Name: Analyse des interactions protéine-ADN télomériques à l’aide d’une pince magnétique à molécule unique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-30T14:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Découvrez l'analyse des interactions protéine-ADN télomériques à l'aide de pinces magnétiques à molécule unique. Ce protocole détaille la préparation de TRF2 et d'ADN télomérique humain, ainsi que l'analyse des propriétés mécaniques et de la cinétique de dissociation.

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<meta charset="utf8"></head><body>Étude des interactions TRF1/2 avec l’ADN télomérique à l’aide d’un dosage à molécule unique

<table><tbody><tr><td>Anti-digoxigénine</td><td>Roche</td><td>11214667001</td><td></td></tr><tr><td>BfaI</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0568S</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900933</td><td></td></tr><tr><td>caméra CMOS&nbsp ;</td><td>Mikrotron</td><td>MC1362</td><td></td></tr><tr><td>CviAII</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0640S</td><td></td></tr><tr><td>DIG-11-dUTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-803-DIGXL</td><td></td></tr><tr><td>solution d’extraction d’ADN</td><td>G-CLONE</td><td>EX0108</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I, sans Rnase, Hc Ea</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0523</td><td></td></tr><tr><td>Mélange dNTP</td><td>Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)</td><td>P032-02</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Solarbio</td><td>D1070</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-270&nbsp ; billes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65305</td><td>Perles de streptavidine</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne perles</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65001</td><td>Perles de streptavidine</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Beijing Hwrkchemical Co. Ltd</td><td>SMG66258-1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Solarbio</td><td>II0070</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Solarbio</td><td>I8070</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory</td><td>A1079</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0523</td><td></td></tr><tr><td>Fragment de Klenow (3&prime ;-5&prime ; exo-)</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments</td><td>https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html</td><td>Logiciel de programmation graphique&nbsp ;</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Bide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)</td><td>BD136449</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Solarbio</td><td>L8120-5</td><td></td></tr><tr><td>MseI</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0525S</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Shanghai Aladdin</td><td>C111533</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Spectrophotometer</td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>Ni NTA Perles 6FF</td><td>Changzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,Ltd</td><td>SA005025</td><td></td></tr><tr><td>Membrane nitrocellulosique</td><td>ABclonal</td><td>RM02801</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Solarbio</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Beyotime Biotech Inc (beyotime)</td><td>ST535-500mg</td><td></td></tr><tr><td>rCutSmart Buffer</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>2124902</td><td></td></tr><tr><td>Sumo protéase</td><td>Beyotime Biotech Inc (beyotime)</td><td>P2312M</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse des interactions protéine-adn télomériques à l’aide d’une pince magnétique à molécule unique

Analyzing Telomeric Protein-DNA Interactions Using Single-Molecule Magnetic Tweezers

La figure 1A illustre les domaines schématiques et les structures de TRF1 et TRF2, composés respectivement de 439 et 542 acides aminés, qui peuvent être exprimés dans les cellules procaryotes. La préparation de TRF1 a déjà été décrite dans la littérature41. Nous fournissons ici une description complète et des résultats représentatifs de la préparation de TRF2. La figure 1B montre la carte plasmidique utilisée pour exprimer TRF2 chez E. coli. Nous avons évalué l’expression de TRF2 avant et après l’induction chez E. coli, comme le montre la figure 1B. Les processus de purification et de clivage des étiquettes ont également été analysés à l’aide de SDS-PAGE (Figure 1C). Selon ce protocole, les deux protéines de liaison télomériques, TRF1 et TRF2, ont été exprimées avec succès chez E. coli.
L’ADN télomérique, sous forme de fragments de restriction terminale (TRF), est généré à partir de génomes humains à l’aide d’une combinaison de quatre enzymes de restriction. En suivant l’organigramme de la figure 2A, nous avons extrait des génomes de cellules humaines. Les enzymes digèrent sélectivement l’ADN génomique tout en laissant l’ADN télomérique complet intact, fournissant ainsi du matériel pour les tests à molécule unique. Nous avons testé de manière approfondie la préparation de l’ADN TRF en utilisant diverses lignées cellulaires humaines. L’intégrité de l’ADN génomique a été examinée à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose, comme le montre la figure 2B. Les TRF ont ensuite été analysés par transfert de Southern, en utilisant des oligonucléotides marqués par fluorescence complémentaires à la séquence de répétition télomérique TTAGGG (Figure 2C), selon une méthode décrite ailleurs41,56. En moyenne, la longueur des TRF humaines est d’environ quelques kilobases.
Les dosages à molécule unique ont lieu dans une cellule d’écoulement assemblée comme décrit à la figure 3A. Un revêtement nitrocellulosique recouvre la surface du verre chargée négativement, fournissant une matrice hydrophile pour l’adsorption des anticorps. La passivation BSA bloque les zones de la matrice nitrocellulosique non liées par des anticorps anti-digoxigénine. Les billes de polystyrène, qui ne contiennent pas de nanoparticules de fer, servent de billes de référence. Les attaches TRF sont formées par des interactions d’affinité entre l’anticorps digoxigénine sur la matrice de nitrocellulose et la biotine-streptavidine à la surface de la bille magnétique (Figure 3B). TRF1 ou TRF2 sont introduits dans la cellule d’écoulement et se lient aux attaches d’ADN TRF par diffusion libre. Des pinces magnétiques sont utilisées pour moduler le champ magnétique, générant des forces sur les billes magnétiques pour étirer et détendre les attaches TRF, permettant ainsi de sonder les interactions protéine-ADN.
Un test mécanique à molécule unique est conçu en développant un script pour contrôler les mouvements des moteurs des pinces magnétiques. Un organigramme fournit une approche structurée pour créer ce script dans MatLab pour un test à molécule unique à l’aide d’une pince magnétique (Figure 4A). Les aimants se déplacent le long de l’axe z dans une plage de 0 à 25 mm. Les forces sont calculées en fonction de la position de l’aimant, en fonction de la configuration de l’aimant, à l’aide d’équations décrites dans la littérature54. Pour un taux de charge de force spécifique, les positions des aimants et les vitesses de déplacement sont conçues et programmées dans MatLab pour obtenir le profil de manipulation de force souhaité, comme le montre l’exemple de l’essai de rampe de force (Figure 4B-D).
En utilisant TRF1 comme exemple, nous avons sondé les interactions ADN-protéine télomérique avec des pinces magnétiques à molécule unique. Le dispositif expérimental peut être configuré comme un test de rampe de force, comme le montre la figure 5A, où les courbes de force-extension présentent des caractéristiques en zigzag pendant l’étirement en raison de la rupture des interactions protéine-ADN et des traces lisses pendant la relaxation, reflétant la fibre d’ADN sans boucles médiées par les protéines. La configuration peut également être configurée comme un test de saut de force, comme le montrent les figures 5B et C, ce qui nous permet de mesurer les changements d’extension et la durée des interactions protéine-ADN sous des forces spécifiques. La cinétique de dissociation des complexes adn-protéine télomérique peut être dérivée de ces mesures (Figure 5D). De plus, la formation de boucles dans les complexes ADN-protéines peut être révélée par des changements d’extension (Figure 5E). De plus, la concentration en protéines peut être titrée dans ce dispositif expérimental d’ADN télomérique. De plus, l’hétérogénéité de longueur de l’ADN télomérique des cellules humaines nous permet d’étudier le mécanisme de formation de boucles dans des télomères de différentes longueurs (Figure 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig01v2.jpg"> Figure 1 : L’expression et la purification de TRF1/2. (A) L’architecture de domaine de TRF1 et TRF2. (B) La carte plasmidique de pET28a-SUMO-TRF2 pour l’expression de TRF2 chez E. coli. (C) Analyse SDS-PAGE des échantillons obtenus à différents stades d’expression et de purification. Voie 1 : Non induite par l’IPTG. Voie 2 : Précipité induit par IPTG obtenu par lyse cellulaire. Voie 3 : Surnageant induit par IPTG obtenu après lyse cellulaire. Voie 4 : Traversez la colonne Ni. Voie 5 : Laver avec un tampon à faible teneur en imidazole pour éliminer les protéines d’impuretés. Voie 6 : élution de 6xHis-SUMO-TRF2 avec tampon contenant 300 mM d’imidazole. Voie 7 : Digestion des marqueurs SUMO par l’enzyme protéase SUMO. Voie 8 : Repurification avec colonne Ni et élution de TRF2 (6xHis et marqueurs SUMO retirés) avec tampon contenant 20 mM d’imidazole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig02.jpg"> Figure 2 : Préparation des fragments de restriction terminale (TRF). (A) Organigramme pour la préparation des TRF à partir de cellules humaines. (B) Examen de l’intégrité de l’ADN génomique à l’aide d’un gel d’agarose à 1 % pour 5 lignées cellulaires humaines. (C) Analyse TRF réalisée par Southern blot pour 5 lignées cellulaires humaines. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig03.jpg"> Figure 3 : Préparation d’essais mécaniques à molécule unique. (A) Organigramme illustrant la préparation d’une cellule d’écoulement pour des essais mécaniques à molécule unique. (B) Représentation schématique de dosages mécaniques à molécule unique à l’aide d’une pince à épiler magnétique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig04.jpg"> Figure 4 : Conception d’un test mécanique à molécule unique. (A) Organigramme pour la génération d’un script pour exécuter un test de rampe de force. (B) Le profil de mouvement des aimants le long de l’axe z. (C) Le profil de force correspondant au mouvement de l’aimant. (D) La corrélation entre les positions des aimants et les forces résultantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig05.jpg"> Figure 5 : Interactions ADN-protéines télomériques sondées par des pinces magnétiques à molécule unique. (A) Les interactions TRF1-télomères ont été sondées dans des tests de rampe de force (N = 10) dans un tampon contenant 20 mM d’HEPES (pH 7,5), 1 mM d’EDTA et 100 mM de NaCl à 23 °C. La concentration de TRF1 était de 10 nM, avec un taux de charge de force de ±1 pN/s. (B) La sangle TRF a été étirée et relâchée dans les essais de saut de force. Le protocole de force appliqué était Frest = 0 pN, Ftest = 2 pN - 8 pN, Fhigh = 10 pN et Fmax = 20 pN. Les conditions de tampon et de température étaient les mêmes que dans (A). Fréquence d’images = 200 Hz. (C) Les interactions TRF1-télomères ont été sondées dans des tests de saut de force avec une concentration de TRF1 de 10 nM. (D) Cinétique de dissociation des complexes TRF1-télomères. Le logarithme du taux de dissociation aux forces testées (moyenne ± écart-type, n = 206) suit le modèle de Kramer-Bell-Evans (courbe rouge et équation de légende). L’encart montre le temps moyen de dissociation (&lt;τ&gt;) à Ftest. (E) Distribution des changements d’extension (ΔL) lors des ruptures des complexes TRF1-télomères. Les courbes noires et rouges représentent les raccords gaussiens. Cette figure a été modifiée avec la permission de Li et al.41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig06.jpg"> Figure 6 : Le nombre et la taille des boucles d’ADN formées par TRF1 dans un télomère. (A) Dépendance de la longueur des télomères de la taille des boucles d’ADN (ΔL) à [TRF1] = 20 nM. Les courbes représentent des raccords gaussiens. (B) Dépendance de la longueur des télomères de ΔL à [TRF1] = 40 nM. (C) Corrélation entre ΔL et le nombre d’événements de rupture par télomère, N. La corrélation d’ordre zéro est r = -0,20, avec p &lt; 0,001 (taille de l’échantillon = 1496). (D) Un dessin animé illustrant un mécanisme possible expliquant la corrélation négative entre ΔL et N, suggérant que TRF1 peut compacter un seul télomère avec des domaines de boucle primaires dans une topologie d’ordre élevé. Cette figure a été modifiée avec la permission de Li et al.41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Code MatLab pour la génération de scripts.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-MatLab%20code%20for%20generating%20scripts.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 2 : Script pour une force constante assay.txt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-Script%20for%20constant%20force%20assay.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Dossier supplémentaire 3 : Script pour la rampe de force assay.txt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-Script%20for%20force%20ramp%20assay.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Tableau supplémentaire 1 : Recettes <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Analyse des interactions protéine-ADN télomériques à l’aide d’une pince magnétique à molécule unique

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