A Mimic du microenvironnement de la tumeur: Une méthode simple pour générer des populations de cellules enrichies et enquête intercellulaire Communication

L’objectif global de ce modèle simple de coculture in vitro est d’imiter les caractéristiques d’un microenvironnement tumoral in vivo, d’enrichir les populations cellulaires individuelles et d’étudier divers modes de communication intercellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines du cancer et de la radiobiologie, en particulier en ce qui concerne les facteurs sous-jacents à la génération de fibroblastes associés au cancer et les réponses aux agents thérapeutiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de générer des populations cellulaires individuelles à partir d’une culture cellulaire mixte sans marquage par fluorescence induisant un stress ou un tri cellulaire.

Commencez par laver la culture cellulaire d’intérêt deux fois avec cinq millilitres de PBS. Après le deuxième lavage, détachez les cellules avec un millilitre de trypsine-EDTA à température ambiante pendant deux minutes à température ambiante. Ensuite, éteignez la réaction avec neuf millilitres de milieu de croissance complet, en pipetant doucement le milieu sur la surface du ballon 10 fois pour dissocier les cellules.

Après le comptage, diluez les cellules à une concentration de 2,5 fois 10 à cinq cellules par millilitre dans un milieu frais, et transférez les cellules dans un tube à centrifuger stérile de 15 millilitres. Faites tourner les cellules par centrifugation et remettez en suspension la pastille dans un milieu de croissance frais complété à 50 % de sérum de veau fœtal à 2,5 fois 10 à la cinquième cellules par 70 microlitres de concentration moyenne. Ensuite, transférez des inserts de la taille de pores expérimentales appropriée de leur emballage dans des puits individuels d’une boîte à plusieurs puits et couvrez la boîte.

Ensuite, en tenant le plat à deux mains, retournez doucement le plat jusqu’à ce que le bas de l’insert soit vers le haut. Retirez le fond du plat. À l’aide d’une pince stérile dans une main, maintenez un insert en place et utilisez l’autre main pour aspirer lentement 70 microlitres de cellules dans une pointe de micropipette.

Ensuite, distribuez lentement les cellules sur la surface de ce qui est maintenant la partie supérieure de l’insert. Après avoir semé chacun des inserts, replacez soigneusement le fond du plat et incubez le plat inversé à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avec de l’humidité pendant 30 à 45 minutes. À la fin de l’incubation, dans une enceinte de sécurité biologique à flux laminaire, retournez soigneusement la parabole de sorte que le fond des inserts soit maintenant orienté vers le bas.

Ensuite, plongez lentement et soigneusement le fond de chaque insert dans deux millilitres de milieu complet préchauffé et remettez le plat dans l’incubateur humidifié. Après 48 heures, remplacez le milieu au fond de chaque puits par deux millilitres de milieu de croissance frais. Lorsque tout le milieu a été rafraîchi, ensemencez 2,5 fois 10 à la cinquième cellule de la deuxième population d’intérêt sur le dessus des inserts dans un millilitre de milieu frais, puis remettez le plat dans l’incubateur.

24, 48 et 96 heures plus tard, remplacez le milieu dans le haut de chaque insert par un millilitre de milieu complet frais. Et le milieu au fond de chaque puits avec deux millilitres de milieu complet frais. Après 120 heures de coculture, transférez un insert à la fois dans des boîtes de culture cellulaire individuelles de 35 millimètres contenant un millilitre de PBS.

Et lavez le fond et le dessus des inserts avec un millilitre de PBS. Pour recueillir les cellules cultivées au bas de l’insert, placez les inserts face inférieure vers le bas dans 200 microlitres de trypsine-EDTA à température ambiante. Après deux minutes à température ambiante, arrêtez la réaction avec 800 microlitres de milieu de croissance complet.

Ensuite, en tenant l’insert légèrement incliné, pipetez doucement le surnageant sur la surface des cellules 10 fois, en recueillant les cellules dans la boîte. Lorsque tous les inserts ont été enlevés, remettre les cellules en suspension à une concentration de deux fois 10 à la cinquième cellules par millilitre de milieu de croissance. Et ajoutez 250 microlitres de cellules sur des lamelles en verre individuelles stériles.

Placez les lamelles dans l’incubateur humidifié pendant une heure. À la fin de l’incubation, dans une enceinte de sécurité biologique à flux laminaire, ajoutez soigneusement deux millilitres de milieu de croissance complet dans la boîte et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avec humidité pendant 48 heures. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec du PBS.

Après le troisième lavage, fixez les cellules dans du formaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant dix minutes à température ambiante, suivi de cinq lavages avec une solution saline tamponnée au Tris. Après le dernier lavage, perméabiliser les cellules avec 0,25 % de Triton X-100 complété par 0,1 saponine pendant cinq minutes à température ambiante, suivi d’une incubation dans une solution bloquante pendant une heure à température ambiante. Ensuite, étiquetez les échantillons avec l’anticorps principal d’intérêt dans la solution de blocage à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain matin, retirer l’anticorps non lié en effectuant trois minutes de lavage dans une solution de lavage, suivi d’une incubation d’une heure à température ambiante dans l’anticorps secondaire approprié dans une solution bloquante. À la fin de l’incubation, laver l’anticorps secondaire non lié comme cela vient d’être démontré et monter les lamelles sur des lames individuelles avec un support de montage anti-décoloration contenant du DAPI. Scellez les bords de la lamelle avec du vernis à ongles transparent.

Ensuite, imagez les cellules sous un grossissement d’huile de 63x sur un microscope inversé équipé d’une source de lumière externe pour l’excitation de la fluorescence. Ce système permet de cultiver deux populations cellulaires différentes de chaque côté des membranes poreuses des inserts de culture cellulaire pendant au moins 120 heures, en maintenant une pureté supérieure à 99 % des populations cellulaires de chaque côté de la membrane, lorsque des inserts avec des pores de 0,4 ou d’un micron sont utilisés. Cependant, les inserts avec des pores de trois microns sont suffisamment grands pour permettre aux cellules de migrer à travers la membrane, comme observé dans cette expérience en utilisant une lignée cellulaire de cancer du sein humain positive à la GFP.

Les inserts de pores de 0,4 micron limitent également la formation de jonctions lacunaires fonctionnelles entre les cultures cellulaires des deux côtés de l’insert, limitant la communication aux facteurs sécrétés. Les inserts avec des pores d’un et trois microns permettent cependant le couplage fonctionnel des cellules à travers les jonctions lacunaires, comme l’indique le transfert du marqueur fluorescent à travers la membrane dans ces cocultures. Il est important de noter que ce système peut être utilisé pour générer efficacement des fibroblastes associés au cancer à partir de fibroblastes diploïdes humains normaux après leur coculture avec des cellules cancéreuses du sein, comme en témoigne l’expression réduite de la cavéoline-1 sur les fibroblastes co-cultivés avec les cellules cancéreuses du sein humain.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de sélectionner des inserts avec une taille de pores adaptée à la question explorée. Et de voir la première population cellulaire sur la face inférieure de l’insert dans un milieu qui facilite leur fixation. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunobuvardage, l’immunofluorescence in situ ou la plupart des autres tests cellulaires peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur les altérations de l’expression des protéines, les changements d’invasion et de migration ou les différences dans les réponses aux agents thérapeutiques.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du cancer et de la biologie des radiations pour explorer les facteurs qui contribuent au développement, à l’évolution du microenvironnement tumoral et, dans notre cas, à la propagation des effets nocifs des rayonnements ionisants des cellules ciblées avec des rayonnements aux cellules voisines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation d’une coculture de cellules mixtes, du maintien de la coculture et de la récolte de populations de cellules enrichies de haute pureté à partir de la coculture pour une analyse plus approfondie. N’oubliez pas que travailler avec des souches cellulaires humaines ou des lignées cellulaires peut être dangereux et que l’équipement de protection individuelle approprié doit être porté et que les réglementations de biosécurité appropriées doivent être respectées lors de l’exécution de cette procédure.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.