Détection semi-quantitative de l’activité de l’ARN polymérase ARN-dépendante de protéine de Transcriptase inverse de la télomérase humaine

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie de l’ARN, telles que quelle est la signification biologique de la RdRP ou de la TERT dans les cellules humaines ? Le principal avantage de cette technique est que ce test s’est imposé comme la première méthode sensible pour détecter l’activité humaine de RdRP exprimée dans les cellules. Commencez cette procédure par la préparation des cellules HeLa comme décrit dans le protocole texte.

Lavez les cellules une fois avec 10 millilitres de PBS. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 1 450 fois la gravité pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, et jetez le surnageant. Utilisez un millilitre de tampon de lyse A glacé pour 10 millions de cellules pour lyser les cellules par pipetage doux.

Sonicez l’échantillon dans un tube de 1,5 millilitre avec une amplification de sonicateur de 25 % pendant 10 secondes. Après la sonication, centrifugez l’échantillon à 20, 400 fois la gravité pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Récupérez le surnageant et transférez un millilitre de surnageant dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Pré-éliminez le lysat en ajoutant 40 microlitres de billes d’agarose protéique A prélavées pour un millilitre de lysat. Bien mélanger en retournant le tube plusieurs fois. Ensuite, faites pivoter l’échantillon pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

Centrifugez l’échantillon à 13 000 fois la gravité pendant une minute à quatre degrés Celsius et récupérez le surnageant. Ensuite, ajoutez 40 microlitres de billes d’agarose A-protéine prélavées et 10 microgrammes d’anticorps TERT anti-humain dans le lysat pré-autorisé. Mélangez bien en retournant le tube plusieurs fois et faites pivoter l’échantillon à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Après une centrifugation à 3, 300 fois la gravité pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius, retirez le surnageant. Ensuite, lavez les perles avec Wash Buffer One. Ajoutez un millilitre de Wash Buffer One aux perles et mélangez bien en inversant le tube.

Ensuite, faites pivoter l’échantillon pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Centrifugez l’échantillon à 3, 300 fois la gravité pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant et répétez cette étape trois fois de plus.

Après le lavage de la solution AGC comme décrit dans le protocole de texte, traiter les billes avec des nucléases micrococciques en les remettant en suspension dans 60 microlitres du mélange de réaction des nucléases micrococciques par pipetage doux. Ensuite, secouez doucement l’échantillon sur la plaque tournante d’un agitateur placé dans un incubateur de type Peltier pendant 15 minutes à 25 degrés Celsius. Après avoir centrifugé l’échantillon à 3, 300 fois la gravité pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius, retirez le surnageant.

Enfin, lavez les billes deux fois avec une solution AGC contenant trois millimolaires d’EGTA, et lavez les billes une fois avec le tampon de lavage deux comme décrit dans le protocole de texte. Préparez le mélange réactionnel RdRP dans un nouveau tube comme décrit dans le protocole de texte. Ajoutez six microlitres d’uridine triphosphate marqués sur le groupe alpha phosphate avec P dash 32 au mélange réactionnel, et mélangez bien par pipetage.

Ensuite, ajoutez un microlitre d’ARN matrice au mélange et mélangez bien. Remettez les billes en suspension avec 20 microlitres du mélange réactionnel RdRP obtenu. Ensuite, secouez doucement l’échantillon sur la plaque tournante d’un agitateur placé dans un incubateur de type Peltier pendant deux heures à 32 degrés Celsius.

Après l’incubation, ajoutez 5,4 microlitres de 20 milligrammes par millilitre de protéinase K et 45,4 microlitres de tampon 2X protéinase K au mélange réactionnel. Mélangez par pipetage et secouez l’échantillon dans un incubateur de type Peltier pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après avoir ajouté 109,2 microlitres d’eau exempte de RNase à l’échantillon, ajoutez 200 microlitres de phénol-chloroforme acide.

Bien mélanger par vortex avant de centrifuger l’échantillon à 21, 100 fois la gravité pendant cinq minutes à température ambiante. Transférez la phase aqueuse dans un nouveau tube. Répétez cette étape une fois.

Ensuite, ajoutez 20 microlitres d’acétate de sodium à trois molaires, pH 5,2, quatre microlitres de support de précipitation et 250 microlitres d’éthanol à la phase aqueuse. Agitez bien le tube pour mélanger. Centrifugez l’échantillon à 21, 100 fois la gravité pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, et jetez le surnageant.

Ensuite, lavez le granulé avec 300 microlitres d’éthanol froid à 70 % de volume par volume stocké à moins 20 degrés Celsius. Centrifugez l’échantillon à 21, 100 fois la gravité pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant et faites sécher la pastille à l’air.

Remettre le granulé en suspension dans 20 microlitres d’eau sans RNase. Préparez le mélange réactionnel de la RNase dans un nouveau tube comme décrit dans le protocole de texte. Ajouter 180 microlitres du mélange réactionnel RNase à l’échantillon.

Ensuite, incubez le tube pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Ajoutez 2,3 microlitres de 10 % de volume par volume SDS à l’échantillon et incubez pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez deux microlitres de 20 milligrammes par millilitre de protéinase K à l’échantillon et incubez pendant 15 minutes supplémentaires à 37 degrés Celsius.

Maintenant, ajoutez 205 microlitres de phénol-chloroforme acide à l’échantillon. Après avoir mélangé et centrifugé comme précédemment, transférez la phase aqueuse dans un nouveau tube. Ajoutez de l’acétate de sodium à trois molaires, un support de précipitation et de l’éthanol à la phase aqueuse, puis mélangez, centrifugez et lavez les granulés comme effectué précédemment.

Voici trois résultats représentatifs du dosage IP-RdRP dans des cellules HeLa traitées avec du nocodazole ou du DMSO pour des cellules non manipulées. Un ARN de 34 nucléotides synthétisé chimiquement a été utilisé comme matrice. Après une exposition nocturne, les produits RdRP peuvent être observés entre 20 et 30 nucléotides, en particulier dans les cellules HeLa en phase mitotique.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de détecter l’activité RdRP du TERT humain.