Name: Etude de réticulum endoplasmique et mitochondries Interactions par In Situ Proximité Ligation Assay dans des cellules fixes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Découvrez comment visualiser et quantifier les interactions réticulum endoplasmique-mitochondries dans des cellules fixes grâce à l'assay de proximité in situ. Cette méthode immunofluorescente offre une sensibilité élevée pour étudier les complexes protéiques à l'interface membrane associée mitochondriale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions toutes les personnes dans notre laboratoire qui ont contribué à optimiser et de valider le protocole. Ce travail a été soutenu par l&#39;INSERM et l&#39;agence nationale de la recherche (ANR-09-JCJC-0116 ET ANR-11-BSV1-033-02). ET a été soutenu au cours de sa thèse par une bourse de recherche du ministère français de l&#39;enseignement supérieur et de la recherche.

1. Préparation des solutions <ol><li> Préparer 10% de formaldehyde dans du PBS (faible teneur en sel) en diluant 5,5 ml de formaldéhyde à 37% dans 14,5 ml de PBS. Préparer glycine 1 M, pH 8,0, en dissolvant 3,8 g de glycine dans 50 ml de PBS; diluer cette solution pour obtenir la glycine 100 mM dans PBS 1x. </li><li> Préparer 0,1% de Triton-X100 dans PBS 1x. Préparer 20x Saline citrate de sodium (SSC) en utilisant 3,0 M de chlorure de sodium et 0,30 M de citrate trisodique préparé dans un tampon d&#39;eau déminéralisée avec un pH de 7,0 à 25 ° C. Diluer ce tampon à 1x et 0,01x en utilisant de l&#39;eau déminéralisée. </li></ol> 2. Fixation de cellules NOTE: Nous avons utilisé la lignée cellulaire d&#39;hépatocarcinome HuH7 dans cette étude, mais cette méthode est applicable à d&#39; autres cultures de cellules adhérentes. <ol><li> cellules de plaques HuH7 (cultivées en DMEM 1 g / L de glucose, additionné de 10% de sérum de veau foetal et 0,01% de pénicilline-streptomycine stock) à 150.000 cellules par boîte à fond de verre de 35 mm non couché. Lorsque vous travaillez sur cellule primairecultures utilisent des boîtes revêtues de collagène. </li><li> Le lendemain, retirer le milieu de culture. Laver les cellules avec 1 ml de PBS et aspirée. Fixer les cellules en ajoutant 1 ml de formol à 10% et laisser incuber pendant 10 min à température ambiante (TA) sous agitation. </li><li> Stopper la réaction avec 1 ml de glycine 1 M et mélanger en rotation. Retirer la solution de réaction d&#39;arrêt et laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS 1x; agiter par rotation et aspirez. Ajouter 1 ml de glycine 100 mM dans les cellules et les incuber pendant 15 min à température ambiante sous agitation, puis aspirée. NOTE: Le protocole peut être arrêté ici et les étapes suivantes peut être reporté à un autre jour. Dans ce cas, ajouter 1 ml de glycine 100 mM et de garder à 4 ° C, si nécessaire. </li></ol> 3. La perméabilisation de cellules <ol><li> Ajouter 1 ml de 0,1% de Triton X100 dans du PBS 1X, incuber pendant 15 min à température ambiante sous agitation, puis aspirat. Ce temps d&#39;incubation peut être augmentée jusqu&#39;à 15 - 20 min lorsque l&#39;on travaille sur des cellules primaires cultures (par exemple, les hépatocytes de souris primaires). Laver les cellules en ajoutant 1 ml de 1 x PBS; aspirer. </li></ol> 4. Blocage <ol><li> Ajouter 40 ul de solution de blocage à chaque échantillon (fourni par le kit); ce volume peut être augmenté afin de couvrir l&#39;échantillon. Incuber les boîtes pendant 30 minutes à 37 ° C dans une chambre humide. </li><li> Appuyez sur la solution de blocage de la vaisselle. Essayez d&#39;obtenir des volumes résiduels égaux pour chaque diapositive, car cela aura une incidence sur la reproductibilité. Ne pas laisser les échantillons sécher! </li></ol> 5. Anticorps primaires <ol><li> Diluer les anticorps primaires 1x PBS et ajouter la solution aux plats (d&#39;anticorps de souris VDAC1: 1/100, anticorps de lapin IP3R1: 1/500). Alternativement, GRP75 ou CypD anticorps (les deux anticorps de souris utilisés au 1/500) peuvent être utilisés à la place de VDAC1. </li><li> Laisser incuber pendant une nuit dans une chambre humide à 4 ° C. Laver les lames deux fois en utilisant une solution saline tamponnée Tris avec 0,01% de Tween (TBS-T). </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 6. Proximité ligatures Assay Sondes <ol><li> A proximité des sondes d&#39;essai de ligature sont fournis par le kit. Choisir des sondes selon l&#39;espèce d&#39;anticorps primaires. </li><li> Préparer les deux proximité sondes de dosage de ligature 1: 5 dans le diluant d&#39;anticorps. Laisser le mélange reposer pendant 20 min à température ambiante. Ajouter la solution de sonde d&#39;essai de proximité de ligature dilué. Incuber les plats dans une chambre d&#39;humidité préchauffé pendant 1 heure à 37 ° C. Laver les plats deux fois avec TBS-T. </li></ol> 7. ligature <ol><li> Utilisez le dans le réactif de détection in situ Texas kit rouge. </li><li> Diluer la ligature stocks 5x (fourni par le kit) 1: 5 dans de l&#39;eau de haute pureté et bien mélanger. Diluer la ligase dans la solution de ligature 1x (fournie dans le kit) et 1:40 vortex. Attendez d&#39;ajouter la ligase jusqu&#39;à immédiatement avant l&#39;addition aux échantillons. </li><li> Ajouter cette solution à chaque échantillon (40 pi pour les plats à fond de verre de 35 mm) et incuber les lames dans un cham d&#39;humidité pré-chaufféeber pendant 30 min à 37 ° C. Laver les lames deux fois avec du TBS-T. </li></ol> 8. Amplification REMARQUE:, des réactifs sensibles à la lumière avec soin. <ol><li> Diluer la 5x amplification stock (fournie par le kit) 1: 5 dans de l&#39;eau de haute pureté. Retirer la polymérase du congélateur au moyen du bloc de congélation (-20 ° C). Diluer la polymerase (fourni par le kit) à 1:80 dans la solution d&#39;amplification 1x et vortexer. Ajouter la polymérase immédiatement avant d&#39;utiliser le mélange. </li><li> Ajouter cette solution à chaque échantillon (40 pi pour les plats à fond de verre de 35 mm). Incuber les lames dans une chambre humide préchauffé pendant 100 minutes à 37 ° C. Appuyez sur la solution Amplification-Polymerase hors des diapositives. </li></ol> 9. Lavage final <ol><li> Laver les lames dans un tampon de lavage 1x SSC pendant 2 min. Laver les lames dans un tampon de lavage SSC 0,01x pendant 2 min. Laissez les plats sécher à la température ambiante dans l&#39;obscurité. </li></ol> 10. Préparation pour l&#39;imagerie <ol&gt; <li> Monter les lames en utilisant un volume minimal de milieu de montage contenant DAPI (aqueux et ne se solidifie pas), en veillant à ce qu&#39;aucune bulle d&#39;air se coincer sous la lamelle. Vernis à ongles peut être utilisé pour sceller les bords. Attendez environ 15 minutes avant d&#39;analyser en utilisant une fluorescence ou microscope confocal (excitation: 594 nm, émission: 624 nm, grossissement: 63X). </li><li> Après l&#39;imagerie, stocker les lames à -20 ° C dans l&#39;obscurité. </li></ol>

<ol><li>Bravo-Sagua, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+communication%3A+signaling+crossroads+between+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Organelle communication: signaling crossroads between homeostasis and disease.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 50, 55-59 (2014).</li>
<li>Giorgi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-associated+membranes%3A+composition%2C+molecular+mechanisms%2C+and+physiopathological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+redox+signaling%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-associated membranes: composition, molecular mechanisms, and physiopathological implications.</a> Antioxidants & redox signaling. 22, 995-1019 (2015).</li>
<li>Phillips, M. J., Voeltz, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+ER+membrane+contact+sites+with+other+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Structure and function of ER membrane contact sites with other organelles.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 17, 69-82 (2016).</li>
<li>Cosson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RTM+resistance+to+potyviruses+in+Arabidopsis+thaliana%3A+natural+variation+of+the+RTM+genes+and+evidence+for+the+implication+of+additional+genes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The RTM resistance to potyviruses in Arabidopsis thaliana: natural variation of the RTM genes and evidence for the implication of additional genes.</a> PLoS One. 7, 39169(2012).</li>
<li>Mannella, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+the+mitochondrial+inner+membrane+cristae%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae.</a> Biochim Biophys Acta. 1763, 542-548 (2006).</li>
<li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> The Journal of cell biology. 174, 915-921 (2006).</li>
<li>Mannella, C. A., Buttle, K., Rath, B. K., Marko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+tomography+of+rat-liver+mitochondria+and+their+interaction+with+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic tomography of rat-liver mitochondria and their interaction with the endoplasmic reticulum.</a> Biofactors. 8, 225-228 (1998).</li>
<li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close+contacts+with+the+endoplasmic+reticulum+as+determinants+of+mitochondrial+Ca2%2B+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses.</a> Science. 280, 1763-1766 (1998).</li>
<li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat Protoc. 4, 1582-1590 (2009).</li>
<li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39, 121-132 (2010).</li>
<li>Szabadkai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-mediated+coupling+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chaperone-mediated coupling of endoplasmic reticulum and mitochondrial Ca2+ channels.</a> J Cell Biol. 175, 901-911 (2006).</li>
<li>Tubbs, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-associated+endoplasmic+reticulum+membrane+%28MAM%29+integrity+is+required+for+insulin+signaling+and+is+implicated+in+hepatic+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance.</a> Diabetes. 63, 3279-3294 (2014).</li>
<li>Paillard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depressing+Mitochondria-Reticulum+Interactions+Protects+Cardiomyocytes+From+Lethal+Hypoxia-Reoxygenation+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Depressing Mitochondria-Reticulum Interactions Protects Cardiomyocytes From Lethal Hypoxia-Reoxygenation Injury.</a> Circulation. 128, 1555-1565 (2013).</li>
<li>Rieusset, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+calcium+transfer+from+ER+to+mitochondria+links+alterations+of+mitochondria-associated+ER+membrane+integrity+to+hepatic+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Disruption of calcium transfer from ER to mitochondria links alterations of mitochondria-associated ER membrane integrity to hepatic insulin resistance.</a> Diabetologia. 59, 614-623 (2016).</li>
<li>Allalou, A., Wahlby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BlobFinder%2C+a+tool+for+fluorescence+microscopy+image+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Computer+methods+and+programs+in+biomedicine%22%5BJournal%5D)">BlobFinder, a tool for fluorescence microscopy image cytometry.</a> Computer methods and programs in biomedicine. 94, 58-65 (2009).</li>
<li>Theurey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-associated+endoplasmic+reticulum+membranes+allow+adaptation+of+mitochondrial+metabolism+to+glucose+availability+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver.</a> Journal of molecular cell biology. , (2016).</li>
<li>de Brito, O. M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456, 605-610 (2008).</li>
<li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature methods. 3, 995-1000 (2006).</li>
<li>De Pinto, V., Messina, A., Lane, D. J., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+anion-selective+channel+%28VDAC%29+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent anion-selective channel (VDAC) in the plasma membrane.</a> FEBS letters. 584, 1793-1799 (2010).</li>
<li>Kaul, S. C., Taira, K., Pereira-Smith, O. M., Wadhwa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortalin%3A+present+and+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+gerontology%22%5BJournal%5D)">Mortalin: present and prospective.</a> Experimental gerontology. 37, 1157-1164 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Collectivement, nos études indiquent que le test de ligature de proximité in situ est vraiment une stratégie pertinente pour suivre et quantifier les interactions endogènes ER-mitochondries dans les cellules fixes, sans avoir besoin d’utiliser des fluorophores spécifiques aux organites ou des protéines fluorescentes. L’utilisation spécifique des anticorps VDAC1/IP3R1 a été adaptée pour étudier les interactions ER-mitochondries dans les cellules HuH7. Cependant, d’autres isoformes de VDAC et d’IP3R peuvent être u...

Mitochondrie et le réticulum endoplasmique (ER) ne sont pas indépendants dans les organites de la cellule, mais ils interagissent structurellement et fonctionnellement au niveau des sites de contact définis comme membranes du réticulum endoplasmique mitochondries-associés (MAM). En effet, MMA propres correspondent à des régions où les membranes du RE et les mitochondries sont étroitement apposés, ce qui permet des interactions entre les protéines des deux côtés. Néanmoins, les membranes de ces organites ne fusionnent pas dans ces régions, de sorte qu&#39;ils maintiennent leurs entités distinctes. Les jouent un rôle MMA propres crucial dans le calcium (Ca 2+) et transfert des phospholipides d&#39;ER aux mitochondries, un impact sur le métabolisme énergétique et la survie des cellules 1-3. L&#39;association entre l&#39;ER et des mitochondries a été visualisé dans les années 1970 avec la microscopie électronique. Depuis lors, la microscopie électronique à transmission , 4,5, 6,7 tomographie électronique ou immuno-localisation de ER et spécifiques aux mitochondries fluorophores / protéines fluorescentes 8 ont été classiquement utilisés pour étudier les interactions ER-mitochondries. Un autre outil utile pour l&#39;analyse du MAM est basée sur l&#39;utilisation de fractionnement subcellulaire. Elle permet l&#39;isolement des fractions par ultracentrifugation différentielle MAM couplé à un gradient de Percoll 9. Cependant, le produit final contient des fractions enrichies MAM, plutôt que des fractions pures. Au total, ces stratégies ne sont pas particulièrement sensibles et / ou quantitative, et ils ne sont pas facilement se prêtent à une grande sélection. Alternativement, des approches génétiques utilisant fluorescentes linkers inter-organelles de drogue inductible sont apparus, mais ils ne permettent pas l&#39;analyse des interactions des organites aux niveaux d&#39;expression de protéines endogènes 10. Sur la base de la découverte de Szabadkai du complexe IP3R / GRP75 / VDAC au MAM 11, nous avons développé une méthode quantitative pour analyser les interactions ER-mitochondries. Nous avons utilisé le in situ la proximité ligatile dosage pour détecter et quantifier les interactions entre les VDAC1 et IP3R1, deux protéines de surface des organites impliqués dans le complexe -channeling Ca2 + à l&#39;interface MAM dans les cellules fixes 12. En bref, nous avons sondé VDAC1 à la membrane externe mitochondriale (souris anticorps primaire anti-VDAC1) et IP3R1 à la membrane du RE (lapin anticorps primaire anti-IP3R1) (figure 1, le panneau a). Ensuite, selon le dosage, on a ajouté à la fois anti-souris et anti-lapin IgG (de sondes de dosage de souris et de lapin proximité de ligature), qui sont conjugués à des extensions d&#39;oligonucléotides complémentaires. Si les deux protéines ciblées sont à une distance inférieure à 40 nm, les oligonucléotides peuvent hybrider avec les oligos de connecteur ajoutés ultérieurement pour permettre la formation d&#39;une matrice d&#39;ADN circulaire (Figure 1, panneau b). Cette molécule d&#39;ADN circulaire est ligaturé et amplifié, en créant un produit d&#39;ADN simple brin lié par covalence à l&#39; un des capteurs de proximité (Figure 1, panneau c) </strong&gt;. Comme la distance entre l&#39;ER et les mitochondries à l&#39;interface MAM varie de 10 nm à 25 nm 6, la proximité ligature et l&#39; amplification peuvent être réalisées, conduisant à une détection ultérieure en raison de l&#39;hybridation de Texas oligonucléotides rouges-sondes marquées (Figure 1, panneau d ). Chaque point fluorescent représente les interactions entre VDAC1 / IP3R1, permettant ainsi la quantification in situ des interactions ER-mitochondries dans des cellules individuelles. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54899/54899fig1.jpg" /> Figure 1: Illustration schématique de la détection des interactions réticulum endoplasmique-mitochondries par In Situ Proximité Ligation Assay. a) un anticorps primaire de souris dirigé contre VDAC1 et un anticorps primaire de lapin dirigé contre IP3R1 peuvent se lier à leurs epitopes à proximité de l&#39;interface MAM, b) l&#39;addition d&#39;une paire de sondes de ligature de proximitédirigé contre la souris et le lapin IgG. Ces sondes sont attachés brins d&#39;ADN qui peuvent former des modèles pour la ligature des oligonucléotides de connecteur. c) Le brin d&#39;ADN circulaire formé après la ligature peut être amplifié , et d) visualisées par microscopie à fluorescence comme un point à l&#39;aide du Texas oligonucléotides marqués au rouge. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54899/54899fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Comme dans les expériences d&#39;analyse in situ la proximité de ligature peut être réalisée avec la paire GRP75 / IP3R1 d&#39;anticorps, ainsi que la cyclophiline D (CypD) / anticorps IP3R1, considérant que CypD a été montré pour interagir avec le complexe IP3R / GRP75 / VDAC à l&#39;interface de MAM 12-14.

<table><tbody><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>F-8775</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G-8898</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Plats de culture à fond de verre</td><td>MatTeK corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Solution de blocage</td><td>Sigma</td><td>DUO-92004 ou DUO-92002</td><td>fournie dans les sondes PLA Duolink, anticorps Sigma</td></tr><tr><td>VDAC1</td><td>Abcam</td><td>ab14734</td><td></td></tr><tr><td>IP3R1-H80 anticorps</td><td>Santa Cruz</td><td>sc28614</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps CypD</td><td>Abcam</td><td>ab110324</td><td></td></tr><tr><td>Grp75 anticorps</td><td>Santa Cruz</td><td>sc13967</td><td></td></tr><tr><td>TBS 10x</td><td>euromedex</td><td>ET220</td><td>Diluer pour obtenir 1x</td></tr><tr><td>Tween 100x</td><td>euromedex</td><td>2001-B</td><td>diluer dans TBS pour obtenir 0,01 %</td></tr><tr><td>Sondes PLA Souris MINUS</td><td>Sigma</td><td>DUO-92004</td><td>Duolink, Sigma</td></tr><tr><td>Sondes PLA Rabbit PLUS</td><td>Sigma</td><td>DUO-92002</td><td>Duolink, Sigma</td></tr><tr><td>Duolink réactifs de détection rouge</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Duolink, Sigma</td></tr><tr><td>Solution de ligature</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Fait partie des réactifs de détection Duolink rouge, Sigma</td></tr><tr><td>Ligase</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Fait partie des réactifs de détection Duolink rouge, Sigma</td></tr><tr><td>Amplification solution</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Fait partie des réactifs de détection Duolink rouge, Sigma</td></tr><tr><td>Polymerase</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Fait partie de la gamme Réactifs de détection Duolink rouge, Sigma</td></tr><tr><td>Duolink Medium</td><td>Sigma</td><td>DUO80102</td><td>Duolink, Sigma</td></tr><tr><td colspan="4">Softwares</td></tr><tr><td>BlobFinder</td><td></td><td></td><td>est un logiciel distribué gratuitement qui permet d’effectuer des calculs sur des cellules à partir d’images de microscopie à fluorescence. Ce logiciel peut être téléchargé gratuitement auprès du Centre d’analyse d’images de l’Université d’Uppsala, qui a développé le logiciel et dont le travail a été soutenu par le projet ENLIGHT du 6e PC de l’UE et Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm</td></tr><tr><td>logiciel</td><td></td><td></td> ImageJ <td>peut être téléchargé gratuitement à partir de : http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td></tr></tbody></table>

etude de réticulum endoplasmique et mitochondries interactions par<em&gt; in situ</em&gt; proximité ligation assay dans des cellules fixes

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Les interactions structurelles entre les membranes réticulaires endoplasmiques (RE) et mitochondriales, dans des domaines connus sous le nom de membranes associées aux mitochondries (MAM), sont des plaques tournantes cruciales pour la signalisation cellulaire et le destin cellulaire. En particulier, ces sites de contact inter-organites permettent le transfert du calcium du RE vers les mitochondries par le biais du complexe de canalisation calcique du canal anionique voltage-dépendant (VDAC)/protéine 75 régulée par le glucose (GRP75)/récepteur de l’inositol 1,4,5-triphosphate (IP3R). Bien que ce compartiment subcellulaire fasse l’objet d’études intensives dans des conditions physiologiques et pathologiques, il n’existe aucune méthode simple et sensible pour quantifier la quantité endogène de contact entre les mitochondries du RE dans les cellules. De même, les MAM sont des structures hautement dynamiques, et il n’existe pas d’approche appropriée pour suivre les modifications des interactions ER-mitochondries sans surexpression des protéines. Ici, nous rapportons un protocole optimisé basé sur l’utilisation d’un test de ligature de proximité in situ pour visualiser et quantifier les interactions endogènes ER-mitochondries dans des cellules fixes en utilisant la proximité étroite entre les protéines de la membrane mitochondriale externe (VDAC1) et de la membrane ER (IP3R1) à l’interface MAM. Des expériences similaires de ligature de proximité in situ peuvent également être réalisées avec les paires d’anticorps GRP75/IP3R1 et cyclophiline D/IP3R1. Ce test offre plusieurs avantages par rapport aux autres procédures d’imagerie, car il est très spécifique, sensible et adapté aux tests multi-conditions. Par conséquent, l’utilisation de ce test de ligature de proximité in situ devrait être utile pour mieux comprendre les régulations physiologiques des interactions RE-mitochondries, ainsi que leur rôle dans des contextes pathologiques.

Sur la base de notre expérience en utilisant ce protocole, nous pouvons recommander en toute sécurité de cette méthode pour la visualisation et la quantification des interactions ER-mitochondries dans les cellules fixes. Des images représentatives de à proximité ligature interactions in situ de dosage-visualisées ER-mitochondries dans la lignée cellulaire HuH7 d&#39;hépatocarcinome, en utilisant plusieurs paires d&#39;anticorps, sont présentés. Comme on le voit sur la <...

Ici, nous décrivons une procédure pour visualiser et de quantifier avec une grande sensibilité les interactions endogènes entre le réticulum endoplasmique et les mitochondries dans les cellules fixes. Le protocole optimisé comprend un essai de ligature de proximité in situ dans le ciblage de l&#39;inositol 1,4,5-triphosphate récepteur / protéine régulée par le glucose 75 / D complexe canal anionique / cyclophiline dépendant de la tension à l&#39;interface de la membrane associée à la mitochondrie.

Etude de réticulum endoplasmique et mitochondries Interactions par<em&gt; In Situ</em&gt; Proximité Ligation Assay dans des cellules fixes

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

L'objectif général de cette expérience est de visualiser et de quantifier les interactions entre le réticulum endoplasmique et les mitochondries à l'aide d'un test d'immunocapture in situ par amplification de ligations (PLA) réalisé sur des cellules fixées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine biomédical afin d'analyser plus précisément les interactions entre le réticulum endoplasmique et les mitochondries dans des cellules fixées, en utilisant une technique simple d'immunofluorescence. Elle pourrait ainsi suggérer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité de visualiser et de quantifier les interactions entre le réticulum endoplasmique et les mitochondries dans des cellules fixées, et elle peut également être appliquée à des biopsies tissulaires incluses en paraffine provenant de patients. En utilisant le test d'immunocapture in situ par amplification de ligations illustré dans cette vidéo, un anticorps primaire de souris dirigé contre la VDAC1 située dans la membrane externe mitochondriale et un anticorps primaire de lapin dirigé contre l'IP3R1 localisé dans la membrane du réticul

study-endoplasmic-reticulum-mitochondria-interactions-situ-proximity

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nous décrivons ici une méthode pour visualiser réticulum endoplasmique associés ARNm dans les cellules de culture de tissus de mammifères. Cette technique implique l'perméabilisation sélective de la membrane plasmique avec de la digitonine à supprimer les contenus cytoplasmiques suivie par...

Visualisation des ARNm localisés dans le réticulum endoplasmique des cellules de mammifères

Nous décrivons des méthodes d'imagerie nous utilisons pour étudier la distribution et la mobilité des protéines fluorescentes transfectées résidant dans le réticulum endoplasmique (RE) par l'intermédiaire de l'imagerie confocale de cellules vivantes. Nous analysons également ultrastructuralement l'effet de leur expression sur l'architecture de ce compartiment subcellulaire.

Visualisation de réticulum endoplasmique sous-domaines dans les cellules cultivées

Une méthode de microscopie corrélative électron (CLEM) est appliquée aux structures intracellulaires Viro-induite d’image par microscopie électronique (EM) dans les cellules qui sont préalablement sélectionnés par microscopie photonique (LM). LM et EM sont combinés en une approche d’imagerie hybride pour obtenir une vision intégrée des interactions virus-hôte.

Corrélatives microscopie électronique léger (CLEM) de suivi et d’imagerie protéine virale associés Structures des cellules immobilisées Cryo

Nous présentons un protocole pour étudier la distribution des mitochondries et du réticulum endoplasmique dans les cellules entières après modification génétique utilisant la lumière corrélative et la microscopie électronique de volume comprenant la peroxidase d'ascorbate 2 et la coloration de peroxidase de raifort, sectionnement en série des cellules avec et sans le gène cible dans la même section, et imagerie en série par microscopie électronique.

Imagerie des mitochondries et du réticulum endoplasmique par microscopie corrélative de lumière et d'électron de volume

Ce protocole décrit la méthode cryoAPEX, dans laquelle une protéine de membrane APEX2-étiquetée peut être localisée par microscopie électronique de transmission dans l’ultrastructure optimale-préservée de cellules.

Méthode CryoAPEX pour l’analyse de la microscopie électronique de la localisation des protéines membranaires dans les cellules ultrastructuralement conservées

Un protocole simple et complet pour acquérir des détails tridimensionnels des sites de contact membranaire entre les organites dans les hépatocytes du foie ou les cellules d’autres tissus.

Caractérisation tridimensionnelle des sites de contact interorganelles dans les hépatocytes à l’aide de la microscopie électronique à section série

Le besoin de nouvelles approches pour étudier les sites de contact membranaire (MCS) s’est accru en raison de l’intérêt croissant pour l’étude de ces structures cellulaires et de leurs composants. Nous présentons ici un protocole qui intègre les technologies de microscopie précédemment disponibles pour identifier et quantifier les complexes protéiques intra-organites et inter-organites qui résident dans les MCS.

Visualisation et quantification des interactions endogènes intra-organites protéiques au niveau des sites de contact ER-mitochondries par des tests de ligature de proximité

Nous présentons ici un protocole de microscopie électronique optique corrélative corrélative sur coupe basé sur le marquage endogène par fluorescence comme outil pour étudier la localisation de protéines rares en relation avec l’ultrastructure cellulaire. La puissance de cette approche est démontrée par la localisation ultrastructurale de la LC3 endogène dans des cellules affamées sans traitement par la bafilomycine.

Localisation ultrastructurale de la LC3 endogène par microscopie électronique luminescente corrélative sur coupe

Nous avons mis au point un test de réassemblage de la luciférase fractionnée pour surveiller les contacts réticulum-mitochondrie endoplasmique dans les cellules vivantes. À l’aide de ce test, nous décrivons un protocole permettant de mesurer quantitativement le niveau de ces couplages inter-organites dans HEK293T cellules, dans des conditions de traitement chimique.

Essai de réassemblage de la luciférase fractionnée pour mesurer les contacts du réticulum endoplasmique et des mitochondries dans des cellules vivantes

Ce protocole décrit un mécanisme d’utilisation de la lumière corrélative et de la microscopie électronique pour visualiser l’interaction des mitochondries et des lysosomes marqués avec mEosEM et APEX2, respectivement.

Microscopie corrélative à la lumière et à l’électronique bicolore pour la visualisation des interactions entre les mitochondries et les lysosomes

Découvrez comment visualiser et quantifier les interactions réticulum endoplasmique-mitochondries dans des cellules fixes grâce à l'assay de proximité in situ. Cette méthode immunofluorescente offre une sensibilité élevée pour étudier les complexes protéiques à l'interface membrane associée mitochondriale.

Etude de réticulum endoplasmique et mitochondries Interactions par

Explorer plus de vidéos