Etude de réticulum endoplasmique et mitochondries Interactions par In Situ Proximité Ligation Assay dans des cellules fixes
10 décembre 2016
Ici, nous décrivons une procédure pour visualiser et de quantifier avec une grande sensibilité les interactions endogènes entre le réticulum endoplasmique et les mitochondries dans les cellules fixes. Le protocole optimisé comprend un essai de ligature de proximité in situ dans le ciblage de l'inositol 1,4,5-triphosphate récepteur / protéine régulée par le glucose 75 / D complexe canal anionique / cyclophiline dépendant de la tension à l'interface de la membrane associée à la mitochondrie.
L’objectif général de cette expérience est de visualiser et de quantifier les interactions entre les mitochondries du réticulum endoplasmique à l’aide d’un test de ligature de proximité in situ dans des cellules fixes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine biomédical afin de mieux analyser les interactions mitochondries du RE dans les cellules fixes à l’aide d’une technique simple d’immunofluorescence. Espérons-le, suggérant de nouvelles stratégies de traitement. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons visualiser et quantifier les interactions mitochondries du RE dans les cellules fixes et cette technique peut être appliquée aux biopsies tissulaires de patients incluses dans la paraffine. À l’aide du test de ligature de proximité in situ démontré dans cette vidéo, un anticorps primaire de souris dirigé contre VDAC1 au niveau de la membrane mitochondriale externe et un anticorps primaire de lapin dirigé contre IP3R1 au niveau de la membrane du réticulum endoplasmique se combinent à leurs épitopes à proximité au niveau de l’interface membranaire associée aux mitochondries. Des sondes de ligature de proximité qui ont des queues d’ADN attachées et qui sont dirigées contre les IgG de souris et de lapin sont ajoutées et peuvent former des modèles pour la ligature des oligonucléotides de connexion et peuvent être amplifiées et visualisées à l’aide d’oligonucléotides rouges du Texas. En accord avec la distance entre les deux membranes d’organites, à l’interface membranaire associée mitochondriale. Pour fixer et bloquer les cellules pour le test de ligature de proximité in situ, plaquez les cellules H7 humaines à 150 000 cellules par plat à fond de verre non codé de 35 mm. Le lendemain, retirez le milieu de culture et utilisez 1 mL de PBS pour laver les cellules. Ensuite, aspirez le tampon et ajoutez 1 mL de formaldéhyde à dix pour cent. Incuber les plaques à température ambiante en agitant pendant 10 minutes pour fixer les cellules. Pour arrêter la réaction, ajoutez 1 mL de glycine 1 M et mélangez les plaques par rotation. Retirer la solution de glycine et ajouter 1 mL de 1XPBS. Ensuite, agitez brièvement les plaques et aspirez le tampon. Ensuite, ajoutez 1 ml de 100 mM de glycine aux cellules. Incuber les plaques à température ambiante en agitant pendant 15 minutes. Après avoir aspiré la solution, perméabilisez les cellules en ajoutant 1 mL de triton-X100 à 0,1 % dans du PBS. Et répétez l’incubation. Aspirez le détergent et ajoutez 1 mL de PBS pour laver les cellules. Après avoir retiré le tampon, ajoutez 40 microlitres de solution bloquante dans chaque boîte de cellules et incubez les échantillons dans une chambre humide à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, tapotez la solution de blocage sur la vaisselle, en essayant d’obtenir des volumes résiduels égaux de tampon pour chaque lame sans laisser les lames sécher. Pour effectuer le test de ligature de proximité, utilisez du PBS pour diluer les anticorps primaires. Vortex et ajoutez la solution dans les plats. Incuber les échantillons à 4
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Aperçu
Cet article présente une procédure permettant de visualiser et de quantifier les interactions entre le réticulum endoplasmique et les mitochondries dans des cellules fixées, avec une sensibilité élevée. La méthode utilise un dosage d'amplification de ligature in situ optimisé pour cibler des complexes protéiques spécifiques à l'interface de la membrane associée aux mitochondries.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Neurosciences
- Biochimie
Contexte
- Le réticulum endoplasmique et les mitochondries jouent un rôle crucial dans le métabolisme cellulaire.
- Comprendre leurs interactions est essentiel pour élucider les fonctions cellulaires.
- Les tests de ligature par proximité offrent une méthode sensible pour étudier les interactions protéiques.
- Cette étude porte sur un complexe protéique spécifique impliqué dans ces interactions.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode permettant de visualiser les interactions entre le réticulum endoplasmique et les mitochondries.
- Quantifier ces interactions avec une grande sensibilité.
- Approfondir la compréhension du métabolisme et de la signalisation cellulaires.
Méthodes utilisées
- Dosage par amplification de ligature en site
- Ciblage du récepteur de l'inositol 1,4,5-triphosphate
- Implication de la protéine régulée par le glucose 75
- Analyse du complexe du canal anionique dépendant du voltage et de la cyclophiline D
Résultats principaux
- Visualisation réussie des interactions entre le réticulum endoplasmique et les mitochondries.
- Quantification des complexes protéiques à l'interface membranaire.
- Démonstration d'une haute sensibilité dans la détection des interactions.
Conclusions
- Le protocole développé permet une étude détaillée des interactions cellulaires.
- Les connaissances acquises peuvent contribuer à la compréhension des processus métaboliques.
- Cette méthode peut être appliquée à divers domaines de la recherche biologique.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La quantification des interactions endogènes entre le réticulum endoplasmique et les mitochondries est essentielle pour réduire les risques liés aux hypothèses de découverte précoce concernant la signalisation cellulaire et la régulation du métabolisme. Le dosage d'hybridation in situ par amplification de ligature permet une détection sensible et multiplexée des sites de contact entre organites, sans surexpression protéique, renforçant ainsi la fiabilité prédictive dans des systèmes pertinents pour la maladie. Cette capacité renforce les décisions stratégiques à l'intersection de la validation des cibles et de l'analyse mécanistique des voies biologiques.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet la visualisation directe et la quantification des contacts entre le réticulum endoplasmique et les mitochondries au niveau moléculaire.
- Permet une détection mécanistique en confirmant la proximité de protéines endogènes dans des cellules fixées et des biopsies tissulaires.
- Facilite la validation fonctionnelle des cibles dans les voies impliquant la signalisation calcique et la communication entre organites.
- Améliore la fiabilité prédictive pour l'avancement de cibles impliquées dans des troubles métaboliques et de signalisation.
Développement de criblages et de tests
- Offre un dosage standardisé et reproductible pour quantifier les interactions protéine-protéine à une résolution sub-organellaire.
- Permet des tests multiparamétriques afin d'évaluer l'impact de composés ou de perturbations génétiques sur les contacts entre le réticulum endoplasmique et les mitochondries.
- Fournit des résultats quantitatifs adaptés à une analyse comparative entre différentes conditions expérimentales.
- Prend en charge l'extensibilité du dosage et la réutilisation de la plateforme pour des campagnes de criblage plus larges.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur les systèmes pertinents pour la maladie en permettant l'analyse de biopsies tissulaires provenant de patients.
- Assure une continuité translationnelle, depuis la découverte jusqu'à la validation préclinique des cibles d'interactions entre organites.
- Facilite un développement adapté au risque en fournissant des preuves mécanistiques d'engagement de la voie ciblée.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce dosage de ligature de proximité in situ permet une quantification robuste des interactions entre le réticulum endoplasmique et les mitochondries dans des cellules et tissus fixés, combinant ainsi la découverte précoce et la recherche préclinique.
- Découverte en biologie : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies impliquées dans les mécanismes de communication entre organites.
- Criblage : Fournit des mesures reproductibles et quantitatives pour des campagnes de criblage de composés ou génétiques.
- Analyse : Permet une détection sensible de la proximité des protéines inférieure à 40 nm, permettant la comparaison statistique des fréquences d'interaction.
- Recherche translationnelle : Facilite l'alignement des biomarqueurs et la validation mécanistique dans des échantillons pertinents pour les maladies.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme réutilisable pour diverses études sur les interactions protéiques dans plusieurs programmes de R&D.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Standardise la détection des interactions protéiques endogènes avec une haute sensibilité et spécificité.
- Valeur stratégique : Permet de prendre de meilleures décisions d'avancement ou d'abandon en fournissant dès les premières étapes du processus des données mécanistiques solides.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation et l'avancement, ajustés au risque, de cibles possédant des profils d'interactions organellaires validés.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en immunofluorescence et dans les protocoles de dosage par amplification de proximité.
- Requiert un accès à des anticorps de haute qualité et à une infrastructure d'imagerie en fluorescence.
- Exige une standardisation inter-équipes pour une quantification reproductible entre les études.
- Adaptable aux lignées cellulaires et aux biopsies tissulaires incluses dans la paraffine, assurant une pertinence translationnelle.
- Limité aux échantillons fixés ; non adapté à l'étude des interactions dynamiques en cellules vivantes.
