Évaluation de la viabilité neuronale à l'aide de diacétate de fluorescéine-iodure de propidium Double coloration dans la culture du neurone de granulé céréalier

L'objectif général de cette procédure est de mesurer précisément la viabilité cellulaire dans une culture de neurones granulaires cérébelleux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurosciences et de la neuropharmacologie. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons distinguer les cellules gliales indésirables des neurones dans les cultures cellulaires MISTA.

Les procédures seront démontrées par Lin Jiajia, Wang Jialing et Xu Dilin, trois étudiants de premier cycle de mon laboratoire. Commencez par disséquer les têtes de rats nouveau-nés âgés de huit jours en insérant des ciseaux dans le foramen magnum et en coupant les deux côtés du crâne depuis les oreilles jusqu'aux yeux. Ensuite, utilisez une pince pour soulever le crâne.

Utilisez une pince pour isoler le cervelet et placez-le dans une boîte de 35 millimètres contenant la solution de dissection. Transférez la boîte sur la platine du microscope stéréoscopique et utilisez deux paires de pinces pour retirer les méninges et les vaisseaux sanguins. Utilisez une lame pour hacher les tissus, puis transférez le tissu dans un tube de centrifugation contenant 30 millilitres de solution de dissection.

Centrifuger pendant cinq minutes à température ambiante à 1 500 x g. Après la centrifugation, aspirer le surnageant et conserver le culot. Ensuite, ajouter la solution de trypsine au culot et resuspendre en agitant doucement.

Ensuite, placer le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après 15 minutes, ajouter une solution de DNase I, d'inhibiteur de la trypsine de soja et de sulfate de magnésium, puis agiter. Ensuite, centrifuger pendant cinq minutes à température ambiante à 1 500 × g.

Après avoir aspiré le surnageant, resuspendre le culot dans une solution de DNase I, d'inhibiteur de la trypsine de soja et de sulfate de magnésium moins diluée. Ensuite, préparer deux tubes de 15 millilitres. Répartir la moitié des cellules dans chaque tube, puis pipeter 60 à 70 fois vers le haut et vers le bas à l’aide d’une pipette de Pasteur munie d’un embout en coton afin d’homogénéiser les cellules.

Après homogénéisation, ajouter trois millilitres de solution de sulfate de magnésium et de chlorure de calcium dans chaque tube de 15 millilitres. Laisser les tubes au repos à température ambiante pendant 10 minutes. Une fois ce délai écoulé, retirer soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur munie d’un bouchon de coton et le transférer dans de nouveaux tubes de 15 millilitres.

Centrifuger pendant cinq minutes à température ambiante et à 1 500 x g. Ajouter du milieu de culture au culot pour diluer à une densité cellulaire d'environ 1,5 x 10⁶ cellules par millilitre. Prélever les cellules à la pipette et les transférer dans une plaque de 6 puits, puis les cultiver dans l'incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Après 24 heures, ajouter la solution mère d'AraC à une concentration finale de un millimolaire afin d'inhiber la croissance des cellules gliales, puis remettre les plaques dans l'incubateur. Ensuite, au jour sept, ajouter 50 microlitres de la solution mère de D-glucose à une concentration finale de un millimolaire. Commencer la coloration en mélangeant le diacétate de fluorescéine à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre et l'iodure de propidium à une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre dans 10 millilitres de PBS.

Mélangez la solution FDA/PI par vortexage et placez-la sur de la glace. Placez la plaque de culture sur de la glace. Aspirez soigneusement le milieu de culture sans toucher les cellules avec l'embout de la pipette, puis ajoutez lentement du PBS froid.

Aspirez le PBS, puis ajoutez la solution de travail froide de FDA/PI, ou de FDA/PI/Hoechst. Placez la plaque sur de la glace pendant cinq minutes. Ensuite, après avoir aspiré la solution de travail de FDA/PI ou de FDA/PI/Hoechst, ajoutez du PBS froid dans chaque puits.

Veillez à ce que le microscope à fluorescence soit correctement configuré. Détectez les émissions de fluorescence pour FDA, PI et Hoechst à 520, 620 et 460 nanomètres, respectivement, en utilisant un temps d'exposition compris entre 100 et 300 millisecondes et un gain analogique de 2,8 x. Après avoir acquis les images de fluorescence, prenez une image en lumière normale en utilisant le mode contraste de phase.

Pour une double coloration FDA/PI, superposez les images des cellules en faisant glisser la couche positive à la FDA sur la couche positive au PI dans un logiciel de retouche d'images. Ajustez l'opacité de la couche positive à la FDA en saisissant 50 % dans le champ Opacité du panneau Couches. Fusionnez les deux couches en ouvrant le menu Couche et en cliquant sur le bouton Fusionner les calques visibles.

Réglez le contraste des images superposées en entrant 50 dans le champ Contraste sous Image, Réglages, Luminosité/Contraste. Vérifiez qu’il n’y a aucune cellule doublement positive FDA et PI sur les images superposées. Pour une triple coloration FDA/PI/Hoechst, superposez les images des cellules en glissant à nouveau la couche positive pour la FDA sur la couche positive pour le PI, en ajustant l’opacité de la couche positive pour la FDA et en fusionnant les images comme précédemment.

Ensuite, faites glisser la couche positive pour l'Hoechst sur la couche fusionnée. Ajustez l'opacité de la couche positive pour l'Hoechst en saisissant 50 % dans le champ Opacité du panneau Couches, puis fusionnez les deux couches en ouvrant le menu Couche et en cliquant sur le bouton Fusionner les calques visibles. Distinguez visuellement les grandes cellules gliales irrégulières des neurones granulaires cérébelleux en comparant les images prises en mode fluorescent à celles prises en mode contraste de phase.

Les images suivantes montrent la présence de neurones petits et de cellules gliales grandes et irrégulières dans la culture de CGN. Cette image montre la coloration immunohistochimique de la protéine GAP-43 dans une culture de CGN après huit jours in vitro. Les flèches bleues indiquent les neurones.

Ici, la coloration immunohistochimique de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) des cellules gliales est présentée. La flèche blanche indique une cellule gliale. Cette image en contraste de phase montre la morphologie des cellules.

La coloration par le marquage FDA/PI, qui permet de distinguer les cellules gliales des neurones, est avantageuse pour une évaluation précise de la viabilité neuronale dans une culture de CGN. Il s'agit d'une image fusionnée de cellules triplement colorées cultivées dans un milieu de croissance normal. La flèche indique une cellule gliale typique.

Ici, une culture similaire a été traitée avec un milieu contenant une faible concentration de potassium, et la flèche indique à nouveau une cellule gliale typique. Remarquez également l'apparition de la coloration rouge par l'iodure de propidium. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est effectuée correctement.

Une stratégie similaire peut être appliquée à d'autres cultures cellulaires mixtes, telles que les cultures corticales primaires et les cultures hippocampiques primaires, afin d'analyser précisément la viabilité neuronale.