Etude de réticulum endoplasmique et mitochondries Interactions par In Situ Proximité Ligation Assay dans des cellules fixes

L’objectif général de cette expérience est de visualiser et de quantifier les interactions entre les mitochondries du réticulum endoplasmique à l’aide d’un test de ligature de proximité in situ dans des cellules fixes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine biomédical afin de mieux analyser les interactions mitochondries du RE dans les cellules fixes à l’aide d’une technique simple d’immunofluorescence. Espérons-le, suggérant de nouvelles stratégies de traitement. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons visualiser et quantifier les interactions mitochondries du RE dans les cellules fixes et cette technique peut être appliquée aux biopsies tissulaires de patients incluses dans la paraffine. À l’aide du test de ligature de proximité in situ démontré dans cette vidéo, un anticorps primaire de souris dirigé contre VDAC1 au niveau de la membrane mitochondriale externe et un anticorps primaire de lapin dirigé contre IP3R1 au niveau de la membrane du réticulum endoplasmique se combinent à leurs épitopes à proximité au niveau de l’interface membranaire associée aux mitochondries. Des sondes de ligature de proximité qui ont des queues d’ADN attachées et qui sont dirigées contre les IgG de souris et de lapin sont ajoutées et peuvent former des modèles pour la ligature des oligonucléotides de connexion et peuvent être amplifiées et visualisées à l’aide d’oligonucléotides rouges du Texas. En accord avec la distance entre les deux membranes d’organites, à l’interface membranaire associée mitochondriale. Pour fixer et bloquer les cellules pour le test de ligature de proximité in situ, plaquez les cellules H7 humaines à 150 000 cellules par plat à fond de verre non codé de 35 mm. Le lendemain, retirez le milieu de culture et utilisez 1 mL de PBS pour laver les cellules. Ensuite, aspirez le tampon et ajoutez 1 mL de formaldéhyde à dix pour cent. Incuber les plaques à température ambiante en agitant pendant 10 minutes pour fixer les cellules. Pour arrêter la réaction, ajoutez 1 mL de glycine 1 M et mélangez les plaques par rotation. Retirer la solution de glycine et ajouter 1 mL de 1XPBS. Ensuite, agitez brièvement les plaques et aspirez le tampon. Ensuite, ajoutez 1 ml de 100 mM de glycine aux cellules. Incuber les plaques à température ambiante en agitant pendant 15 minutes. Après avoir aspiré la solution, perméabilisez les cellules en ajoutant 1 mL de triton-X100 à 0,1 % dans du PBS. Et répétez l’incubation. Aspirez le détergent et ajoutez 1 mL de PBS pour laver les cellules. Après avoir retiré le tampon, ajoutez 40 microlitres de solution bloquante dans chaque boîte de cellules et incubez les échantillons dans une chambre humide à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, tapotez la solution de blocage sur la vaisselle, en essayant d’obtenir des volumes résiduels égaux de tampon pour chaque lame sans laisser les lames sécher. Pour effectuer le test de ligature de proximité, utilisez du PBS pour diluer les anticorps primaires. Vortex et ajoutez la solution dans les plats. Incuber les échantillons à 4