Name: Observation et la quantification des télomères et des séquences répétitives utilisant Fluorescence In Situ Hybridation (FISH) avec PNA Sondes en Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Découvrez une technique FISH concise pour visualiser et quantifier les télomères chez Caenorhabditis elegans en moins de 24 heures. Cette méthode permet d'étudier le raccourcissement des télomères et la sénescence cellulaire.

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souches de vers mutants ont été aimablement fournies par le Centre de Génétique de Caenorhabditis. Cette recherche a été financée par une subvention du projet coréen de R-D sur les technologies de la santé par l’intermédiaire de l’Institut coréen de développement de l’industrie de la santé (KHIDI), financé par le ministère de la Santé et du Bien-être social de la République de Corée (numéro de subvention : HI14C1277).

1. Sondes d&#39;étiquetage avec digoxigénine-dUTP par PCR <ol><li> Effectuer l&#39; étiquetage PCR 10x dNTP mix contenant digoxigénine-dUTP comme décrit précédemment 13. </li><li> Purifier produit PCR avec purification spin-colonne selon les instructions du fabricant. <ol><li> Si la sonde est inférieure à 200 pb, retirer gratuitement digoxigénine-dUTP par chromatographie spin-colonne à partir du mélange de réaction plutôt que la purification spin-colonne. </li></ol></li></ol> 2. Préparation des diapositives polylysine Coated Remarque: La procédure complète prend environ 2 heures. La plupart des étapes sont effectuées à température ambiante, à l&#39;exception de l&#39;étape de séchage. <ol><li> Nettoyage des diapositives <ol><li> Placer les lames dans un récipient en plastique et rincer brièvement les lames avec de l&#39;eau distillée (DW). Retirer l&#39;eau et remplir le récipient avec DW contenant 1% de nettoyant pour vitres. </li><li> Agiter les lames pendant 15 minutes à 50 tours par minute à température ambiante (TA). Laver les lames avec DW 3fois pendant 5 min chacune à la température ambiante. </li><li> Laver les lames avec 70% d&#39;éthanol pendant 15 minutes avec agitation. Jeter 70% d&#39;éthanol et de placer les diapositives sur un bloc sec à 65 ° C et l&#39;air libre pendant 15 min. </li></ol></li><li> Polylysine revêtement de lames de verre multi-puits Remarque: revêtement polylysine de lame de verre est une étape importante, car elle fournit l&#39;échantillon d&#39;adhérence tout au long de la procédure de coloration. Médiocrement lame enduite entraîne la perte de l&#39;échantillon. <ol><li> Diluer la solution polylysine stock à 0,01% (p / v) dans de l&#39;eau distillée. Ajouter 20 pi de la dilution à 0,01% (p / v) de polylysine dans les puits d&#39;une lame de verre propre. </li><li> Incuber la lame de verre pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Placer les lames sur un C bloc sec 65 ° et l&#39;air sec pendant 1 heure. </li><li> Stocker les diapositives de polylysine dans la boîte sans poussière. </li></ol></li></ol> 3. Fixation de Worms sur la lame de verre (Figure 1) <ol><li> embryons Préparation pour FISH Note: les vers de récolte avant tout til la nourriture bactérienne est consommée en regardant les milieux de croissance au microscope. Starvation réduit la production d&#39;œufs de vers adultes et augmente l&#39;éclosion des œufs. Des procédés détaillés sont décrits dans 14,15. <ol><li> Cultivez les vers dans 50 mm boîte de Pétri selon des méthodes standard 14. </li><li> Après tout la nourriture bactérienne est consommée, couper le support agar dans le quartier avec une spatule. Stériliser la spatule avant de couper pour éviter la contamination. </li><li> Mettez tout le morceau de gélose sur le 100 mm du milieu de croissance des nématodes (NGM) plaque. Tourner la pièce de gélose à l&#39;envers pour les vers pour atteindre la nourriture fraîche bactérienne. </li><li> Après 48-72 heures, de recueillir les vers avec le tampon M9. Ajouter 3 - 5 ml de tampon M9 sur la plaque NGM. tampon M9 pipette sur la surface du NGM pour laver les vers. </li><li> Recueillir le liquide avec des vers et ajouter à un tube de 15 ml. Remarque: S&#39;il y a des débris de gélose après récolte, centrifuger les vers dans une solution de saccharose à 30%. Alors que les débris sont culottées, les vers flottent surla surface. </li><li> Ajouter un tampon M9 pour compenser le volume à 15 ml. Pellet les vers par centrifugation à 300 xg pendant 3 min et éliminer la majeure partie du tampon M9. Répétez cette étape 2 fois plus. Remarque: Si les vers sont toujours flottantes après centrifugation, régler le niveau de la centrifugeuse de frein à la valeur = 1. </li><li> tampon Aspirer M9. Ajouter une solution de blanchiment pour les vers. Par 0,5 ml de vers, ajouter 6,5 ml de DW, 2 ml d&#39;hypochlorite, de 1 ml de 5 M KOH. </li><li> Incuber les vers à bascule à température ambiante pendant 3 min à 50 rpm. vers Vortex pendant 15 secondes au cisaillement mécanique des vers et exposer les oeufs. </li><li> Observer le tube sous un microscope de dissection pendant le blanchiment. Assurez-vous que les vers sont coupées en deux et les œufs sont libérés. Lorsque la plus grande partie du corps adulte est dissous, ajouter un tampon M9 pour compenser le volume à 15 ml. </li><li> Centrifuger à 300 xg pendant 3 min. Aspirer la plupart des M9 et ajouter un tampon M9 frais pour compenser le volume à 15 ml. Répétez l&#39;étape de lavage 3 fois. Remarque:Évitez d&#39;utiliser trop de vers, car elles entravent le processus de blanchiment. Maintenir le temps de réaction global inférieur à 8 min jusqu&#39;à ce que le cycle de lavage. Plus-blanchies oeufs produisent une forte autofluorescence. </li><li> Ajouter un tampon phosphate salin avec polysorbate-20 (PBST) jusqu&#39;à 200 pi et 200 pi de paraformaldehyde à 4% (PFA) pour faire 2% PFA. Attention: Comme PFA est cancérigène, porter des vêtements de protection, des gants et protection oculaire avant d&#39;utiliser PFA. </li><li> Ajouter 40 pi des oeufs dans 2% PFA sur le puits de polylysine enduit diapositive. </li><li> Placer les lames dans une chambre humide et incuber pendant 15 min à température ambiante. Fermez la chambre humide juste après les lames sont placées à l&#39;intérieur. Nota: Les oeufs se déposent au fond de la glissière tout en étant fixe. </li></ol></li><li> Préparation de gonades disséquées pour FISH <ol><li> vers récolte adultes cultivés sur 50 mm plaque NGM par pipetage 1 ml de tampon M9. vers récolte avant la nourriture bactérienne est épuisée. </li><li> Laver les vers de toute bactérie with tampon M9, 2 fois. Note: les bactéries résiduelles peuvent interférer avec les gonades disséquées de coller sur des lames de polylysine enduit. </li><li> Pellet les vers par centrifugation à 300 x g. Retirer M9 et transférer les vers à la plaque NGM vide par micropipette. </li><li> Ajouter 30 pi de tampon M9 contenant mM lévamisole 2 sur un puits de polylysine traitée diapositive. </li><li> Ajouter 500 pi de tampon M9 à un tube de 1 ml. Utilisez ce tampon pour transférer les vers par la bouche pipette. </li><li> Remplissez la pointe de la pipette à la bouche avec un tampon M9 en plaçant un capillaire dans le tube 1 ml contenant le tampon M9. </li><li> Sous microscope disséquant, mettre la pointe de la bouche pipette juste en face de la tête du ver adulte et faites glisser la bouche pipette de sorte que la tête de vers entre dans la bouche pipette. Une fois la tête de vers entre la pointe, le corps entier du ver sera aspiré dans la pointe. </li><li> Transférer les vers à la diapositive polylysine enduit en utilisant la bouche pipette. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un rasoir, coupe def la tête ou l&#39;extrémité de la queue des vers sur la diapositive. Lorsque le ver est coupé, les gonades vont sortir. Gonads colleront aux diapositives. <ol><li> Préparer au moins 30 vers dans un puits. Plus de puits peuvent être utilisés pour un autre 30 vers. </li></ol></li><li> Mettez la lame dans la chambre humide et Aspirer le tampon M9 avec la bouche pipette. </li><li> Fixer l&#39;échantillon en ajoutant 20 ul de 2% de PFA à température ambiante pendant 15 minutes dans une chambre humide. </li></ol></li></ol> 4. Fixation et perméabilisation <ol><li> Placez un bloc d&#39;aluminium sur glace sèche et le stocker dans un congélateur (-80 ° C). méthanol de magasin et de l&#39;acétone à -20 ° C. </li><li> Après PFA fixation étape 3.1.15 ou 3.2.11, supprimer fixateur en utilisant micropipette laissant ~ 5 pi du fixateur. </li><li> Mettez une autre diapositive polylysine enduit sur la lame de l&#39;échantillon. Retirer le fixateur avec une serviette en papier, si la solution est excessive. Ne déplacez pas les diapositives une fois qu&#39;ils sont coincés ensemble. </li><li> Congeler les diapositivessur le bloc d&#39;aluminium pendant au moins 15 min. Remarque: Les échantillons peuvent être conservés pendant au moins 2 - 3 jours. </li><li> Alors que les diapositives sont gelés, mettre les pots contenant du méthanol froid et de l&#39;acétone sur la glace. </li><li> Prenez les diapositives sur et les tordre pour geler-casser l&#39;échantillon. Jeter la lame supérieure. tremper immédiatement la lame dans le méthanol glacé pendant 5 min. </li><li> Transférer les lames à l&#39;acétone glacée pendant 5 min. </li><li> Laver les lames 3 fois avec PBST pendant 5 min pour éliminer le fixateur résiduel. Passez à l&#39;étape suivante ou stocker les diapositives dans 100% d&#39;éthanol à 4 ° C. Remarque: Les échantillons peuvent être conservés pendant au moins 2 - 3 jours. </li></ol> 5. Hybridation de cellules fixes <ol><li> Ajouter 20 ul d&#39;une solution de RNase (PBST contenant 10 pg / ml de RNase A). Incuber la lame dans la chambre humide à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Laver la lame à deux reprises dans une solution saline et 2x citrate de sodium, du polysorbate 20 (2x SSCT) pendant 15 min à chaque fois. </li><li> Ajouter 20pi de solution d&#39;hybridation et de mettre la chambre humide à 37 ° C incubateur. Après 1 heure, retirer la solution d&#39;hybridation par pipetage. </li><li> Avant de retirer la solution d&#39;hybridation, de préparer la sonde. Si la sonde est double brin d&#39;ADN, dénaturer les sondes par chauffage à 95 ° C pendant 5 minutes sur un bloc sec. Après chauffage, refroidir la sonde brièvement de la glace. </li><li> Ajouter 10 pi de solution d&#39;hybridation contenant les sondes à l&#39;échantillon. Pour la sonde de type PNA, la concentration d&#39;utilisation à un rapport de 1: 2000 et pour la sonde marquée à la DIG, la concentration d&#39;utilisation à un rapport de 1: 200. Couvrir l&#39;échantillon avec couvercle en verre. </li><li> Mettez une serviette en papier imbibé d&#39;eau sur le bloc thermique (80 ° C). Mettez un couvercle de boîte en plastique sur le bloc thermique pour conserver l&#39;humidité et de la température. </li><li> Après que la température du bloc thermique est stabilisée (à 80 ° C), placer la lame d&#39;échantillon sur la serviette en papier chauffé et couvrir les échantillons avec le couvercle de la boîte en plastique. Dénaturer l&#39;échantillon pendant 3 min. </li><li> IncUbate les lames dans une chambre humide pendant une nuit à 37 ° C. </li></ol> 6. Washes et immunofluorescence <ol><li> Réchauffer la solution de lavage d&#39;hybridation (2x SSC, formamide à 50%) à 37 ° C. </li><li> Laver l&#39;échantillon dans le PBST deux fois à température ambiante pendant 5 min. Retirez le couvercle en verre. </li><li> Laver l&#39;échantillon dans une solution de lavage d&#39;hybridation à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Laver la lame de l&#39;échantillon dans PBST 3 fois à la température ambiante. Remarque: Effectuez toutes les étapes ultérieures de chambre humide à température ambiante. </li><li> Ajouter 20 ul de solution de blocage et incuber pendant 1 heure à température ambiante dans une chambre humide. </li><li> Retirer la solution de blocage et ajouter FITC solution d&#39;anticorps anti-digoxigénine conjugué (1: 200) pendant 3 heures à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C. </li></ol> 7. Montage et Observation <ol><li> Laver la lame d&#39;échantillon avec PBST 2 fois pendant 15 min chacune. </li><li> Ajouter 10 pi de solution de montage avec DAPI. Mettez le couvercle en verre et appuyez doucement. Retirez tout excès de solutionavec une serviette en papier. </li><li> Pour éviter l&#39;évaporation de la solution de montage, sceller les bords du verre de couverture avec le vernis à ongles. </li><li> Observer au microscope confocal. Exclure les embryons avec un bruit de fond. Focus sur un champ avec 4 - 20 noyaux. </li><li> Prendre des images selon les instructions du fabricant avec 100X objectif. Note: Excite échantillon avec 405 laser nm pour DAPI, avec 555 laser nm pour cy3, avec 488 laser nm pour FITC. </li></ol> 8. Quantification des télomères Signal Note: Quantification a été effectuée comme décrit précédemment 16. Toutes les images qui sont à comparer doivent être prises avec même réglage, y compris le temps d&#39;exposition et la source lumineuse. <ol><li> Exporter l&#39;image au format .tif. </li><li> Téléchargez et installez le logiciel d&#39;analyse d&#39;image. </li><li> Exécuter le logiciel d&#39;analyse d&#39;image et cliquer sur le bouton d&#39;accord. </li><li> Cliquez sur le bouton ouvert. Ouvrez les images avec télomères FISH en double-cliquant sur le fichier image. </li><li> Cliquez[Modifier] - [région de traitement select], sélectionnez région d&#39;intérêt par un clic gauche et en faisant glisser. Exclure la coloration non spécifique. </li><li> Cliquez sur [mesure] - [repérer les densités optiques], sélectionnez le canal avec le signal de télomères et entrez le nom de fichier pour enregistrer les résultats dans un fichier .txt. Remarque: La colonne des résultats sont dans l&#39;ordre suivant: Fluorescence de la tache, l&#39;intensité de la tache et de la zone de la tache de fond. </li><li> Copiez les valeurs et soustraire l&#39;intensité de la tache de fond de fluorescence de la tache. Les valeurs peuvent maintenant être analysées statistiquement. </li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le principal avantage de notre protocole est la simplicité de la procédure sans dommage sensible à la morphologie de la structure cellulaire. Plusieurs étapes ont été optimisés pour C. elegans FISH dans ce protocole. Les étapes essentielles pour FISH succès comprennent l&#39;étiquetage des sondes, la fixation des embryons et la pénétration. méthode de marquage digoxigénine-dUTP fournit une méthode d&#39;étiquetage facile à utiliser par PCR ou pseudo-traduction. Pour marquer la séquence cible à long, nick-transl...

Télomères protège les extrémités chromosomiques de fusion aberrante et la dégradation. télomères mammalien se compose de séquences répétées riches en G hexamérique, TTAGGG et les complexes shelterin. La séquence répétée télomérique du nématode est similaire à ceux des mammifères (TTAGGC). La plupart des eucaryotes utilisent télomérase pour ajouter des répétitions télomériques à leurs extrémités chromosomiques. Cependant, 10 - 15% des cellules cancéreuses utilisent télomérase mécanisme indépendant, connu sous le nom alternatif Allongement de télomères (ALT) 3. Auparavant, nous avons signalé que les répétitions des télomères et ses séquences associées, nommées comme TALT, ont été amplifiés dans les télomères des lignées mutantes télomérase qui ont survécu à la stérilité critique 2. La longueur des télomères a été mesurée par PCR quantitative ou par transfert de Southern, qui fournit la longueur moyenne des télomères totaux 4,5,6,7. Lire le nombre de répétition des télomères dans les données ensemble de séquençage du génome est également un indicateur de contenu total des télomères 8. Bien que Single télomères Longueur Analyse (STELA) pourrait fournir la longueur d&#39;un seul télomères, il ne peut pas fournir l&#39; information spatiale des télomères 9. Alors que POT-1 :: mCherry protéine rapporteur fournit l&#39;information spatiale des télomères in vivo, il ne peut pas représenter la longueur de télomères double brin, comme POT-1 est une protéine 10 de liaison d&#39; un seul brin télomère. Bien que les méthodes mentionnées ci - dessus fournissent les informations moyenne de séquences répétitives, la fluorescence dans l&#39; hybridation in situ (FISH) permet d&#39;observer la quantité et la répartition spatiale des séquences individuelles d&#39;intérêt sur ​​une échelle chromosomique. Au lieu de la purification de l&#39;ADN, les tissus ou les cellules sont fixées pour préserver les informations spatiales natif dans le poisson. Ainsi, FISH est un outil à la fois quantitative et qualitative pour l&#39;observation de séquences répétées individuelles, telles que les répétitions des télomères. Ce protocole fournit un procédé efficace pour la détection simultanée des deux télosimples et d&#39; autres répétitions basées sur des améliorations de méthodes 11,12 décrites précédemment. C. elegans larves ou adultes sont organisme multicellulaire avec des cellules hautement différenciées. L&#39;hétérogénéité des cellules empêche l&#39;analyse quantitative d&#39;un grand nombre de taches de télomères. Afin de maximiser le nombre de cellules analysées, les embryons sont isolés et se propager sur les lames de polylysine revêtues pour FISH. Par ailleurs, ce protocole peut aussi être combiné avec immunofluorescence. Comme preuve que le protocole fonctionne, nous montrons qu&#39;il est possible d&#39;observer et de quantifier deux séquences répétitives différentes. sonde d&#39;ADN contre TALT1 a été généré par PCR simple contenant digoxigénine-dUTP. Ensuite, cette sonde TALT1 et télomères sonde PNA marqué par fluorescence ont été hybridées simultanément. Par la suite, la digoxigénine a été détectée par des méthodes d&#39;immunofluorescence canoniques. Nous présentons ici les images représentatives où TALT1 colocalisés avec le télomère dans trt-1 </em&gt; survivants.

<table><tbody><tr><td>Sonde PNA</td><td>PANAGENE</td><td>commande</td><td></td>personnalisée</tr><tr><td>Anti-Digoxigénine-Fluorescéine, Fragments Fab</td><td>Roche</td><td>11207741910</td><td>utilisation 1:200 diluée dans</td></tr><tr><td>PBST Digoxigénine-dUTP</td><td>Roche</td><td>11573152910</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-6148</td><td>préparer 4 % de paraformaldéhyde en chauffant dans DW avec quelques gouttes de NaOH. ajouter 0,1 volume de 10x PBS.</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hybridation</td><td></td><td></td><td>3x SSC, 50 % de formamide, 10 % (p/v) de sulfate de dextran, 50 &#956 ; g/ml d’héparine, 100 &#956 ; g/ml d’ARNt de levure, 100 &#956 ; g/ml spermatozoïde de saumon soniqué ADN</td></tr><tr><td>Hybridation solution</td><td></td><td></td> de lavage <td>2x SSC, 50 % formamide</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>BIONEER</td><td>C-9012</td><td></td></tr><tr><td>toxique Méthanol</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H3393</td><td>faire 10 mg/ml pour solution mère</td></tr><tr><td>Sulfate de dextran</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>67578</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td></td><td></td><td>Pour 1 L DW : 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 27 g Na2HPO4&#8226 ; 7H2O, 2,4 g KH2PO</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0,1 % tween-20</td></tr><tr><td>Polysorbate 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-2287</td> Le <td>nom commercial est Tween-20</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine solution (0,1 % p/v)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-8920</td><td>préparer une solution fraîche à 0,01 % p/v avant utilisation</td></tr><tr><td>M9</td><td></td><td></td><td>3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M de MgSO4, H2O à 1 L</td></tr><tr>d’hypochlorite<td>de</td><td></td><td></td><td>sodium à 20 %, 0,5 M KOH</td></tr><tr>Tampon <td></td><td></td><td>d’anticorps</td><td>1x PBST, 1 mM EDTA, 0,1 % BSA, 0,05 % Azoture de sodium (toxique)</td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td> bloquante <td>Tampon d’anticorps avec 5 % d’albumine sérique bovine (BSA)</td></tr><tr><td>illustra Microspin G-50</td><td>GE healthcare</td><td>27-53310-01</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td></td><td></td><td>Pour faire 1 L, 175,3 g de NaCl, 88,2 g de citrate de sodium, H2O à 1 L, ajuster le pH à 7,0</td></tr><tr><td>2x SSCT</td><td></td><td></td><td>2x SSC, 0,1 % tween-20</td></tr><tr><td>10x digoxigénine-dUTP mix</td><td></td><td></td><td>1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0,65 mM dTTP, 0,35 mM DIG-11-dUTP</td></tr><tr><td>Colonnes de purification PCR</td><td>Cosmo genetech</td><td>CMR0112</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyant pour vitres / ULTRA CLEAN</td><td>Dukssan pure chemicals</td><td>8AV721</td><td></td></tr><tr><td>Lame de verre multi-puits</td><td>MP biomedicals</td><td></td><td></td>96041205</tr><tr><td>Milieu</td><td></td><td></td> de croissance des nématodes <td>Pour faire 1 L, 3 g de NaCl, 17 g de gélose, 2,5 g de peptone, H2O à 974 ml. Autoclavez et refroidissez le flacon. Ajouter 1 ml de 1 M de CaCl2, 1 ml de cholestérol 4 mg/ml dans de l’éthanol, 1 ml de 1 M de MgSO4, 25 ml de 1 M de KPO4.</td></tr><tr><td>Lévamisole</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>196142</td><td></td></tr><tr>Lame en <td>plume</td> de<td>rasoir</td><td>n° 11</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Enzynomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Microsope confocale</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>EC Plan-Neofluar 100X a été utilisé comme lentille d’objectif.</td></tr><tr><td>Boîte</td><td></td><td></td><td>en plastique remplie d’essuie-tout imbibé du</td></tr><tr><td>logiciel d’analyse d’images</td> DW<td>Dr. Peter Landsdorp</td><td>TFL-telo</td><td><a href="http://www.flintbox.com/public/project/502">http://www.flintbox.com/public/project/502</a></td></tr></tbody></table>

observation et la quantification des télomères et des séquences répétitives utilisant fluorescence<em&gt; in situ</em&gt; hybridation (fish) avec pna sondes en<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

télomère est une structure ribonucléoprotéique qui protège les extrémités chromosomiques de la fusion et de la dégradation aberrantes. La longueur des télomères est maintenue par la télomérase ou une voie alternative, connue sous le nom d’allongement alternatif des télomères (ALT)1. Récemment, C. elegans a émergé en tant qu’organisme modèle multicellulaire pour l’étude des télomères et de l’ALT2. La visualisation de séquences répétitives dans le génome est essentielle pour comprendre la biologie des télomères. Bien que la longueur des télomères puisse être mesurée par test de restriction des fragments de télomères ou par PCR quantitative, ces méthodes ne fournissent que la longueur moyenne des télomères. Au contraire, l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) peut fournir des informations sur les télomères individuels dans les cellules. Ici, nous fournissons des protocoles et des résultats représentatifs de la méthode pour déterminer la longueur des télomères de C. elegans par hybridation fluorescente in situ. Cette méthode fournit une procédure in situ simple, mais puissante, qui ne cause pas de dommages notables à la morphologie. En utilisant des sondes marquées par fluorescence en acide nucléique peptidique (PNA) et en digoxigénine-dUTP, nous avons pu visualiser deux séquences répétitives différentes : les répétitions de télomères et la matrice d’ALT (TALT) dans les embryons et les gonades de C. elegans.

Il a été précédemment rapporté que survivant ALT peut émerger de mutant télomérase déficient, trt-1 (ok410), en basse fréquence en répliquant localisée en interne &quot;Modèle d&#39;ALT &#39;(TALT) séquences pour télomères entretien 2. En utilisant la sonde PNA, nous avons été en mesure de visualiser les télomères dans les gonades disséquées (figure 2A). Le signal de télomères faible a été détectée à la fois dans trt-1 (ok410) et survivant de...

Nous rapportons une procédure concise d’hybridation in situ en fluorescence (FISH) dans la gonade et les embryons de Caenorhabditis elegans pour observer et quantifier les séquences répétitives. Nous avons réussi à observer et à quantifier deux séquences répétitives différentes, les répétitions de télomères et le modèle d’allongement alternatif des télomères (TALT).

Observation et la quantification des télomères et des séquences répétitives utilisant Fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation (FISH) avec PNA Sondes en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Le but général de cette technique d'hybridation in situ en fluorescence est d'analyser de manière concise le nombre et la longueur des télomères chez C. elegans. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la régénération tumorale, l'allongement alternatif des télomères et le vieillissement cellulaire. Le principal avantage de cette technique réside dans la concision des protocoles, permettant de visualiser et de quantifier les télomères en moins de 24 heures.Prélevez les vers adultes gravides avec un peu de milieu liquide sans débris dans un tube de 15 millilitres. Lavez maintenant les vers trois fois selon la procédure suivante. Ajoutez du tampon M9 pour un volume total de 15 millilitres.Ensuite, centrifuger le tube à 300 G pendant trois minutes, puis éliminer la solution située au-dessus du culot de vers. Répéter ensuite le processus. Si, après la centrifugation, les vers flottent, réduire l'intensité du frein de la centrifugeuse.Après le troisième lavage, laissez les vers avec 5 millilitres de M9. Ajoutez ensuite 6,5 millilitres d'eau distillée, deux millilitres d'hypochlorite et un millilitre d'hydroxyde de potassium à cinq molaire. Incubez les vers dans cette solution de blanchiment pendant trois minutes sous agitation à 50 tr/min. Ensuite, vortexez les vers pour les rompre et libérer leurs œufs.Sous un microscope stéréo, recherchez les œufs libérés. S'ils ne sont pas encore libérés, poursuivez l'incubation jusqu'à huit minutes. Si les vers sont en grande partie dissous et que les œufs sont libres, complétez le tube jusqu'à 15 millilitres avec du M9 et lavez les œufs trois fois, comme vous avez lavé les vers précédemment.Aux œufs lavés, après avoir retiré la majeure partie du M9, compléter le volume à 500 microlitres avec du PBST, puis ajouter 500 microlitres de PFA à 4 %. Prélever ensuite des aliquotes de 40 microlitres d’œufs dans du PFA à 2 % et les déposer dans les puits de lames recouvertes de polylysine. Transférer ensuite les lames dans une chambre humide et les laisser incuber 15 minutes à température ambiante.Pour ce protocole, préparez un bloc d'aluminium sur de la glace sèche conservé à -80 degrés Celsius. Prévoyez également du méthanol et de l'acétone conservés à -20 degrés Celsius. Une fois l'étape de fixation terminée, retirez la majeure partie de la solution de PFA des lames, en laissant environ cinq microlitres.Placez ensuite une deuxième lame recouverte de polylysine au-dessus de chaque lame d'échantillon, de sorte que les deux surfaces recouvertes adhèrent ensemble, piégeant les tissus dans la cavité. Si un excès de fixateur est présent, absorbez-le avec un morceau de papier. Congelez maintenant les lames en les plaçant sur le bloc d'aluminium froid pendant au moins 15 minutes.Entre-temps, préparez des bains de méthanol et d'acétone sur glace pour les lames. Une fois les lames congelées, faites pivoter l'une d'elles pour provoquer une rupture par congélation de l'échantillon. Jetez la lame supérieure et immergez la lame inférieure dans du méthanol glacé pendant cinq minutes.Faites cela pour tous les échantillons. La rupture par congélation permet la pénétration des sondes et des anticorps à travers la coquille dure de l'œuf. Si les œufs ont été correctement rompus par congélation, vous pourrez voir les œufs sur les deux lames.Après au moins cinq minutes dans du méthanol, transférez les lames dans de l'acétone froide pendant cinq minutes. Cinq minutes plus tard, faites tremper les échantillons dans du PBST trois fois pendant cinq minutes par bain. Après les lavages au PBST, les lames peuvent être conservées dans de l'éthanol à 100 % à quatre degrés Celsius pendant plusieurs jours.Pour continuer, ajoutez 20 microlitres de solution d'ARNase dans les puits de l'échantillon et incubez-les dans une chambre humide à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, lavez les lames deux fois dans du SSCT 2x, 15 minutes par lavage. Après ces deux lavages, ajoutez 20 microlitres de solution d'hybridation aux échantillons et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant une heure dans une chambre humide.Entre-temps, préparez la sonde pour une sonde d'ADN double brin. Dénaturez-la à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis refroidissez-la brièvement sur de la glace. Après une heure, aspirez la solution d'hybridation et ajoutez la solution de sonde.À partir de cette étape, protégez l'échantillon de la lumière. Après avoir ajouté la sonde, recouvrez les échantillons avec des lamelles en verre. Préparez ensuite une chambre humidifiée sur un bloc chauffant à 80 degrés Celsius.Lorsque le bloc chauffant est revenu à 80 degrés Celsius, placez les lames d'échantillons dans la chambre préchauffée et laissez-les dénaturer pendant trois minutes. Incubez ensuite toutes les lames traitées dans une chambre humide à 37 degrés Celsius pendant toute la nuit. Après l'incubation nocturne, lavez les échantillons dans du PBST à température ambiante pendant cinq minutes.En préparation, porter la solution d'hybridation à 37 degrés Celsius une heure avant le lavage. Ensuite, charger les lames dans un bocal contenant la solution de lavage d'hybridation et les incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour éliminer la solution d'hybridation, laver les échantillons avec du PBST à température ambiante pendant 15 minutes.Répétez cette opération trois fois. Après avoir aspiré le dernier lavage au PBST, ajoutez 20 microlitres de solution de blocage à chaque échantillon et incubez-les dans des chambres humidifiées à température ambiante pendant une heure à l’abri de la lumière. Ensuite, aspirez la solution de blocage et remplacez-la par une solution d’anticorps anti-digoxigénine conjugué à la FITC à une dilution de un à 200.Couvrez les lames et incubez-les à température ambiante pendant trois heures à l'abri de la lumière. Après la coloration par anticorps, lavez les échantillons deux fois avec du PBST pendant 15 minutes par lavage, à l'abri de la lumière. Ensuite, aspirez le PBST et remplacez-le par 10 microlitres de solution de montage contenant du DAPI.Appliquez un coverslip et absorbez toute solution excédentaire. Enfin, scellez les bords du coverslip avec du vernis à ongles et procédez à l'observation des échantillons au microscope à fluorescence. À l'aide de la sonde PNA, les télomères d'animaux survivant à une mutation suffisante au niveau des télomères ont été observés.Dans les gonades, le nombre de télomères par noyau est quantifiable. Le signal des télomères est co-localisé avec un signal TALT1, ce qui soutient l'idée que TALT1 est responsable de la survie en l'absence de télomères. L'intensité du signal des télomères a été comparée à l'aide d'un logiciel.Le signal était plus intense chez les survivants ALT que chez les souches parentales utilisées pour générer les mutants déficients en télomères. N'oubliez pas que le travail avec du paraformaldéhyde et de la formamide peut être extrêmement dangereux, et que des précautions, telles que le port de gants, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Observation et la quantification des télomères et des séquences répétitives utilisant Fluorescence In Situ Hybridation (FISH) avec PNA Sondes en Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal

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