Observation et la quantification des télomères et des séquences répétitives utilisant Fluorescence
4 août 2016
Nous rapportons une procédure concise d’hybridation in situ en fluorescence (FISH) dans la gonade et les embryons de Caenorhabditis elegans pour observer et quantifier les séquences répétitives. Nous avons réussi à observer et à quantifier deux séquences répétitives différentes, les répétitions de télomères et le modèle d’allongement alternatif des télomères (TALT).
Le but général de cette technique d'hybridation in situ en fluorescence est d'analyser de manière concise le nombre et la longueur des télomères chez C. elegans. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la régénération tumorale, l'allongement alternatif des télomères et le vieillissement cellulaire. Le principal avantage de cette technique réside dans la concision des protocoles, permettant de visualiser et de quantifier les télomères en moins de 24 heures.
Prélevez les vers adultes gravides avec un peu de milieu liquide sans débris dans un tube de 15 millilitres. Lavez maintenant les vers trois fois selon la procédure suivante. Ajoutez du tampon M9 pour un volume total de 15 millilitres.
Ensuite, centrifuger le tube à 300 G pendant trois minutes, puis éliminer la solution située au-dessus du culot de vers. Répéter ensuite le processus. Si, après la centrifugation, les vers flottent, réduire l'intensité du frein de la centrifugeuse.
Après le troisième lavage, laissez les vers avec 5 millilitres de M9. Ajoutez ensuite 6,5 millilitres d'eau distillée, deux millilitres d'hypochlorite et un millilitre d'hydroxyde de potassium à cinq molaire. Incubez les vers dans cette solution de blanchiment pendant trois minutes sous agitation à 50 tr/min. Ensuite, vortexez les vers pour les rompre et libérer leurs œufs.
Sous un microscope stéréo, recherchez les œufs libérés. S'ils ne sont pas encore libérés, poursuivez l'incubation jusqu'à huit minutes. Si les vers sont en grande partie dissous et que les œufs sont libres, complétez le tube jusqu'à 15 millilitres avec du M9 et lavez les œufs trois fois, comme vous avez lavé les vers précédemment.
Aux œufs lavés, après avoir retiré la majeure partie du M9, compléter le volume à 500 microlitres avec du PBST, puis ajouter 500 microlitres de PFA à 4 %. Prélever ensuite des aliquotes de 40 microlitres d’œufs dans du PFA à 2 % et les déposer dans les puits de lames recouvertes de polylysine. Transférer ensuite les lames dans une chambre humide et les laisser incuber 15 minutes à température ambiante.
Pour ce protocole, préparez un bloc d'aluminium sur de la glace sèche conservé à -80 degrés Celsius. Prévoyez également du méthanol et de l'acétone conservés à -20 degrés Celsius. Une fois l'étape de fixation terminée, retirez la majeure partie de la solution de PFA des lames, en laissant environ cinq microlitres.
Placez ensuite une deuxième lame recouverte de polylysine au-dessus de chaque lame d'échantillon, de sorte que les deux surfaces recouvertes adhèrent ensemble, piégeant les tissus dans la cavité. Si un excès de fixateur est présent, absorbez-le avec un morceau de papier. Congelez maintenant les lames en les plaçant sur le bloc d'aluminium froid pendant au moins 15 minutes.
Entre-temps, préparez des bains de méthanol et d'acétone sur glace pour les lames. Une fois les lames congelées, faites pivoter l'une d'elles pour provoquer une rupture par congélation de l'échantillon. Jetez la lame supérieure et immergez la lame inférieure dans du méthanol glacé pendant cinq minutes.
Faites cela pour tous les échantillons. La rupture par congélation permet la pénétration des sondes et des anticorps à travers la coquille dure de l'œuf. Si les œufs ont été correctement rompus par congélation, vous pourrez voir les œufs sur les deux lames.
Après au moins cinq minutes dans du méthanol, transférez les lames dans de l'acétone froide pendant cinq minutes. Cinq minutes plus tard, faites tremper les échantillons dans du PBST trois fois pendant cinq minutes par bain. Après les lavages au PBST, les lames peuvent être conservées dans de l'éthanol à 100 % à quatre degrés Celsius pendant plusieurs jours.
Pour continuer, ajoutez 20 microlitres de solution d'ARNase dans les puits de l'échantillon et incubez-les dans une chambre humide à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, lavez les lames deux fois dans du SSCT 2x, 15 minutes par lavage. Après ces deux lavages, ajoutez 20 microlitres de solution d'hybridation aux échantillons et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant une heure dans une chambre humide.
Entre-temps, préparez la sonde pour une sonde d'ADN double brin. Dénaturez-la à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis refroidissez-la brièvement sur de la glace. Après une heure, aspirez la solution d'hybridation et ajoutez la solution de sonde.
À partir de cette étape, protégez l'échantillon de la lumière. Après avoir ajouté la sonde, recouvrez les échantillons avec des lamelles en verre. Préparez ensuite une chambre humidifiée sur un bloc chauffant à 80 degrés Celsius.
Lorsque le bloc chauffant est revenu à 80 degrés Celsius, placez les lames d'échantillons dans la chambre préchauffée et laissez-les dénaturer pendant trois minutes. Incubez ensuite toutes les lames traitées dans une chambre humide à 37 degrés Celsius pendant toute la nuit. Après l'incubation nocturne, lavez les échantillons dans du PBST à température ambiante pendant cinq minutes.
En préparation, porter la solution d'hybridation à 37 degrés Celsius une heure avant le lavage. Ensuite, charger les lames dans un bocal contenant la solution de lavage d'hybridation et les incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour éliminer la solution d'hybridation, laver les échantillons avec du PBST à température ambiante pendant 15 minutes.
Répétez cette opération trois fois. Après avoir aspiré le dernier lavage au PBST, ajoutez 20 microlitres de solution de blocage à chaque échantillon et incubez-les dans des chambres humidifiées à température ambiante pendant une heure à l’abri de la lumière. Ensuite, aspirez la solution de blocage et remplacez-la par une solution d’anticorps anti-digoxigénine conjugué à la FITC à une dilution de un à 200.
Couvrez les lames et incubez-les à température ambiante pendant trois heures à l'abri de la lumière. Après la coloration par anticorps, lavez les échantillons deux fois avec du PBST pendant 15 minutes par lavage, à l'abri de la lumière. Ensuite, aspirez le PBST et remplacez-le par 10 microlitres de solution de montage contenant du DAPI.
Appliquez un coverslip et absorbez toute solution excédentaire. Enfin, scellez les bords du coverslip avec du vernis à ongles et procédez à l'observation des échantillons au microscope à fluorescence. À l'aide de la sonde PNA, les télomères d'animaux survivant à une mutation suffisante au niveau des télomères ont été observés.
Dans les gonades, le nombre de télomères par noyau est quantifiable. Le signal des télomères est co-localisé avec un signal TALT1, ce qui soutient l'idée que TALT1 est responsable de la survie en l'absence de télomères. L'intensité du signal des télomères a été comparée à l'aide d'un logiciel.
Le signal était plus intense chez les survivants ALT que chez les souches parentales utilisées pour générer les mutants déficients en télomères. N'oubliez pas que le travail avec du paraformaldéhyde et de la formamide peut être extrêmement dangereux, et que des précautions, telles que le port de gants, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cet article présente une technique concise d'hybridation in situ en fluorescence (FISH) pour analyser la longueur et le nombre de télomères chez Caenorhabditis elegans. La méthode permet la visualisation et la quantification des répétitions télomériques et de l'allongement alternatif des télomères (TALT) en moins de 24 heures.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Génétique
Contexte
- Les télomères protègent les extrémités des chromosomes et jouent un rôle essentiel dans le vieillissement cellulaire.
- La compréhension de la dynamique des télomères est importante pour la recherche sur le cancer.
- L'hybridation in situ en fluorescence (FISH) est un outil puissant pour visualiser le matériel génétique.
- Caenorhabditis elegans sert d'organisme modèle pour les études génétiques.
Objectif de l'étude
- Développer une procédure FISH concise pour C. elegans.
- Quantifier la longueur et le nombre de télomères en un court laps de temps.
- Étudier le rôle des télomères dans la régénérescence tumorale et la sénescence cellulaire.
Méthodes utilisées
- Prélèvement de C. elegans adultes gravides en milieu liquide.
- Lavage des vers avec du tampon M9 en vue de la FISH.
- Application de la FISH pour visualiser les séquences télomériques.
- Quantification des répétitions télomériques et du TALT.
Résultats principaux
- Visualisation réussie des répétitions télomériques chez C. elegans.
- Quantification de deux séquences répétitives différentes réalisée.
- Mise en évidence de l'efficacité de la technique FISH en une courte durée.
- Fourni des informations sur la biologie des télomères pertinentes pour la recherche sur le cancer.
Conclusions
- La méthode FISH développée est efficace pour l'étude des télomères chez C. elegans.
- Cette technique peut faciliter la recherche sur les maladies liées aux télomères.
- Des études futures pourront approfondir les implications des dynamiques télomériques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode FISH permet une visualisation directe et une quantification de la dynamique des télomères dans un modèle multicellulaire, soutenant ainsi la validation de cibles en biologie des télomères et dans les voies de rallongement alternatif. En offrant une résolution au niveau de la cellule unique pour les séquences répétitives, elle améliore la fiabilité prédictive dans les études mécanistiques de la stabilité génomique et de la sénescence cellulaire. L'approche propose un test rapide, préservant la morphologie, adapté aux flux de travail de découverte précoce axés sur les cibles liées aux télomères.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse des mécanismes de maintenance des télomères, y compris l'activité de la voie ALT, afin de valider des hypothèses thérapeutiques.
- Valeur opérationnelle : Fournit des mesures quantitatives du nombre et de la longueur des télomères par noyau pour l'évaluation fonctionnelle de cibles.
- Valeur prédictive : Permet une évaluation alignée sur les biomarqueurs de l'instabilité génomique dans des systèmes pertinents pour la maladie.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des signaux FISH standardisés et reproductibles pour les séquences télomériques et TALT, permettant la préparation des tests.
- Valeur opérationnelle : Fournit des résultats d'imagerie quantitatifs compatibles avec les pipelines d'analyse à haut contenu.
- Extensibilité : Facilite la préparation de systèmes biologiques validés pour des criblages de composés en aval.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Établit un lien entre la visualisation des télomères et l'activité ALT, soutenant une dé-risquisation mécanistique dans les modèles précliniques.
- Continuité translationnelle : Permet de corréler les signaux télomériques avec la co-localisation de TALT1 pour la validation de voies.
- Avancement ajusté au risque : Soutient les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin, basées sur la dynamique des télomères dans des contextes pertinents pour la maladie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase de découverte précoce à la phase préclinique en fournissant une quantification des télomères qui éclaire la confiance accordée à la cible et la validation des voies avant l'optimisation du composé candidat.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses sur la régulation de la longueur des télomères et le mécanisme ALT chez C. elegans.
- criblage : Fournit des signaux télomériques quantitatifs et reproductibles pour la normalisation des tests et l'évaluation de composés.
- Analyse : Autorise la comparaison fondée sur l'intensité des signaux télomériques à l'aide de logiciels d'analyse d'images, offrant des résultats objectifs.
- Recherche translationnelle : Relie la dynamique des télomères à l'activité de la voie ALT par la co-localisation de TALT1, apportant une compréhension mécanistique.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une capacité FISH réutilisable pour l'analyse des télomères et des séquences répétitives dans divers projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive en biologie des télomères, validation des cibles et réduction de l'ambiguïté mécanistique dans les mécanismes ALT.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité de la quantification des télomères dans les échantillons fixés.
- Valeur stratégique : Amélioration des décisions d'orientation (go/no-go), efficacité du capital et réduction des risques biologiques en phase avancée dans les programmes ciblant les télomères.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation ajustée au risque fondée sur la validation du mécanisme de maintenance des télomères.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Expertise en microscopie de fluorescence, hybridation de sondes et préparation d'échantillons en montage entier de C. elegans.
- Nécessité de lames revêtues de polylysine, de chambres humidifiées et de systèmes d'incubation à température contrôlée.
- Manipulation de sondes PNA, traitement par RNase et étapes d'amplification du signal par anticorps.
- Considérations d'adaptation pour différents systèmes modèles ou types de tissus autres que les embryons et les gonades.
- Les limites pratiques incluent la manipulation de réactifs dangereux (paraformaldéhyde, formamide) et la nécessité de protéger les échantillons de la lumière pendant l'hybridation.
