Analyse modifiée des fragments de restriction des terminaux pour quantifier la longueur de télomère à l'aide de l'hybridation en gel

L’objectif global de cette procédure est de déterminer la longueur des télomères dans les cellules eucaryotes à l’aide d’une version modifiée d’une procédure d’analyse de fragments de restriction de télomères, décrite par les docteurs Jerry W.Shay, Woodring Wright et leurs collègues. En fournissant des données sur la longueur des télomères, la procédure peut répondre à des questions sur la biologie cellulaire, la médecine comportementale, l’épidémiologie et les maladies infectieuses, sur les effets de l’âge, du stress, des traitements médicamenteux et des infections. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de mesurer directement, en kilobases, la longueur moyenne des télomères dans une variété de cellules.

Les échantillons d’ADN génomique à analyser ont été extraits de cellules à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN commercial, tel que décrit dans le protocole textuel. Effectuez la digestion de l’ADN génomique dans un volume final de 20 à 40 microlitres. Combinez les éléments suivants dans chaque tube de microcentrifugation : trois microgrammes d’ADN génomique ; 10x tampon de digestion d’ADN ; un microlitre d’enzyme de restriction Rsa1 ; un microlitre d’enzyme de restriction Hinf1 ; et de l’eau stérile et désionisée jusqu’au volume final.

Centrifugez brièvement pour vous assurer que tous les composants sont au fond du tube. Incuber les digestions à 37 degrés Celsius, pendant au moins 16 heures. Commencez cette procédure en préparant une solution d’agarose à 0,6 % comme décrit dans le protocole texte.

Préparez le système d’électrophorèse sur gel pour la coulée de gel. Fixez les portes d’extrémité au plateau de coulée de gel. Une fois que la solution de gel d’agarose a refroidi à 50 degrés Celsius, versez-la dans le plateau de coulée de gel, placez un cône dans le gel et laissez le gel durcir pendant 45 minutes à découvert à température ambiante.

Retirez les portes d’extrémité du plateau de coulée et retirez le peigne du gel. Remplissez le système d’électrophorèse sur gel, avec un tampon d’électrophorèse jusqu’à la ligne de remplissage, en veillant à ce que le gel soit complètement immergé dans le tampon. Chargez les puits du gel avec les échantillons d’ADN, en laissant un puits vide entre les échantillons.

Ajoutez 10 microlitres d’une échelle d’ADN dans les puits aux extrémités opposées du gel. Faites fonctionner l’électrophorèse sur gel à 150 volts pendant 30 minutes, pour déplacer rapidement l’ADN dans le gel. Après 30 minutes, ajustez la tension à 57 volts et faites fonctionner pendant 18 à 24 heures.

Après que le gel ait fonctionné pendant 18 à 24 heures, éteignez la source d’électrobolorèse et retirez le plateau de coulée de gel avec le gel du tampon d’électrobolorèse. Tranche du coin supérieur droit du gel pour servir de référence pour l’orientation du gel. Coupez un morceau de papier filtre à une taille légèrement plus grande que le gel.

Placez le papier filtre sur le gel dans un plateau de coulée et laissez le papier absorber l’excès de solution sur le gel. Retirez soigneusement les bulles d’air entre le papier filtre et le gel, à l’aide d’une pipette comme rouleau pour faire sortir les bulles par les côtés. Retirez le gel du plateau de coulée en retournant le gel et le papier filtre de manière à ce que le papier se trouve sous le gel.

Transférez le gel avec le papier filtre dans un séchoir à gel et couvrez le gel d’une pellicule plastique. Retirez toutes les bulles d’air entre la pellicule plastique et le gel à l’aide d’une pipette comme rouleau. Faites sécher le gel à 50 degrés Celsius pendant deux heures.

Une fois le gel sec, retirez la pellicule plastique et transférez le gel et le papier filtre dans un plat en verre contenant 250 millilitres d’eau déminéralisée. Retirez délicatement le papier filtre et incubez le gel à température ambiante pendant 15 minutes. Posez le gel sur un filet en nylon de 12 x 12 pouces.

Roulez la maille de nylon et le gel ensemble en vous assurant que le gel n’est pas en contact avec lui-même. Placez le filet et le gel dans un tube d’hybridation. Combinez 100 millilitres de 5x SSC et 12 microlitres de colorant d’acide nucléique fluorescent vert, et placez-les dans le tube d’hybridation.

Incuber pendant 30 minutes à 42 degrés Celsius dans un four d’hybridation avec rotation. Protégez la solution de la lumière. Après 30 minutes, retirez la maille de nylon et le gel du tube d’hybridation.

Roulez et placez-le à plat dans un plat en verre contenant 250 millilitres d’eau déminéralisée. Retirez délicatement la maille en nylon. Imagez le gel à l’aide d’un phosphorimageur avec les paramètres indiqués.

Préparez la sonde de télomères radioactifs en suivant les règlements de l’installation pour la manipulation de la radioactivité. Dans le tube de microcentrifugation, combinez les éléments suivants : deux microlitres de sonde de télomère ; 2,5 microlitres de tampon de réaction polynucléotide kinase 10x ; trois microlitres à l’ATP marqués sur le groupe gamma phosphate avec P32 ; quatre microlitres de polynucléotide kinase T4 ; et de l’eau déminéralisée, stérile et exempte de DNase jusqu’à un volume final de 20 microlitres. Centrifugez brièvement le tube.

Incuber le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant une heure. Centrifugez brièvement le tube et incubez à 65 degrés Celsius pendant 20 minutes pour arrêter la réaction. Chargez la solution de sonde radioactive dans une colonne de chromatographie G25 préparée et centrifugez pendant deux minutes à 700 fois g.

Conservez le filtrat, qui contient la sonde de télomères radioactifs. Placez le gel dans un plat en verre contenant 250 millilitres de solution dénaturante et incubez pendant 15 minutes à température ambiante. Retirez la solution dénaturante et remplacez-la par 250 millilitres d’eau stérile et déminéralisée.

Incuber pendant 10 minutes sur un agitateur orbital à température ambiante. Retirez l’eau déminéralisée. Remplacer par 250 millilitres de solution de neutralisation et incuber pendant 15 minutes à température ambiante.

Roulez le gel dans une maille de nylon et placez-le dans le tube d’hybridation. Ajoutez 20 millilitres de solution d’hybridation et incubez dans un four d’hybridation à 42 degrés Celsius pendant 10 minutes avec rotation. Après 10 minutes, retirez la solution d’hybridation et remplacez-la par 20 millilitres de solution d’hybridation fraîche.

Ajoutez l’intégralité de la sonde télomère et incubez dans un four d’hybridation à 42 degrés Celsius avec rotation pendant la nuit. Lorsque l’hybridation avec la sonde de télomère est terminée, retirez le gel et le maillage du tube d’hybridation et placez-les dans un plat en verre, contenant 250 millilitres de 2x SSC. Déroulez et retirez la maille en nylon du plat.

Placez le plat en verre sur un agitateur orbital et incubez pendant 15 minutes à température ambiante. Retirez les 2x SSC, remplacez-les par 250 millilitres de solution 0,1x SSC, plus 0,1 % SDS, et incubez pendant 15 minutes sur l’agitateur orbital à température ambiante. Retirez la solution SSC 0,1x plus 0,1 % SDS.

Remplacez par 250 millilitres de 2x SSC et incubez pendant encore 15 minutes sur l’agitateur orbital. Retirez le gel du SSC 2x et enveloppez-le dans une pellicule plastique. Retirez toutes les bulles et les poches d’air entre le gel et la pellicule plastique.

Placez le gel dans une cassette d’exposition avec un écran au phosphore et exposez le tamis au phosphore au gel pendant la nuit. Le lendemain, utilisez un imageur au phosphore pour imager l’écran au phosphore exposé. Les images au phosphore sont ensuite utilisées pour la quantification de la longueur des télomères, comme décrit dans le protocole textuel.

Trois concentrations d’ADN isolées d’une lignée cellulaire de fibroblastes du prépuce humain immortalisée et de cellules mononucléées du sang périphérique humain ont été analysées pour la longueur des télomères. Cette image au phosphore du gel d’agerose séché coloré avec une coloration verte fluorescente à l’acide nucléique montre l’emplacement des bandes de l’échelle d’ADN dans les couloirs un et huit. La distance mesurée entre le haut du gel et chaque étalon de poids moléculaire est indiquée par des flèches bleues.

Suite à l’hybridation avec une sonde de télomères, les bandes de télomères apparaissent sous forme de frottis dans chaque voie. Des grilles de 150 cases ont été calculées pour chaque voie plus une voie d’arrière-plan. Les zones d’analyse sélectionnées pour chaque ensemble d’échantillons sont indiquées.

Des couloirs d’arrière-plan distincts marqués B ont été sélectionnés pour chaque ensemble d’échantillons, afin de s’assurer que les indences d’arrière-plan étaient similaires pour chaque ensemble d’échantillons. Les calculs de la longueur moyenne des télomères ont révélé une longueur moyenne des télomères plus élevée dans la lignée cellulaire immortalisée que dans les cellules mononucléées du sang périphérique humain. Ces résultats démontrent également que la quantité d’ADN génomique analysée dans chaque voie est essentielle à l’obtention d’un signal détectable après hybridation.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 12 heures réparties sur 2 jours et demi, avec deux incubations d’une nuit si elle est correctement réalisée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser au moins trois microgrammes d’ADN pour chaque échantillon et de mesurer chaque échantillon en double. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du vieillissement pour explorer les mécanismes responsables du maintien de la longueur des télomères chez différentes espèces animales, y compris les humains.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer directement la longueur moyenne des télomères eux-mêmes. N’oubliez pas que travailler avec de la radioactivité peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de blouses de laboratoire et de gants doivent toujours être prises lors de cette procédure.