Évaluation de la viabilité neuronale à l'aide de diacétate de fluorescéine-iodure de propidium Double coloration dans la culture du neurone de granulé céréalier

L’objectif global de cette procédure est de mesurer avec précision la viabilité cellulaire dans une culture de neurones à granules cérébelleux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences et de la neuropharmacologie. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons distinguer les cellules gliales indésirables des neurones dans les cultures cellulaires MISTA.

Lin Jiajia, Wang Jialing, Xu Dilin, trois étudiants de premier cycle de mon laboratoire, feront la démonstration des procédures. Commencez à disséquer la tête de ratons âgés de huit jours en insérant d’abord des ciseaux dans le foramen magnum et en coupant les deux côtés du crâne, des oreilles aux yeux. Ensuite, utilisez des pinces pour soulever le crâne.

À l’aide d’une pince, isolez le cervelet et placez-le dans une boîte de 35 millimètres contenant une solution de dissection. Transférez la plaque sur la platine du microscope de dissection et utilisez deux paires de pinces pour retirer les méninges et les vaisseaux sanguins. Utilisez une lame pour hacher les tissus, puis transférez les tissus dans un tube à centrifuger contenant 30 millilitres de solution de dissection.

Centrifuger pendant cinq minutes à température ambiante à 1 500 x g. Après la centrifugation, aspirer le surnageant et conserver la pastille. Ensuite, ajoutez la solution de trypsine à la pastille et remettez en suspension en secouant doucement.

Placez ensuite le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après 15 minutes, ajoutez une solution de DNase One, d’inhibiteur de trypsine de soja et de sulfate de magnésium, et agitez. Ensuite, centrifugez pendant cinq minutes à température ambiante à 1 500 x g.

Après avoir aspiré le surnageant, remettre la pastille en suspension dans une solution de DNase One moins diluée, d’inhibiteur de trypsine de soja et de sulfate de magnésium. Ensuite, préparez deux tubes de 15 millilitres. Placez la moitié des cellules dans chaque tube et pipetez 60 à 70 fois vers le haut et vers le bas à l’aide d’une pipette Pasteur bouchée de coton pour homogénéiser les cellules.

Après homogénéisation, ajoutez trois millilitres de solution de sulfate de magnésium et de chlorure de calcium dans chaque tube de 15 millilitres. Laissez les tubes reposer à température ambiante pendant 10 minutes. Une fois le temps écoulé, retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur bouchée de coton et transférez-le dans de nouveaux tubes de 15 millilitres.

Centrifugez pendant cinq minutes à température ambiante et 1 500 x g. Ajoutez du milieu de culture à la pastille pour diluer à une densité cellulaire d’environ 1,5 x 10 à six cellules par millilitre. Pipetez les cellules dans une plaque à 6 puits et cultivez-les dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Après 24 heures, ajoutez la solution mère d’AraC à une concentration finale d’un millimolaire pour inhiber la croissance des cellules gliales avant de retourner les plaques dans l’incubateur. Ensuite, le septième jour, ajoutez 50 microlitres à la solution mère de D-glucose jusqu’à une concentration finale d’un millimolaire. Commencez la coloration en mélangeant du diacétate de fluorescéine à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre et de l’iodure de propidium à une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre et 10 millilitres de PBS.

Mélangez la solution FDA/PI par vortex et placez-la sur de la glace. Placez la plaque de culture sur de la glace. Aspirez soigneusement le milieu de culture sans toucher les cellules avec la pointe de la pipette, puis ajoutez lentement du PBS froid.

Aspirez le PBS, puis ajoutez la solution de travail FDA/PI froide ou FDA/PI Hoechst. Mettez l’assiette sur de la glace pendant cinq minutes. Ensuite, après avoir aspiré la solution de travail FDA/PI ou FDA/PI/Hoechst, ajoutez du PBS froid dans chaque puits.

Assurez-vous que le microscope fluorescent est correctement installé. Détectez les émissions fluorescentes pour FDA, PI et Hoechst à 520, 620 et 460 nanomètres, respectivement, en utilisant un temps d’exposition compris entre 100 et 300 millisecondes et un gain analogique de 2,8 x. Après avoir collecté des images de fluorescence, prenez une image sous une lumière normale en utilisant le mode de contraste de phase.

Pour la double coloration FDA/PI, superposez les images des cellules en faisant glisser la couche positive FDA sur la couche positive PI dans le logiciel d’édition graphique. Ajustez l’opacité du calque positif FDA en saisissant 50 % dans le champ Opacité du panneau Calques. Fusionnez deux calques en ouvrant le menu Calque et en cliquant sur le bouton Fusionner visible.

Définissez le contraste des images superposées en saisissant 50 dans le champ Contraste sous Image, Réglages, Luminosité/Contraste. Vérifiez qu’il n’y a pas de cellules doubles positives FDA et PI dans les images de superposition. Pour la triple coloration FDA/PI/Hoechst, superposez les images des cellules en faisant à nouveau glisser la couche positive FDA sur la couche positive PI, en ajustant l’opacité de la couche positive FDA et en fusionnant les images comme précédemment.

Faites ensuite glisser le calque positif Hoechst sur le calque fusionné. Ajustez l’opacité du calque positif Hoechst en entrant 50 % dans le champ Opacité du panneau Calques, et fusionnez les deux calques en ouvrant le menu Calque et en cliquant sur le bouton Fusionner visible. Distinguez visuellement les grandes cellules gliales irrégulières des neurones granulaires cérébelleux en comparant les images prises en mode fluorescent avec celles prises en mode contraste de phase.

Les images suivantes montrent que de petits neurones et de grandes cellules gliales irrégulières sont présents dans la culture CGN. Cette image montre la coloration aminée GAP-43 d’une culture CGN à huit jours in vitro. Les flèches bleues indiquent les neurones.

Ici, la coloration aminée GFAP des cellules gliales est montrée. La flèche blanche indique une cellule gliale. Cette image en contraste de phase montre la morphologie des cellules.

La coloration en crochet FDA/PI, qui permet de distinguer les cellules gliales des neurones, est avantageuse pour l’évaluation précise de la viabilité neuronale en culture CGN. Il s’agit d’une image fusionnée de cellules triplement colorées cultivées dans un milieu de croissance normal. La flèche montre une cellule gliale typique.

Ici, une culture similaire a été traitée avec un milieu contenant peu de potassium, et la flèche indique à nouveau une cellule gliale typique. Notez également l’apparition d’une coloration à l’iodure de propidium rouge. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est exécutée correctement.

Une stratégie similaire peut être appliquée à d’autres cultures de cellules mixtes, telles que les cultures corticales primaires et les cultures primaires de l’hippocampe pour analyser avec précision la viabilité neuronale.