Enregistrement dans l’espace restreint des Oscillations dans l’hippocampe de se comporter de souris
1 juillet 2018
Ce protocole décrit l’enregistrement des potentiels de champ local multi queue linéaire silicium sondes. Conversion des signaux en utilisant l’analyse de la densité actuelle source permet la reconstruction de l’activité électrique locale dans l’hippocampe de souris. Avec cette technique, les oscillations dans l’espace restreint de cerveau peuvent être étudiées en se déplaçant librement souris.
Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que l’organisation des activités des réseaux neuronaux à des échelles temporelles et spatiales fines. Le principal avantage de cette technique est que l’utilisation de sondes linéaires en silicium, l’analyse des données de courant permet de reconstituer des oscillations locales qui ne peuvent pas être facilement détectées dans les enregistrements de potentiel de champ conventionnels. Pour commencer cette procédure, stérilisez les instruments chirurgicaux avec un stérilisateur à billes chaudes, puis essuyez toutes les surfaces de travail avec de l’éthanol à 70 %.
Ensuite, montez l’animal anesthésié dans un cadre stéréotaxique en insérant doucement des barres auriculaires dans le conduit auditif. Une fois que la tête de la souris est stabilisée par les barres d’oreille, placez un embout buccal sur le museau pour une distribution continue d’isoflurane, puis appliquez une pommade sur les yeux pour éviter le dessèchement. Ensuite, placez un coussin chauffant sous la souris et injectez de la buprénorphine par voie sous-cutanée pour assurer une analgésie postopératoire.
Par la suite, rasez-lui la tête et désinfectez la peau avec de l’éthanol à 70 %. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, faites une incision sur la peau le long de la ligne médiane du crâne et ouvrez la peau à l’aide de pinces chirurgicales. Alignez la tête de l’animal à l’aide d’un outil d’alignement stéréotaxique pour niveler le bregma et le lambda.
Il doit y avoir moins de 50 micromètres de décalage de hauteur entre bregma et lambda. De plus, nivelez la tête le long de l’axe médial-latéral en mesurant la profondeur à une distance définie du bregma sur les côtés gauche et droit. Ajustez la tête si elle est inclinée.
Nettoyez la tête avec du peroxyde d’hydrogène à 3 % et séchez-la avec des lingettes en coton stériles. Déterminer l’emplacement de la craniotomie par rapport au bregma à l’aide d’un atlas stéréotaxique approprié. À l’aide d’une tête de forage de 0,9 millimètre, percez deux trous de vis dans l’os au-dessus du cervelet pour placer les vis de sol et de référence.
De plus, percez un à trois trous pour les vis d’ancrage afin de stabiliser l’implant. L’emplacement des vis d’ancrage dépendra de l’emplacement de la craniotomie. Insérez les vis dans l’os à l’aide d’un tournevis approprié.
Veillez à ne pas pénétrer dans le cerveau. Maintenant, effectuez la craniotomie en amincissant lentement le crâne avec la perceuse dans une zone rectangulaire autour du côté de l’implantation. Humidifiez fréquemment l’os avec un tampon de phosphate stérilisé.
Percez doucement le crâne aminci restant avec une aiguille d’injection de calibre 27 et retirez-le à l’aide d’une pince à épiler. Ensuite, percez soigneusement la dure-mère avec une aiguille d’injection de calibre 27. À l’aide d’une pince à épiler, formez un petit crochet en pliant la pointe de l’aiguille et utilisez ce crochet pour retirer la dure-mère.
Ensuite, appliquez un tampon phosphate pour empêcher la surface du cerveau de se dessécher. Ensuite, montez l’outil d’insertion d’électrode sur un support stéréotaxique et mettez la sonde à zéro sur bregma. Déplacez la sonde jusqu’aux coordonnées stéréotaxiques au-dessus de la craniotomie et pénétrez lentement la surface du cerveau.
Assurez-vous que les tiges de la sonde ne se plient pas et évitez de s’implanter dans les vaisseaux sanguins. Ensuite, abaissez lentement la sonde jusqu’à environ 200 micromètres au-dessus de la profondeur souhaitée. Ensuite, couvrez la craniotomie et les tiges de la sonde en silicone avec de la vaseline stérilisée pour la protection.
Par la suite, appliquez du ciment dentaire pour fixer la base de la sonde à la vis d’ancrage dans le crâne. Juste après l’application du ciment, déplacez lentement la sonde jusqu’à la profondeur cible. Avancez les 200 derniers micromètres après l’application du ciment pour réduire le mouvement latéral de la sonde et assurer des dommages tissulaires minimaux dans la zone cible.
Une fois le ciment durci, libérez la sonde de l’outil d’insertion en faisant fondre la cire avec un cautérisant. Ensuite, libérez la carte de connexion du dispositif d’insertion et positionnez-la à un endroit approprié sur le crâne à l’aide d’une pince crocodile. Fixez la planche de connexion au crâne à l’aide de ciment dentaire.
Dans le cas d’une implantation de sonde dans l’hippocampe, placez la carte de connexion sur l’os pariétal controlatéral. Ensuite, soudez les fils de terre et de référence de la carte de connexion aux fils attachés aux deux vis sur le cervelet. Coupez le couvercle de protection à la bonne hauteur et placez-le sur la sonde en silicone.
Ensuite, fixez le couvercle de la carte de connexion et du crâne à l’aide de ciment dentaire, en évitant la peau autour du crâne exposé. Après la chirurgie, appliquez un traitement analgésique approprié à la souris pendant au moins deux jours. Isolez la souris pour éviter d’endommager l’implant.
Des enregistrements de sondes en silicium implantées de manière chronique ciblant la zone CA1 sont présentés ici. L’analyse de la densité de la source de courant est appliquée le long des tiges individuelles de la sonde. Dans cet exemple, un seul événement d’onde aiguë conduit à un puits de courant proéminent dans la couche radiale de CA1 et dans le deuxième exemple, deux sites distincts dans la couche cellulaire granulaire du gyrus denté ont été enregistrés.
La bande gamma élevée a été isolée en appliquant un filtre passe-bande de 60 à 80 hertz, révélant des sursauts gamma locaux sur l’un des deux sites d’enregistrement situés dans la couche de cellules granulaires. Notez que l’activité d’oscillation gamma locale ne peut être détectée qu’après conversion des signaux enregistrés en CSD. Les signaux CSD, mais pas les signaux LFP, identifient les périodes d’asynchronisme de phase et d’amplitude entre les deux sites d’enregistrement.
Ce segment montre une brève époque d’activité gamma synchronisée. Les traces ici illustrent la différence de phase et l’indice de différence d’amplitude pour les traces LFP et CSD. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’implanter des sondes en silicium dans l’hippocampe.
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Aperçu
Ce protocole décrit l’enregistrement de potentiels de champ locaux à l’aide de sondes linéaires en silicium multipistes afin d’étudier l’activité électrique locale dans l’hippocampe de la souris. En utilisant une analyse de densité de courant source, il permet l’étude d’oscillations cérébrales spatialement restreintes chez des souris librement mobiles.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Électrophysiologie
- Fonction hippocampique
Contexte
- Comprendre l'organisation des réseaux neuronaux à fine échelle.
- L'analyse de la densité de courant source améliore la détection des oscillations cérébrales.
- Les sondes multi-broches permettent une cartographie précise de l'activité électrique.
- Les oscillations hippocampiques sont essentielles aux fonctions cognitives.
Objectif de l'étude
- Élucider l'organisation spatiale et temporelle des activités neuronales.
- Améliorer les méthodologies d'enregistrement de l'activité cérébrale électrique.
- Étudier les oscillations locales avec une résolution plus fine que les méthodes conventionnelles.
Méthodes utilisées
- Des sondes linéaires en silicium à plusieurs branches ont été implantées dans l'hippocampe.
- Le modèle utilisé était constitué de souris se déplaçant librement afin d'étudier la dynamique cérébrale in vivo.
- Aucun flux de travail multiomique n'a été mentionné.
- Les principales techniques chirurgicales et stéréotaxiques ont été décrites pour l'implantation des sondes.
- L'analyse de la densité de courant source a été appliquée après l'enregistrement pour interpréter les données.
Résultats principaux
- Se concentrer sur l'analyse des événements d'ondes aiguës accompagnées de ripples dans les enregistrements hippocampiques.
- Démonstration d'une détection améliorée des oscillations gamma localisées.
- Observation de différences distinctes de phase et d'amplitude dans les potentiels de champ locaux après conversion en CSD.
- Les résultats soulignent les avantages de l'utilisation de la CSD par rapport aux analyses conventionnelles des LFP.
Conclusions
- Cette étude valide l'utilité des sondes en silicium pour la recherche hippocampique approfondie.
- Aucune donnée multiomique n'a été discutée ; l'accent est resté mis sur les découvertes électrophysiologiques.
- Les implications suggèrent qu'une meilleure compréhension des dynamiques oscillatoires neuronales pourrait enrichir les connaissances sur les processus de mémoire et d'apprentissage.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode permet une détection à haute résolution d'oscillations neuronales spatialement localisées dans l'hippocampe, répondant ainsi à un défi majeur en neurosciences précliniques : distinguer l'activité réelle d'un réseau local des signaux propagés par conduction volumique. En appliquant une analyse de densité de courant source (CSD) à des enregistrements de potentiels de champ locaux (LFP) multilaminaires provenant de sondes en silicium, les chercheurs peuvent isoler des dynamiques au niveau des microcircuits, pertinentes pour la mémoire et les fonctions cognitives. Cela soutient la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques en phase précoce de découverte, en fournissant des lectures reproductibles et quantifiables des états des réseaux hippocampiques chez des modèles en comportement.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'interroger l'organisation des microcircuits hippocampiques sous-jacents aux ondes aiguës et aux oscillations gamma, qui sont impliquées dans la consolidation de la mémoire.
- Valeur opérationnelle : Fournit des enregistrements électrophysiologiques résolus spatialement qui aident à distinguer les effets spécifiques ciblés des perturbations non spécifiques du réseau.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des profils quantitatifs de puits/sources de courant spécifiques aux couches, qui servent de biomarqueurs robustes de l'engagement du circuit local.
- Valeur opérationnelle : Normalise la mesure de l'activité oscillatoire entre les shanks et les animaux, favorisant la reproductibilité des tests dans les études longitudinales.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Relie les motifs oscillatoires dérivés des potentiels de champ locaux aux états comportementaux chez des souris en déplacement libre, renforçant ainsi la validité prédictive des critères cognitifs.
- Valeur opérationnelle : Permet de détecter un découplage phase-amplitude entre les sites d'enregistrement, observable uniquement dans les courants de source distribués (CSD), offrant ainsi un indicateur sensible du dysfonctionnement du réseau.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte, allant du test d'hypothèses en biologie précoce à l'optimisation du composé candidat, où des phénotypes de réseau oscillatoires peuvent renseigner sur l'engagement de la cible et la sélectivité du circuit.
- Biologie de la découverte : Permet l'analyse mécanistique des oscillations du réseau hippocampique afin de clarifier les effets ciblés sur la synchronisation neuronale.
- Écrantage : Fournit des mesures quantitatives normalisées du CSD (par exemple, puissance en bande gamma, fréquence des ripples), adaptées à l'écrantage fiable de modulateurs pharmacologiques.
- Analyse : Permet d'extraire des indices d'asymétrie de phase et d'amplitude à partir des tracés de CSD, offrant des mesures objectives de la coordination du réseau.
- Recherche translationnelle : Relie les signatures oscillatoires locales au comportement, facilitant l'alignement des biomarqueurs avec les domaines cognitifs pertinents pour les indications neuropsychiatriques.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme électrophysiologique réutilisable pour la surveillance longitudinale de l'état du réseau dans divers modèles de maladie et cohortes thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en isolant les véritables oscillations locales des signaux parasites conduits par volume dans les données de potentiel de champ local (LFP).
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité grâce à des protocoles standardisés de positionnement des sondes, de calcul de la densité de courant source (CSD) et de filtrage passe-bande (par exemple, 60–80 Hz pour le gamma élevé).
- Valeur stratégique : Réduit l'incertitude liée à la dé-risquisation biologique en permettant la détection de changements subtils au niveau du réseau (par exemple, désynchronisation de phase) non détectés par les approches conventionnelles de LFP.
- Impact sur le portefeuille : Éclaire les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin en se basant sur l'engagement ciblé au niveau du réseau plutôt que sur des modifications de l'activité globale.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en chirurgie stéréotaxique, en électrophysiologie et en transformation mathématique de la CSD.
- Dépend d'un dispositif à sonde en silicium linéaire, de systèmes d'acquisition capables d'enregistrer des potentiels locaux de champ multicanal et d'outils de post-traitement pour l'estimation des dérivées spatiales.
- Exige une standardisation inter-équipes de la profondeur de la sonde, de l'orientation de la lame et des paramètres de filtrage afin d'assurer la comparabilité entre les études.
- L'adaptation à d'autres régions cérébrales nécessite un ajustement des coordonnées stéréotaxiques et une validation de la structure laminée pour une interprétation précise de la CSD.
- Les limitations pratiques incluent l'invativité chirurgicale, la dérive du signal au fil du temps avec les implants chroniques, ainsi que la nécessité d'une validation experte des puits et sources de CSD par rapport aux repères histologiques.
