35 millimètres contenant un millilitre de PBS.

Et lavez les parties inférieures et supérieures des inserts avec un millilitre de PBS. Pour recueillir les cellules cultivées sur la face inférieure de l'insert, placez les inserts par leur face inférieure dans 200 microlitres de trypsine-EDTA à température ambiante. Après deux minutes à température ambiante, arrêtez la réaction avec 800 microlitres de milieu de croissance complet.

Ensuite, en tenant l'insert à un angle léger, pipeter doucement le surnageant sur la surface des cellules 10 fois, en recueillant les cellules dans la boîte. Lorsque tous les inserts ont été traités, resuspendre les cellules à une concentration de deux fois 10 à la puissance 5 cellules par millilitre de milieu de croissance. Ajouter ensuite 250 microlitres de cellules sur des lamelles de verre stériles individuelles.

Placer les lamelles dans l’incubateur humidifié pendant une heure. À la fin de l’incubation, dans une hotte de sécurité biologique à flux laminaire, ajouter soigneusement deux millilitres de milieu de croissance complet dans la boîte et incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avec humidité pendant 48 heures. Ensuite, laver les cellules trois fois avec du PBS.

Après le troisième lavage, fixer les cellules dans du formaldéhyde 4 % dans du PBS pendant dix minutes à température ambiante, suivi de cinq lavages avec du tampon salin au Tris. Après le dernier lavage, rendre les cellules perméables avec du Triton X-100 0,25 % supplémenté de 0,1 % de saponine pendant cinq minutes à température ambiante, puis incuber dans la solution de blocage pendant une heure à température ambiante. Ensuite, marquer les échantillons avec l'anticorps primaire d'intérêt dans la solution de blocage à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain matin, éliminer l'anticorps non lié par des lavages de trois minutes dans la solution de lavage, suivis d'une incubation d'une heure à température ambiante avec l'anticorps secondaire approprié dans la solution de blocage. À la fin de l'incubation, laver l'anticorps secondaire non lié comme précédemment indiqué, puis monter les lamelles sur des lames individuelles à l'aide d'un milieu de montage antifade contenant du DAPI. Sceller les bords des lamelles avec du vernis incolore.

Ensuite, observer les cellules sous un grossissement de 63x avec immersion à l'huile sur un microscope inversé équipé d'une source lumineuse externe pour l'excitation en fluorescence. Ce système permet de cultiver deux populations cellulaires distinctes sur chaque face des membranes poreuses des inserts de culture cellulaire pendant au moins 120 heures, en maintenant une pureté supérieure à 99 % des populations cellulaires situées de part et d'autre de la membrane, lorsque des inserts dotés de pores de 0,4 ou d'un micron sont utilisés. Toutefois, les inserts avec des pores de trois microns sont suffisamment grands pour permettre aux cellules de migrer à travers la membrane, comme observé dans cette expérience utilisant une lignée cellulaire humaine de cancer du sein positive pour la GFP.

Les inserts à pores de 0,4 micron limitent également la formation de jonctions gap fonctionnelles entre les cultures cellulaires situées de part et d'autre de l'insert, restreignant ainsi la communication aux facteurs sécrétés. En revanche, les inserts à pores de un et trois microns permettent le couplage fonctionnel des cellules par l'intermédiaire des jonctions gap, comme en témoigne le transfert de la marque fluorescente à travers la membrane dans ces cocultures. De manière importante, ce système peut être utilisé pour générer efficacement des fibroblastes associés au cancer à partir de fibroblastes diploïdes humains normaux après leur coculture avec des cellules cancéreuses du sein, comme l'indique la réduction de l'expression de la caveoline-1 sur les fibroblastes cocultivés avec les cellules cancéreuses du sein humaines.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de sélectionner des inserts dont la taille des pores est adaptée à la question étudiée. Il faut également observer la première population cellulaire sur la face inférieure de l'insert dans un milieu qui favorise leur attachement. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que le immunoblotting, l'immunofluorescence in situ ou la plupart des autres tests cellulaires peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant les modifications de l'expression protéique, les changements dans l'invasion et la migration ou les différences de réponse aux agents thérapeutiques.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du cancer et de la biologie de la radiation pour explorer les facteurs contribuant au développement, à l'évolution du microenvironnement tumoral, et dans notre cas, à la propagation des effets néfastes des radiations ionisantes depuis les cellules ciblées par le rayonnement jusqu'aux cellules témoins à proximité. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation d'une coculture mixte de cellules, du maintien de la coculture, et de la récupération de populations cellulaires enrichies de haute pureté à partir de la coculture pour des analyses ultérieures. N'oubliez pas que le travail avec des souches ou des lignées cellulaires humaines peut présenter des risques, et que des équipements de protection individuelle adéquats doivent être portés, tout en respectant scrupuleusement les réglementations de biosécurité appropriées lors de la réalisation de cette procédure.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.