Immunofluorescence Étiquetage des pièges extracellulaires de l'homme et de la murine Neutrophil dans les tissus paraffins

Les pièges extracellulaires de Neutrophile (NET) sont des structures tridimensionnelles produites par les granulocytes neutrophiles stimulés. Il est devenu clair ces dernières années que les ENe sont impliqués dans une grande variété de maladies. La détection des EAE dans les tissus peut avoir une pertinence diagnostique, de sorte que des protocoles normalisés pour l'étiquetage des composants NET sont nécessaires.

Aujourd’hui, nous aimerions vous montrer des variantes du protocole commun de récupération des antigènes induits par la chaleur. Il combine les avantages d’une température plus basse pour l’antigène d’élasstase de neutrophile et de la valeur élevée de pH qui est exigée pour des histones. Cette technique permet d’étudier les NETs, les pièges extracellulaires neutrophiles, dans les tissus de paraffine à la fois de souris ou d’hommes.

Et il est également considéré comme étudiant des documents archivés ou des études rétrospectives. Tout d’abord, placez les glissières préparées dans des grilles et submersez-les dans les supports utilisés pour la déshydratation et le dégagement dans l’ordre inverse pendant cinq minutes chacun. Ensuite, chauffer un bain d’eau avec une plaque chaude à température contrôlée à 70 degrés Celsius.

Placer un bocal rempli de tampon épitopique induit par la chaleur et 10% de glycérol dans le bain d’eau. Lorsque le tampon a atteint 70 degrés Celsius, placez le support avec les glissières dans le bocal tampon. Incuber les toboggans à 70 degrés Celsius pendant 120 minutes.

Après cela, retirez le bocal du bain d’eau et laissez-le refroidir à température ambiante. Rincer les sections refroidies trois fois à l’eau ionisée et une fois avec le SCT. À l’aide de papier filtre roulé ou d’un coton-tige, retirer soigneusement tout liquide entre les sections des glissières, en s’assurant de laisser les sections hydratées.

Ensuite, utilisez un stylo barrière hydrophobe pour créer une barrière autour de chaque section. Incuber la section en bloquant le tampon à température ambiante pendant 30 minutes pour éviter une liaison non spécifique. Diluer les anticorps primaires en bloquant le tampon à une concentration d’un microgramme par millilitre.

Retirez le tampon de blocage des glissières et ajoutez les anticorps primaires dilués, en vous assurant d’utiliser un volume suffisant pour éviter le séchage. Fermer le contenant humide et incuber toute la nuit à température ambiante. Le lendemain, lavez les sections trois fois avec le SCT à chaque lavage d’une durée de cinq minutes.

Préparez une solution de travail d’anticorps secondaires dans le blocage tampon. Couvrez les sections de tissus avec la solution secondaire d’anticorps, et transférez les glissières dans un récipient humide. Sceller le contenant humide et incuber à température ambiante pendant une heure.

Après cela, laver les sections trois fois avec le SCT et une fois dans l’eau à chaque lavage d’une durée de cinq minutes. Couvrir les sections lavées d’un milieu de montage et appliquer le verre de couverture tout en évitant la formation de bulles. Une fois que le milieu de montage s’est solidifié, utilisez un microscope confocal ou un microscope à champ large avec des filtres de passage de bande appropriés pour analyser l’immunofluorescence.

Pour numériser les sections complètes à l’aide d’un scanner de diapositives, réglez l’intensité de fluorescence à l’aide des contrôles négatifs et positifs. À l’aide de la coloration de l’élasstase neutrophile, trouvez les zones riches en neutrophiles et zoomez sur ces zones pour vérifier si le signal d’élastase neutrophile est granulaire ou extracellulaire. Si le signal est extracellulaire et chevauche à la fois l’histone et la coloration de l’ADN, les pièges extracellulaires neutrophiles ont été obtenus.

Dans cette étude, les composants net sont détectés avec succès dans le tissu paraffin-incorporé, à la fois d’origine humaine et murine. Si les sections tissulaires ont une épaisseur comprise entre deux et trois micromètres, elles peuvent être analysées par microscopie à champ large à l’aide d’objectifs 10x ou 20x. Pour évaluer correctement la coloration, des échantillons négatifs et positifs ont été traités.

Une section représentative du tissu humain d’appendicite montre des tissus souillés pour NE, H2B, et Hoechst 33342. Les images sur la gauche proviennent d’une zone de la section contenant des NETs, tandis que les images sur la droite proviennent d’une zone différente de la même section qui contient de nombreux neutrophiles, mais pas de NETs. Les zones avec la formation massive de NET peuvent facilement être trouvées même aux grossissements bas puisque les trois composants nets colocalisent souvent dans les structures extracellulaires filandreuses.

Cela apparaît dans la superposition des trois canaux sous forme de fibres extracellulaires blanchâtres qui peuvent être quantifiées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image pour créer une superposition violette à l’aide de pixels provenant de signaux qui se chevauchent et qui sont positifs pour le vert, le rouge et le bleu. Pour une résolution plus élevée, les microscopes confocaux ou les microscopes à champ large avec déconvolution doivent être utilisés pour minimiser le flou. Une projection maximale d’une pile confoccale d’une zone riche en NET à partir du même spécimen d’appendicite humaine montre que l’ON se trouve dans les granules, mais est également abondante extracellulairement où il colocalise avec H2B et avec l’ADN.

La colocalisation extracellulaire se traduit par une combinaison de couleurs blanchâtres. Les pixels positifs pour le vert, le rouge et le bleu peuvent à nouveau être utilisés pour créer une superposition violette présentant des NET. Un détail représentatif d’une section centrale d’un poumon de souris infecté par Mycobacterium tuberculosis fournit un autre exemple de la colocalisation des trois composants net étant clairement visible comme zones blanchâtres entre les neutrophiles qui peuvent être utilisés pour créer une couche violette indiquant nets.

Pendant la procédure de coloration, les sections ne doivent pas tomber à sec parce que cela causera une tache faussement positive ou un fond élevé. L’analyse des documents archivés peut aider à comprendre l’impact des TNE dans les maladies. Parce que le tissu de paraffine peut avoir un fond énorme, il est important d’avoir un contrôle positif et négatif que vous pouvez distinguer entre votre coloration et l’arrière-plan.

Le déwaxing et la déshydratation doivent être effectués sous un capot de fumée. Assurez-vous de porter des gants et votre manteau de laboratoire.