Name: Analyse modifiée des fragments de restriction des terminaux pour quantifier la longueur de télomère à laide de lhybridation en gel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-10T10:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Apprenez une méthode modifiée d'analyse des fragments de restriction des télomères pour mesurer directement la longueur des télomères en kilobases dans diverses cellules eucaryotes. Cette technique améliore l'intensité du signal et minimise la perte d'ADN.

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Les auteurs reconnaissent le soutien de l&#39;installation partagée de l&#39;Université de Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral Oncology, soutenue en partie par le prix P30CA047904.

<ol><li>Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="https://utsouthwestern.influuent.utsystem.edu/en/publications/analysis-of-telomeres-and-telomerase">Analysis of telomeres and telomerase.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 18 Unit 18 16(2003).</li>
<li>Mender, I., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+Restriction+Fragment+%28TRF%29+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis.</a> Bio Protoc. 5 (22), (2015).</li>
<li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+Telomerase%3A+The+Means+to+the+End+%28Nobel+lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).</li>
<li>Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+Discovery%3A+The+Excitement+of+Putting+Together+Pieces+of+the+Puzzle+%28Nobel+lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).</li>
<li>Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Ends%3A+Just+the+Beginning+%28Nobel+lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).</li>
<li>Watson, J. M., Riha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres%2C+Aging%2C+and+Plants%3A+From+Weeds+to+Methuselah+-+A+Mini-Review%5BTitle%5D)+AND+%22Gerontology%22%5BJournal%5D)">Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah - A Mini-Review.</a> Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).</li>
<li>Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres-Structure%2C+Function%2C+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Telomeres-Structure, Function, and Regulation.</a> Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).</li>
<li>MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+Regulation+from+Beginning+to+the+End%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Telomerase Regulation from Beginning to the End.</a> Genes (Basel). 7 (9), 64(2016).</li>
<li>Fouquerel, E., Opresko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+The+Nobel+Fields+of+Telomere+Biology+and+DNA+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair.</a> Photochem Photobiol. , Epub ahead of print (2016).</li>
<li>Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+Cellular+Senescence.+Telomere+Shortening+as+a+Marker+of+Cellular+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence.</a> Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).</li>
<li>Opresko, P. L., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere-Associated+Aging+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Telomere-Associated Aging Disorders.</a> Ageing Res Rev. , Epub ahead of print 1568-1637 (2016).</li>
<li>Chiodi, I., Mondello, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+and+Telomerase+Stability+in+Human+Diseases+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).</li>
<li>Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Telomere+Biology%3A+A+Contributory+and+Interactive+Factor+in+Aging%2C+Disease+Risks%2C+and+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection.</a> Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).</li>
<li>Lindqvist, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychiatric+Disorders+and+Leukocyte+Telomere+Length%3A+Underlying+Mechanisms+Linking+Mental+Illness+with+Cellular+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Biobehav+Rev%22%5BJournal%5D)">Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging.</a> Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).</li>
<li>Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+in+Molecular+Epidemiology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Mol+Biol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Telomeres in Molecular Epidemiology Studies.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 125 (113), (2014).</li>
<li>Kimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+telomere+length+by+the+Southern+blot+analysis+of+terminal+restriction+fragment+lengths%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).</li>
<li>Haussmann, M. F., Mauck, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TECHNICAL+ADVANCES%3A+New+strategies+for+telomere-based+age+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation.</a> Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).</li>
<li>Nussey, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+telomere+length+and+telomere+dynamics+in+evolutionary+biology+and+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology.</a> Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).</li>
<li>Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+telomere+sequences+in+birds%3A+evidence+for+arrays+of+extreme+length+and+for+in+vivo+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Cell+Genet%22%5BJournal%5D)">Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening.</a> Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).</li>
<li>Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+FISH+to+measure+the+average+length+of+telomeres+%28flow+FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH).</a> Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).</li>
<li>Sanders, J. L., Newman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+in+epidemiology%3A+a+biomarker+of+aging%2C+age-related+disease%2C+both%2C+or+neither%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither.</a> Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).</li>
<li>Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+are+partly+shielded+from+ultraviolet-induced+damage+and+proficient+for+nucleotide+excision+repair+of+photoproducts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts.</a> Nat Commun. 6, 8214(2015).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Après électrophorèse, le frottis d&#39;ADN génomique est supérieur à 800 pb. Cela peut se produire si les enzymes de restriction sont défectueuses ou si des enzymes supplémentaires (comme décrit ci-dessus) sont nécessaires. Une deuxième explication possible est que la protéine est toujours attachée à l&#39;ADN. Lors de la détermination de la concentration d&#39;ADN par spectrophotomètre, le ratio 260/280 devrait être d&#39;environ 1,8. Si ce rapport est &lt;1,5, il existe une contamination des protéines qui peut entrave...

Les télomères, situés aux extrémités des chromosomes, sont des répétitions nucléotidiques de la séquence TTAGGG (sur les chromosomes humains) qui jouent un rôle essentiel dans la protection de l&#39;information génétique cellulaire 3 , 4 , 5 . Les télomères ont plusieurs milliers de paires de bases et servent à protéger l&#39;intégrité du reste du chromosome pendant la réplication de l&#39;ADN. La réplication des chromosomes n&#39;est pas parfaite, de sorte que les extrémités du chromosome ne sont pas complètement copiées. Cette inefficacité dans la réplication est appelée «problème de réplication de fin» et entraîne la perte de certaines des répétitions de télomères au cours de chaque cycle de réplication 6 , 7 . La longueur de la télomère peut être restaurée après la division cellulaire par la télomérase, une enzyme qui remplace les séquences des télomères perdus 8 , 9 . La télomérase, cependant, n&#39;est pasActivé dans la plupart des cellules somatiques humaines et, par conséquent, au fil du temps, les télomères se raccourciront, entraînant éventuellement une sénescence cellulaire 10 . En raison du raccourcissement des télomères, les télomères sont considérés comme un biomarqueur du vieillissement et le risque de maladies liées à l&#39;âge 11 , 12 . En outre, la longueur des télomères peut être affectée par des facteurs génétiques, environnementaux et de style de vie et d&#39;autres stimuli tels que le stress oxydatif, ce qui indique que la longueur des télomères peut jouer un rôle de biomarqueur dans les études toxicologiques, épidémiologiques et comportementales 13 , 14 , 15 . Cet article démontre une technique de mesure de la longueur des télomères en utilisant une analyse de fragment de restriction terminale modifiée (TRF) adaptée de Mender et Shay 2 et Kimura et al. 16 , et similaire à Herbert, Shay et WrigHt 1 et Haussmann et Mauck 17 . Traditionnellement, l&#39;analyse des TRF implique une procédure Southern Blot. Les transferts de Southern sont considérés comme «l&#39;étalon de l&#39;or» pour étudier la longueur des télomères et sont activement utilisés pour examiner la longueur des télomères leucocytaires dans les études épidémiologiques 18 . Cette analyse TRF utilise l&#39;ADN génomique digéré en laissant les répétitions des télomères. Les fragments d&#39;ADN sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel, dénaturés et transférés sur une membrane de nitrocellulose. Les séquences de télomères sont hybridées avec une sonde d&#39;oligonucléotide télomère. Plutôt que de transférer les télomères séparés sur une membrane, d&#39;autres techniques de TRF utilisent des techniques d&#39;hybridation en gel avec et sans dénaturation de l&#39;ADN. L&#39;inclusion de la dénaturation est importante lorsque l&#39;on considère la détection des télomères interstitiels, qui ont été signalés dans certaines espèces 19 . Les procédures qui ne comportent pas les étapes de dénaturationLes rayons d&#39;ADN monocaténaires sur les télomères terminaux et ne se lient pas aux séquences interstitielles des télomères 18 . Outre l&#39;analyse TRF, il existe plusieurs autres techniques de mesure de la longueur des télomères qui ont chacun leurs propres avantages et inconvénients. La technique Flow-FISH peut mesurer la longueur moyenne des télomères de cellules individuelles d&#39;un type cellulaire distinct en utilisant la cytométrie en flux 16 , 20 . Bien qu&#39;il puisse étiqueter avec précision des télomères avec des sondes hautement spécifiques et réduire les erreurs humaines par l&#39;automatisation, Flow-FISH est coûteux, moins efficace et nécessite des échantillons frais et un technicien hautement qualifié, ce qui limite sa capacité à des études épidémiologiques 16 . En outre, cette méthode ne tient pas compte des changements potentiels dans le nombre de chromosomes dans la population cellulaire. Une autre technique, qPCR, est largement acceptée comme moyen de mesure de la longueur des télomères pour les études épidémiologiques <suP class = &quot;xref&quot;&gt; 16 en raison de son débit élevé, son coût réduit et son exigence pour de petites quantités d&#39;ADN par rapport à d&#39;autres méthodes. Cependant, qPCR ne peut mesurer que le contenu d&#39;ADN telomérique moyen par rapport à un gène de copie unique et est donc une estimation indirecte de la longueur moyenne des télomères. Il fournit également un coefficient de variance élevé dans les études de comparaison, par rapport aux transferts du sud, ce qui entraîne une précision douteuse 21 . La procédure TRF a ses propres lacunes qui limitent son utilisation pour certaines études. Les techniques TRF nécessitent une grande quantité d&#39;ADN par rapport à d&#39;autres méthodes (entre 2 et 3 μg par échantillon). Cela limite les applications de la technique à l&#39;examen de la longueur des échantillons cliniques des télomères pour lesquels un ADN génomique suffisant peut être collecté et ne peut être utilisé sur des échantillons d&#39;ADN dégradés. De plus, l&#39;analyse des TRF est coûteuse et nécessite beaucoup de main-d&#39;œuvre, nécessitant 4 à 5 jours pour produire des résultats. Cependant, le TRF donne un faible coefficient de varianceEn accordant sa reproductibilité. Alors que ce protocole est différent de l&#39;échappement Southern traditionnel (utilisant une hybridation sur gel in situ), les deux techniques sont fondamentalement les mêmes. La technique présentée ici est une combinaison d&#39;un transfert de Southern et d&#39;une hybridation en gel; Associant l&#39;étape de dénaturation d&#39;ADN des transferts de Southern avec l&#39;hybridation en gel. Cette combinaison a le bénéfice supplémentaire de la puissance du signal de sonde améliorée par rapport au transfert de Southern et a consisté à produire des résultats quantifiables dans notre laboratoire. En outre, l&#39;utilisation de sondes radioactives plutôt que de sondes chimioluminescentes donne une intensité de signal plus élevée et permet la visualisation et la quantification avec un agent de phosphorimagerie, ce qui rend les analyses du TRF faciles à utiliser.

<table><tbody><tr><td>Biologics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rsa1, enzyme de restriction</td><td>New England Biolabs, Inc</td><td>R0167S</td><td>10 000 U/mL, digestion de l’ADN. Livré avec Cutsmart Buffer (tampon de digestion)</td></tr> <tr><td>Hinf1, enzyme de restriction</td><td>New England Biolabs, Inc</td><td>R0155S</td><td>10 000 U/mL, digestion de l’ADN. Livré avec Cutsmart Buffer (tampon de digestion)</td></tr><tr><td>Seakem GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50071</td><td>agarose de qualité électrophorèse</td></tr><tr><td>Optikinase&nbsp ;</td><td>affymetrix</td><td>78334X 500 UN</td><td>T4 Polynucléotide kinase</td></tr><tr><td>SYBR Vert Teinture d’acide nucléique I</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7567</td><td>Syber Green</td></tr><tr><td>exactGene Échelle d’ADN 24- kB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2580100</td><td></td></tr><tr><td>Sonde à brin C (3'-(G3AT2)4-'5)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>Oligonucléotide d’ADN commandé sur mesure</td></tr><tr><td>Gamma-ATP-P32</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z</td><td>Radio-isotope</td></tr><tr><td>Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>13323</td><td>Kit d’extraction d’ADN</td></tr><tr><td>GE Illustra Microspin G-25 colonne</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-5325-01</td><td>Pour la purification de la sonde oligo réactive</td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td></td><td></td><td>polymère synthétique non ionique</td></tr><tr><td><fort>Équipement/Logiciel</fort> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système d’électrophorèse sur gel Owl A5 (20 cm x 25 cm)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A5</td><td>Système d’électrophorèse sur</td></tr><tr><td>gel Horizon 11.4 (11 cm x 14 cm)</td><td>Corel Life Sciences</td><td>11068020</td><td>Électrophorèse sur gel</td></tr><tr><td>Maille en nylon, 50, 12 » x 12</td>"<td>Ted Pellam, Inc</td><td>41-12105</td><td></td></tr><tr><td>Écrans de stockage au phosphore GE</td><td>Healthcare Sciences de la vie</td><td>28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>Cassette d’exposition à écran au phosphore</td><td>GE Healthcare Sciences de la vie</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur d’hybridation Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-20Q</td><td></td></tr><tr><td>Tubes d’hybridation cylindriques</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-300</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur orbital The Belly Dancer</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Z768499-1EA</td><td>Agitateur orbital</td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>ABI</td><td></td><td>Pour l’imagerie de gels et d’écrans de phosphore</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6</td><td>GraphPad</td><td>Version 6.05</td><td>Programme graphique</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>Office 365</td><td>Tableur</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrp 2000</td><td>Spectrophotomètre</td></tr></tbody></table>

analyse modifiée des fragments de restriction des terminaux pour quantifier la longueur de télomère à l&#39;aide de l&#39;hybridation en gel

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

Il existe plusieurs techniques différentes pour mesurer la longueur des télomères, chacune avec leurs propres avantages et inconvénients. L&#39;approche traditionnelle, l&#39;analyse du fragment de restriction Telomere (TRF), utilise une technique d&#39;hybridation d&#39;ADN dans laquelle les échantillons d&#39;ADN génomique sont digérés avec des enzymes de restriction, laissant derrière eux des répétitions d&#39;ADN de télomères et un certain ADN sous-télomérique. Ceux-ci sont séparés par une électrophorèse sur gel d&#39;agarose, transférés dans une membrane filtrante et hybridés à des sondes oligonucléotidiques marquées avec chimioluminescence ou radioactivité pour visualiser des fragments de restriction telomère. Cette approche, tout en nécessitant une plus grande quantité d&#39;ADN que d&#39;autres techniques telles que la PCR, peut mesurer la répartition de la longueur des télomères d&#39;une population de cellules et permet une mesure exprimée en kilobases absolues. Ce manuscrit démontre une procédure d&#39;hybridation d&#39;ADN modifiée pour déterminer la longueur des télomères. L&#39;ADN génomique est d&#39;abord digéré avec des enzymes de restriction (qui ne coupent pasTélomères) et séparés par électrophorèse sur gel d&#39;agarose. Le gel est ensuite séché et l&#39;ADN est dénaturé et hybride in situ à une sonde oligonucléotidique radiomarquée. Cette hybridation in situ évite la perte d&#39;ADN des télomères et améliore l&#39;intensité du signal. Après l&#39;hybridation, les gels sont imagés à l&#39;aide d&#39;écrans phosphores et la longueur des télomères est quantifiée à l&#39;aide d&#39;un programme graphique. Cette procédure a été développée par les laboratoires des Drs. Woodring Wright et Jerry Shay à l&#39;Université du Texas Southwestern 1 , 2 . Ici, nous présentons une description détaillée de cette procédure, avec quelques modifications.

Trois concentrations d&#39;ADN (1, 2 et 3 μg) isolées à partir de la lignée cellulaire BJ-HTERT (fibroblastes de prépuce humain immortalisé par la télomérase) 22 et des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) ont été analysées pour la longueur des télomères. Le tableau 1 montre les affectations de voies pour chaque échantillon d&#39;ADN. La figure 1 montre une tache fluorescente d&#39;acide nucléiqu...

Dans cet article, un protocole détaillé pour quantifier la longueur des télomères en utilisant une analyse de fragment de restriction terminale modifiée est discuté qui fournit une mesure directe rapide et efficace de la longueur des télomères. Cette technique peut être appliquée à une variété de sources cellulaires d&#39;ADN pour quantifier la longueur des télomères.

Analyse modifiée des fragments de restriction des terminaux pour quantifier la longueur de télomère à l&#39;aide de l&#39;hybridation en gel

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer la longueur des télomères dans des cellules eucaryotes à l'aide d'une version modifiée de la méthode d'analyse des fragments de restriction télomériques, telle que décrite par les Docteurs Jerry W. Shay, Woodring Wright et leurs collègues. En fournissant des données sur la longueur des télomères, cette procédure permet de répondre à des questions en biologie cellulaire, en médecine comportementale, en épidémiologie et en maladies infectieuses, concernant les effets de l'âge, du stress, des traitements médicamenteux et des infections. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'elle fournit une mesure directe, en kilobases, de la longueur moyenne des télomères dans divers types cellulaires.Les échantillons d'ADN génomique à analyser ont été extraits de cellules à l'aide d'un kit commercial d'extraction d'ADN, comme décrit dans le protocole écrit. Effectuez la digestion de l'ADN génomique dans un volume final de 20 à 40 microlitres. Mélangez les composants suivants dans chaque tube de microcentrifugation : trois microgrammes d'ADN génomique ; tampon de digestion d'ADN 10x ; un microlitre de l'enzyme de restriction Rsa1 ; un microlitre de l'enzyme de restriction Hinf1 ; et de l'eau stérile désionisée jusqu'au volume final.Centrifuger brièvement pour s'assurer que tous les composants se trouvent au fond du tube. Incuber les digestions à 37 degrés Celsius pendant au moins 16 heures. Commencer cette procédure en préparant une solution d'agarose à 0,6 %, comme décrit dans le protocole écrit.Préparez le système d'électrophorèse sur gel pour la coulée du gel. Fixez les écluses d'extrémité sur le plateau de coulée. Une fois que la solution d'agarose a refroidi à 50 degrés Celsius, versez-la dans le plateau de coulée, insérez un peigne dans le gel et laissez le gel durcir pendant 45 minutes à température ambiante, sans couvercle.Retirez les portes d'extrémité du plateau de coulée et retirez le peigne du gel. Remplissez le système d'électrophorèse avec du tampon d'électrophorèse jusqu'à la ligne de remplissage, en veillant à ce que le gel soit complètement immergé dans le tampon. Chargez les puits du gel avec les échantillons d'ADN, en laissant un puit vide entre chaque échantillon.Ajouter 10 microlitres d’un échelle d’ADN dans les puits situés aux extrémités opposées du gel. Faire migrer l’électrophorèse sur gel à 150 volts pendant 30 minutes afin de déplacer rapidement l’ADN dans le gel. Après 30 minutes, régler la tension à 57 volts et faire migrer pendant 18 à 24 heures.Après avoir fait migrer le gel pendant 18 à 24 heures, éteignez la source d'électrophorèse et retirez le plateau de coulée avec le gel du tampon d'électrophorèse. Découpez le coin supérieur droit du gel afin de servir de repère pour l'orientation du gel. Découpez un morceau de papier filtre à une taille légèrement supérieure à celle du gel.Placer le papier filtre sur le gel dans un bac de coulée, et laisser le papier absorber la solution excédentaire présente sur le gel. Retirer soigneusement les bulles d'air situées entre le papier filtre et le gel, en utilisant une pipette comme rouleau pour chasser les bulles par les côtés. Retirer le gel du bac de coulée en retournant l'ensemble gel et papier filtre, de sorte que le papier se retrouve sous le gel.Transférez le gel avec le papier filtre vers un séchoir à gel et recouvrez le gel d'une pellicule plastique. Éliminez toutes les bulles d'air entre la pellicule plastique et le gel à l'aide d'une pipette utilisée comme rouleau. Sèchez le gel à 50 degrés Celsius pendant deux heures.Une fois le gel séché, retirez l’emballage en plastique et transférez le gel et le papier filtre dans un récipient en verre contenant 250 millilitres d’eau déionisée. Retirez soigneusement le papier filtre et incubez le gel à température ambiante pendant 15 minutes. Disposez le gel sur un treillis en nylon de 12 sur 12 pouces.Enroulez ensemble le tamis en nylon et le gel en veillant à ce que le gel ne soit pas en contact avec lui-même. Placez le tamis et le gel dans un tube d'hybridation. Mélangez 100 millilitres de SSC 5x et 12 microlitres de colorant nucléique fluorescent vert, puis ajoutez le mélange dans le tube d'hybridation.Incuber pendant 30 minutes à 42 degrés Celsius dans un four d'hybridation en rotation. Protéger la solution de la lumière. Au bout de 30 minutes, retirer la membrane en nylon et le gel du tube d'hybridation.Dérouler délicatement et placer à plat dans un plat en verre contenant 250 millilitres d'eau déionisée. Retirer soigneusement la maille en nylon. Imager le gel à l'aide d'un phosphorimager avec les paramètres indiqués.Préparez la sonde radioactive de télomère en suivant les réglementations de l'installation pour la manipulation des matières radioactives. Dans un tube de microcentrifugeuse, mélangez les composants suivants : deux microlitres de sonde de télomère ; 2,5 microlitres de tampon de réaction 10x polynucléotide kinase ; trois microlitres d'ATP marquée sur le groupe phosphate gamma avec du P32 ; quatre microlitres de T4 polynucléotide kinase ; et de l'eau déionisée stérile sans DNase jusqu'à un volume final de 20 microlitres. Centrifugez brièvement le tube.Incuber le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant une heure. Faire une courte centrifugation du tube, puis incuber à 65 degrés Celsius pendant 20 minutes pour arrêter la réaction. Charger la solution de sonde radioactive dans une colonne de chromatographie G25 préparée et centrifuger pendant deux minutes à 700 fois g.Conserver le filtrat, qui contient la sonde radioactive de télomère. Placer le gel dans un récipient en verre contenant 250 millilitres de solution de dénaturation et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Éliminer la solution de dénaturation et la remplacer par 250 millilitres d'eau stérile désionisée.Incuber pendant 10 minutes sur un agitateur orbital à température ambiante. Éliminer l'eau désionisée. Remplacer par 250 millilitres de solution de neutralisation et incuber pendant 15 minutes à température ambiante.Enroulez le gel dans un maillage en nylon et placez-le dans le tube d'hybridation. Ajoutez 20 millilitres de la solution d'hybridation et incubez au four d'hybridation à 42 degrés Celsius pendant 10 minutes avec agitation rotative. Après 10 minutes, retirez la solution d'hybridation et remplacez-la par 20 millilitres de solution d'hybridation fraîche.Ajouter l'intégralité de la sonde télomérique et incuber toute la nuit dans un four d'hybridation à 42 degrés Celsius avec rotation. Une fois l'hybridation avec la sonde télomérique terminée, retirer le gel et la membrane du tube d'hybridation et les placer dans un plat en verre contenant 250 millilitres de SSC 2x. Dérouler et retirer la membrane en nylon du plat.Placer le plat en verre sur un agitateur orbital et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Éliminer le 2x SSC, le remplacer par 250 millilitres de solution 0,1x SSC contenant 0,1 % de SDS, puis incuber pendant 15 minutes sur l'agitateur orbital à température ambiante. Éliminer la solution de 0,1x SSC contenant 0,1 % de SDS.Remplacer par 250 millilitres de SSC 2x et incuber encore 15 minutes sur l’agitateurmélangeur orbital. Retirer le gel du SSC 2x et enrouler le gel dans un film plastique. Éliminer toutes les bulles et poches d’air entre le gel et le film plastique.Placez le gel dans une cassette d'exposition avec un écran phosphorescent et exposez l'écran phosphorescent au gel toute la nuit. Le jour suivant, utilisez un imageur phosphorescent pour obtenir une image de l'écran phosphorescent exposé. Les images phosphorescentes sont ensuite utilisées pour la quantification de la longueur des télomères, comme décrit dans le protocole textuel.Trois concentrations d'ADN isolées d'une lignée cellulaire de fibroblastes de prépuce humain immortalisés et de cellules mononucléées du sang périphérique humain ont été analysées pour déterminer la longueur des télomères. Cette image phosphorimétrique du gel d'agarose séché, coloré avec un colorant nucléique fluorescent vert, montre la position des bandes de l'échelle d'ADN dans les sillons un et huit. La distance mesurée depuis le haut du gel jusqu'à chaque standard de poids moléculaire est indiquée par des flèches bleues.Après hybridation avec une sonde de télomère, les bandes de télomères apparaissent sous forme de traînées dans chaque piste. Des grilles de 150 cases ont été calculées pour chaque piste, plus une piste de fond. Les zones sélectionnées pour l'analyse de chaque série d'échantillons sont indiquées.Des pistes de fond marquées B ont été sélectionnées pour chaque série d'échantillons afin de garantir que les intensités de fond soient similaires pour chaque ensemble d'échantillons. Les calculs de la longueur moyenne des télomères ont révélé une longueur moyenne des télomères plus élevée dans la lignée cellulaire immortalisée par rapport aux cellules mononucléées du sang périphérique humain. Ces résultats démontrent également que la quantité d'ADN génomique analysée dans chaque piste est essentielle pour obtenir un signal détectable après hybridation.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 12 heures réparties sur 2 jours et demi, avec deux incubations nocturnes si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser au moins trois microgrammes d'ADN pour chaque échantillon et de mesurer chaque échantillon en double. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du vieillissement pour explorer les mécanismes responsables du maintien de la longueur des télomères chez différentes espèces animales, y compris les humains.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de déterminer directement la longueur moyenne des télomères eux-mêmes. N'oubliez pas que le travail avec des substances radioactives peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port d'une blouse de laboratoire et de gants doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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