Observation et la quantification des télomères et des séquences répétitives utilisant Fluorescence In Situ Hybridation (FISH) avec PNA Sondes en Caenorhabditis elegans

L’objectif global de cette technique d’hybridation in situ en fluorescence est d’analyser de manière concise le nombre et la longueur des télomères chez C. Elegans. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la régénération tumorale, l’allongement alternatif des télomères et la sénescence cellulaire. Le principal avantage de cette technique est que les procédures sont concises et que les télomères peuvent être visualisés et quantifiés en moins de 24 heures.

Collectez les vers adultes gravides avec un peu de milieu liquide sans débris dans un tube de 15 millilitres. Maintenant, lavez les vers trois fois comme suit. Ajouter un tampon M9 pour un volume total de 15 millilitres.

Ensuite, faites tourner le tube à 300 G pendant trois minutes et jetez la solution au-dessus de la pastille de vers. Répétez ensuite le processus. Si, après la centrifugation, les vis sans fin flottent, allégez le frein de la centrifugeuse.

Après le troisième lavage, laissez les vers avec 5 millilitres de M9. Ajoutez ensuite 6,5 millilitres d’eau distillée, deux millilitres d’hyperchlorite et un millilitre de hydroxyde de potassium à cinq molaires. Laissez les vers incuber dans cette solution de blanchiment pendant trois minutes avec 50 tr/min d’agitation. Ensuite, faites vortex les vers pour les ouvrir et libérer leurs œufs.

À l’aide d’un microscope de dissection, recherchez les ovules libérés. S’ils ne sont pas encore relâchés, continuez l’incubation ou jusqu’à huit minutes. Si les vers sont presque dissous et que les œufs sont libres, remplissez le tube à 15 millilitres de M9 et lavez les œufs trois fois comme les vers ont été lavés auparavant.

Pour les œufs lavés, avec la majeure partie du M9 retiré, remplissez le volume à 500 microlitres avec du PBST, puis ajoutez 500 microlitres de 4 % de PFA. Chargez maintenant 40 aliquotes d’œufs d’un microlitre dans du PFA à 2 % dans les puits de lames revêtues de polylysine. Transférez ensuite les lames dans une chambre humidifiée et laissez-les incuber pendant 15 minutes à température ambiante.

Pour ce protocole, faites stocker un bloc d’aluminium sur de la glace sèche à 80 degrés Celsius. De plus, conservez le méthanol et l’acétone à 20 degrés Celsius. Une fois l’étape de fixation terminée, retirez la majeure partie de la solution PFA des lames, laissant environ cinq microlitres.

Placez ensuite les deuxièmes lames recouvertes de polylysine sur chaque lame d’échantillon de manière à ce que les deux surfaces revêtues se collent ensemble, emprisonnant les tissus dans le puits. S’il y a un excès de fixateur, épongez-le avec un mouchoir en papier. Congelez maintenant les diapositives en les plaçant sur le bloc d’aluminium froid pendant au moins 15 minutes.

Pendant ce temps, préparez des bains de méthanol et d’acétone sur de la glace pour les lames. Une fois les lames congelées, tournez-en une pour congeler et fissurer l’échantillon. Jetez la glissière supérieure et trempez la glissière inférieure dans du méthanol glacé pendant cinq minutes.

Faites-le pour tous les échantillons. Le fissurage par congélation permet la pénétration des sondes et des anticorps à travers la coquille dure de l’œuf. Si les ovules sont congelés et fissurés avec succès, vous pouvez voir les ovules sur les deux lames.

Après au moins cinq minutes de méthanol, placez les lames dans de l’acétone froide pendant cinq minutes. Dans les cinq minutes suivantes, trempez les échantillons dans du PBST trois fois pendant cinq minutes par bain. Après le lavage du PBST, les lames peuvent être stockées dans de l’éthanol à 100 % à quatre degrés Celsius pendant plusieurs jours.

Pour continuer, ajoutez 20 microlitres de solution de RNase dans les puits d’échantillonnage et incubez-les dans une chambre humidifiée à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, lavez les lames en 2x SSCT deux fois pendant 15 minutes par lavage. Après les deux lavages, ajoutez 20 microlitres de solution d’hybridation aux échantillons et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant une heure dans une chambre humidifiée.

Pendant ce temps, préparez la sonde pour une sonde d’ADN double brin. Dénaturez-le à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis refroidissez-le brièvement sur de la glace. Au bout d’une heure, aspirez la solution d’hybridation et ajoutez la solution de sonde.

À partir de ce pas, protégez l’échantillon de la lumière. Après avoir ajouté la sonde, couvrez les échantillons avec des lamelles de verre. Ensuite, faites une chambre humidifiée sur un bloc de chaleur à 80 degrés Celsius.

Lorsque le bloc chauffant s’est stabilisé à 80 degrés Celsius, placez les lames d’échantillon dans la chambre chauffée et laissez-les se dénaturer pendant trois minutes. Ensuite, incubez toutes les lames traitées dans une chambre humidifiée à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après l’incubation d’une nuit, laver les échantillons dans du PBST à température ambiante pendant cinq minutes.

En préparation, réchauffez la solution d’hybridation à 37 degrés Celsius une heure avant le lavage. Ensuite, chargez les lames dans un bocal de solution de lavage d’hybridation et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour éliminer la solution d’hybridation, laver les échantillons avec du PBST à température ambiante pendant 15 minutes.

Faites-le trois fois. Après avoir aspiré le dernier lavage PBST, ajoutez 20 microlitres de solution bloquante à chaque échantillon et incubez-les dans des chambres humidifiées à température ambiante pendant une heure dans l’obscurité. Ensuite, aspirez la solution bloquante et remplacez-la par une solution d’anticorps anti-digoxigénine conjuguée FITC à raison de un à 200.

Couvrez les lames et incubez-les à température ambiante pendant trois heures dans l’obscurité. Après la coloration des anticorps, lavez les échantillons deux fois avec du PBST pendant 15 minutes par lavage dans l’obscurité. Ensuite, aspirez le PBST et remplacez-le par 10 microlitres de solution de montage contenant du DAPI.

Appliquez un verre de protection et épongez tout excès de solution. Enfin, scellez les bords du verre de protection avec du vernis à ongles et procédez à l’observation des échantillons au microscope fluorescent. À l’aide de la sonde PNA, les télomères d’animaux survivant à une mutation suffisante aux télomères ont été observés.

Dans les gonades, le nombre de télomères par noyau est quantifiable. Le signal des télomères est co-localisé avec un signal TALT1, ce qui soutient l’idée que TALT1 est responsable de la survie sans télomères. L’intensité du signal télomère a été comparée à l’aide d’un logiciel.

Le signal était plus fort chez les survivants de l’ALT que chez les souches parentales utilisées pour générer les mutants déficients en télomères. N’oubliez pas que travailler avec du paraformaldéhyde et du formamide peut être extrêmement dangereux, et que des précautions, telles que le port de gants, doivent toujours être prises lors de cette procédure.