Name: Modélisation de l’hémorragie intraventriculaire néonatale par injection intraventriculaire d’hémoglobine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T12:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Découvrez un modèle animal d'hémorragie intraventriculaire néonatale par injection stéréotaxique d'hémoglobine chez le rat. Cette méthode reproduit fidèlement l'hydrocéphalie post-hémorragique et permet d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

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JMS a reçu un financement des NIH/NINDS R01 NS110793 et K12 (Neurosurgeon Research Career Development Program). BAM a reçu un financement du NIH / NINDS K08 NS112580-01A1, du prix du domaine prioritaire de recherche en neurosciences de l’Université du Kentucky et du prix de l’innovation de l’Hydrocephalus Association .

REMARQUE : Tous les protocoles sur les animaux ont été approuvés par le Comité de protection et d’utilisation des animaux des établissements. Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole.
1. Préparation de solutions d’hémoglobine et de LCR
<ol><li>Préparer une solution artificielle stérile de LCR (aLCR) en ajoutant 500 μL de la solution de LCRa à un microtube de 1,5 mL et conserver sur de la glace.</li>
	<li>Préparer une solution stérile d’hémoglobine à 150 mg/mL en ajoutant 75 mg d’hémoglobine à 500 μL de LCRa dans un microtube de 1,5 mL et conserver sur de la glace.</li>
</ol>2. Préparation de l’animal pour injection
<ol><li>Tournez le coussin chauffant sur le réglage moyen pour maintenir la température corporelle du rat.</li>
	<li>Anesthésier les rats du jour 4 postnatal (P4) dans une chambre d’induction remplie d’isoflurane à 3 %. REMARQUE : Confirmez une anesthésie suffisante en utilisant la réponse de pincement des orteils et de la queue toutes les 15 minutes. Surveillez l’anesthésie avec une observation visuelle de la couleur des tissus, de la température corporelle et de la fréquence respiratoire.</li>
	<li>Administrer un soulagement de la douleur avec une injection sous-cutanée de carprofène de 5 mg/kg au rat anesthésié.</li>
	<li>Placez le rat anesthésié couché dans l’appareil stéréotaxique avec le nez positionné dans l’adaptateur d’anesthésie avec un débit constant d’isoflurane à 1,5%.</li>
	<li>Serrez les barres auriculaires anti-rupture sur le méat auditif externe pour sécuriser la tête. REMARQUE: Appliquez une pommade vétérinaire pour garder les yeux hydratés si les yeux sont ouverts au moment de l’injection.</li>
	<li>Nettoyez la tête en alternant avec des applicateurs stériles à embout de coton imbibés de bétadine et d’éthanol à 70%.<ol><li>Touchez l’applicateur imbibé de bétadine au centre du cuir chevelu et étalez la bétadine en cercles, en vous déplaçant vers l’extérieur.</li>
		<li>Répétez l’étape 2.6.1.1 avec l’applicateur imbibé d’éthanol.</li>
		<li>Répétez l’étape 2.6.1.1 et l’étape 2.6.1.2 3x.</li>
	</ol></li>
	<li>Appliquez un champ chirurgical stérile pour protéger le champ chirurgical.</li>
	<li>À l’aide d’un scalpel stérile, faites une incision verticale de 0,3 cm au centre de la tête pour exposer le bregma du crâne. REMARQUE: Si vous injectez à partir du lambda, exposez le lambda du crâne au lieu du bregma.</li>
	<li>Utilisez un applicateur stérile à embout de coton pour sécher la zone.</li>
</ol>3. Mise en place de l’injecteur stéréotaxique
<ol><li>Prélever la solution d’hémoglobine préparée à l’étape 1.2 dans une seringue stérile de 0,3 mL à l’aide d’une aiguille 30G et placer la seringue dans le système d’injection stéréotaxique. REMARQUE : Si vous générez des conditions de contrôle, aspirer une solution de LCR préparée à l’étape 1.1 dans une seringue stérile de 0,3 mL et suivre le protocole.</li>
	<li>Allumez l’interface de l’injecteur stéréotaxique et cliquez sur le bouton Configuration pour entrer les paramètres de volume et de débit d’injection.<ol><li>Cliquez sur Volume et réglez le volume à 20 000 nL (20 μL).</li>
		<li>Cliquez sur Débit de perfusion et réglez le débit à 8 000 nL/min (8 μL/min).</li>
	</ol></li>
	<li>Quittez la configuration en cliquant sur le bouton Réinitialiser le PDV.</li>
	<li>Rincez l’extrémité de l’aiguille en cliquant sur le bouton Infuser jusqu’à ce qu’un petit cordon de solution d’hémoglobine émerge à l’extrémité de l’aiguille.</li>
	<li>Évacuez doucement la solution d’hémoglobine de l’extrémité de l’aiguille avec un applicateur stérile à embout de coton.</li>
</ol>4. Injection animale
<ol><li>Réglez le bregma à zéro sur le système d’injection stéréotaxique en ajustant les positions médiolatérale et antéropostérieure de la seringue avant d’abaisser l’extrémité de l’aiguille de la seringue rincée pour toucher doucement le crâne au niveau du bregma. REMARQUE : Si vous effectuez une injection à partir du lambda, définissez lambda sur zéro.</li>
	<li>Identifiez les coordonnées de votre choix.<ol><li>En cas d’injection à partir du bregma, chez les rats P4 décrits ici, utiliser 1,5 mm latéral, 0,4 mm antérieur et 2,0 mm de profondeur à partir de bregma.</li>
		<li>En cas d’injection à partir du lambda, utilisez les coordonnées suivantes pour les rats P4 : 1,1 mm latéral, 4,6 mm antérieur et 3,3 mm de profondeur à partir du lambda.</li>
	</ol></li>
	<li>Soulevez l’aiguille de la seringue à 1 cm au-dessus du crâne pour dégager le cuir chevelu. Lorsque la seringue est soulevée, procédez au réglage des coordonnées médiolatérales et antéropostérieures.</li>
	<li>Abaissez l’aiguille de la seringue pour toucher doucement le crâne. Vérifiez que l’aiguille touche le crâne.</li>
	<li>Réglez la coordonnée dorso-ventrale sur une période de 30 s. REMARQUE: Lors du réglage de la coordonnée dorso-ventrale, l’aiguille percera le crâne. Il faut veiller à ce que la seringue traverse le crâne sans déformer le crâne. La déformation du crâne est évitée en retirant lentement l’aiguille le long de la coordonnée dorso-ventrale si une déformation se produit, puis en replaçant l’aiguille le long de la même trajectoire. Cela permet à l’aiguille de passer à travers le trou dans le crâne avec moins de force et sans déformation.</li>
	<li>Sur l’interface de l’injecteur stéréotaxique, cliquez sur le bouton Exécuter pour commencer l’injection.</li>
	<li>Une fois l’injection terminée, laissez l’aiguille de la seringue en place pendant 2 minutes pour minimiser le reflux de la solution.</li>
	<li>Retirer lentement la seringue le long de la coordonnée dorso-ventrale pendant 2 min jusqu’à ce que l’extrémité de l’aiguille soit à 2 cm au-dessus du cuir chevelu.</li>
	<li>Faites pivoter le bras de l’injecteur stéréotaxique loin du champ opératoire.</li>
</ol>5. Soins postopératoires
<ol><li>Fermez le cuir chevelu avec une suture monofilament 6-0. Faites une simple suture interrompue au centre de l’incision de 0,3 cm.</li>
	<li>Retirez le chiot de l’anesthésie et placez-le dans un endroit sûr du coussin chauffant.</li>
	<li>Retourner le rongeur dans la cage de la maison pour se remettre de l’anesthésie sous la garde de sa mère. REMARQUE : Le retour rapide aux soins de la mère réduit la mortalité postopératoire précoce.</li>
	<li>Surveiller les animaux pour l’anesthésie en perdant le réflexe de redressement toutes les heures après la chirurgie pendant 3 heures.</li>
	<li>Surveillez les animaux quotidiennement pendant 7 jours pour une activité normale, un apport alimentaire et un gain de poids. Surveillez le site d’incision pour la cicatrisation, la fermeture et la réapparition de la fourrure au site de la chirurgie. REMARQUE : Dans les rares cas où des changements neurologiques tels que des convulsions, une dépression centrale ou une diminution de l’appétit sont observés pendant la surveillance, euthanasier l’animal en utilisant une perfusion intravasculaire ou une luxation cervicale sous anesthésie.</li>
	<li>Pour prévenir l’infection une fois que la suture est fermée et que la plaie guérit, appliquez un triple antibiotique topique au site d’incision.</li>
</ol>6. Acquisition et quantification de l’IRM
<ol><li>Effectuez une IRM sur un scanner pour petits animaux de 4,7 T ou 9,4 T.</li>
	<li>Tournez le coussin chauffant sur le réglage moyen pour maintenir la température corporelle du rat.</li>
	<li>Induire l’anesthésie dans une chambre en utilisant 3% d’isoflurane. REMARQUE : Confirmez une anesthésie suffisante en utilisant la réponse de pincement des orteils et de la queue toutes les 15 minutes. Surveillez l’anesthésie avec une observation visuelle de la couleur des tissus, de la température corporelle et de la fréquence respiratoire.</li>
	<li>Placez le rat anesthésié couché dans l’IRM avec le nez positionné dans l’adaptateur d’anesthésie avec un débit constant de 1,5% d’isoflurane.</li>
	<li>Effectuez une imagerie pondérée T2 en sélectionnant une séquence d’écho de rotation rapide pondérée T2.<ol><li>Si vous utilisez un scanner IRM 4,7T, entrez les paramètres suivants dans le logiciel IRM : temps de répétition = 3 000 ms, temps d’écho = 27,50 ms, nombre de moyennes = 3, champ de vision = 18,0 mm x 18,0 mm, matrice = 128 x 128, nombre de tranches axiales = 24, épaisseur = 0,50 mm.</li>
		<li>Si vous utilisez un scanner IRM 9,4T, entrez les paramètres suivants dans le logiciel IRM : temps de répétition = 5 000 ms, temps d’écho = 66,00 ms, espacement des échos = 16,50 ms, nombre de moyennes = 2, répétitions = 1, facteur rare = 8, champ de vision = 16,0 mm x 16,0 mm, matrice = 256 x 256, nombre de tranches axiales = 32, épaisseur = 0,50 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Cliquez sur le bouton Continuer pour démarrer la séquence.</li>
</ol>7. Traitement et analyse d’images
<ol><li>Utilisez des données natives pondérées en T2 pour analyser le volume cérébral. Utilisez un logiciel de segmentation pour délimiter manuellement les ventricules latéraux6. Cliquez sur Mode pinceau et sélectionnez le style de pinceau carré . Ajustez la taille du pinceau à 1. Cliquez sur Inspecteur de mise en page et sélectionnez Vue axiale. Cliquez sur zoom pour l’ajuster. Placez le curseur sur l’image; tracer et remplir l’espace ventricule latéral.</li>
	<li>Cliquez sur Segmentation dans la barre d’outils | Volume et statistiques pour afficher les volumes segmentés.</li>
</ol>

<ol><li>Robinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+posthemorrhagic+hydrocephalus+from+prematurity%3A+Pathophysiology+and+current+treatment+concepts%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%3A+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Neonatal posthemorrhagic hydrocephalus from prematurity: Pathophysiology and current treatment concepts: A review.</a> Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 9 (3), (2012).</li>
<li>Hasselager, A. B., Børch, K., Pryds, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+in+perinatal+care+for+extremely+premature+infants+in+Denmark+from%5BTitle%5D)+AND+%22Danish+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Improvement in perinatal care for extremely premature infants in Denmark from.</a> Danish Medical Journal. 63 (1), to (1994).</li>
<li>Johnston, P. G., Gillam-Krakauer, M., Fuller, M. P., Reese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence-Based+Use+of+Indomethacin+and+Ibuprofen+in+the+Neonatal+Intensive+Care+Unit%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Perinatology%22%5BJournal%5D)">Evidence-Based Use of Indomethacin and Ibuprofen in the Neonatal Intensive Care Unit.</a> Clinics in Perinatology. 39 (1), (2012).</li>
<li>Mahaney, K. B., Buddhala, C., Paturu, M., Morales, D., Limbrick, D. D., Strahle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraventricular+Hemorrhage+Clearance+in+Human+Neonatal+Cerebrospinal+Fluid%3A+Associations+with+Hydrocephalus%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Intraventricular Hemorrhage Clearance in Human Neonatal Cerebrospinal Fluid: Associations with Hydrocephalus.</a> Stroke. , (2020).</li>
<li>Strahle, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+CSF+Iron+Pathway+Proteins+in+Posthemorrhagic+Hydrocephalus%3A+Associations+with+Ventricle+Size+and+Neurodevelopmental+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Longitudinal CSF Iron Pathway Proteins in Posthemorrhagic Hydrocephalus: Associations with Ventricle Size and Neurodevelopmental Outcomes.</a> Annals of Neurology. 90 (2), (2021).</li>
<li>Strahle, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Hemoglobin+and+Iron+in+hydrocephalus+after+neonatal+intraventricular+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Role of Hemoglobin and Iron in hydrocephalus after neonatal intraventricular hemorrhage.</a> Neurosurgery. 75 (6), (2014).</li>
<li>Garton, T. P., He, Y., Garton, H. J. L., Keep, R. F., Xi, G., Strahle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemoglobin-induced+neuronal+degeneration+in+the+hippocampus+after+neonatal+intraventricular+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Hemoglobin-induced neuronal degeneration in the hippocampus after neonatal intraventricular hemorrhage.</a> Brain Research. 1635, (2016).</li>
<li>SNAP Tutorial and User’s Manual. , Medtext, Inc.. Hinsdale (IL). Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.itksnap.org/docs/fullmanual.php">http://www.itksnap.org/docs/fullmanual.php</a> (2022).</li>
<li>Goulding, D. S., Caleb Vogel,, Gensel, R., Morganti, J. C., Stromberg, J. M., Miller, A. J., A, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+brain+inflammation%2C+white+matter+oxidative+stress%2C+and+myelin+deficiency+in+a+model+of+neonatal+intraventricular+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%3A+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Acute brain inflammation, white matter oxidative stress, and myelin deficiency in a model of neonatal intraventricular hemorrhage.</a> Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 26 (6), (2020).</li>
<li>Strahle, J., Garton, H. J. L., Maher, C. O., Muraszko, K. M., Keep, R. F., Xi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Hydrocephalus+After+Neonatal+and+Adult+Intraventricular+Hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Stroke+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Hydrocephalus After Neonatal and Adult Intraventricular Hemorrhage.</a> Translational Stroke Research. 3, (2012).</li>
<li>Jinnai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Model+of+Germinal+Matrix+Hemorrhage+in+Preterm+Rat+Pups%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Model of Germinal Matrix Hemorrhage in Preterm Rat Pups.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).</li>
<li>Georgiadis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+acute+brain+injuries+and+neurobehavioral+profiles+in+a+rabbit+model+of+germinal+matrix+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Characterization of acute brain injuries and neurobehavioral profiles in a rabbit model of germinal matrix hemorrhage.</a> Stroke. 39 (12), (2008).</li>
<li>Cherian, S. S., Love, S., Silver, I. A., Porter, H. J., Whitelaw, A. G. L., Thoresen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posthemorrhagic+ventricular+dilation+in+the+neonate%3A+Development+and+characterization+of+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Posthemorrhagic ventricular dilation in the neonate: Development and characterization of a rat model.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 62 (3), (2003).</li>
<li>Balasubramaniam, J., Xue, M., Buist, R. J., Ivanco, T. L., Natuik, S., del Bigio,, R, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+motor+deficit+following+infusion+of+autologous+blood+into+the+periventricular+region+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Persistent motor deficit following infusion of autologous blood into the periventricular region of neonatal rats.</a> Experimental Neurology. (1), (2006).</li>
<li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+injury+in+premature+infants%3A+a+complex+amalgam+of+destructive+and+developmental+disturbances%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances.</a> The Lancet Neurology. 8 (1), (2009).</li>
<li>Dobbing, J., Sands, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+the+brain+growth+spurt%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Human+Development%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of the brain growth spurt.</a> Early Human Development. 3 (1), (1979).</li>
<li>Craig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Experimental Neurology. 181 (2), (2003).</li>
<li>Lodygensky, G. A., Vasung, L., Sv Sizonenko,, Hüppi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimaging+of+cortical+development+and+brain+connectivity+in+human+newborns+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Neuroimaging of cortical development and brain connectivity in human newborns and animal models.</a> Journal of Anatomy. 217 (4), (2010).</li>
<li>Dean, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+differences+in+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Developmental Neuroscience. 33 (34), (2011).</li>
<li>Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Development of the blood-brain barrier.</a> Cell and Tissue Research. 314 (1), (2003).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+required+for+blood%C4%9D%E2%82%AC%26%2334%3Bbrain+barrier+integrity+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes are required for bloodĝ€&#34;brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), (2010).</li>
<li>Alles, Y. C. J., Greggio, S., Alles, R. M., Azevedo, P. N., Xavier, L. L., DaCosta, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+preclinical+rodent+model+of+collagenase-induced+germinal+matrix%2Fintraventricular+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">A novel preclinical rodent model of collagenase-induced germinal matrix/intraventricular hemorrhage.</a> Brain Research. 1356, (2010).</li>
<li>Christian, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+hospitalization+of+preterm+infants+with+intraventricular+hemorrhage+and+hydrocephalus+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%3A+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Trends in hospitalization of preterm infants with intraventricular hemorrhage and hydrocephalus in the United States.</a> Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 17 (3), 2000-2010 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.

Ce modèle d’hémoglobine utilisant l’injection d’hémoglobine permet l’étude de la pathologie de l’hémoglobine intraveineuse spécifiquement médiée par l’hémoglobine. Pour les études complémentaires, l’hémoglobine peut également être facilement administrée in vitro et ne confond pas les tests biochimiques pour les protéines fabriquées par les microglies / macrophages présents dans le sang total.
Les principales théories de l’HNV-PHH comprennent l’obstruction mécanique de la circulation d...

L’hémorragie intranatale néonatale provient de la matrice germinale, un site de division cellulaire rapide adjacent aux ventricules latéraux du cerveau en développement. Cette structure hautement vasculaire est vulnérable à l’instabilité hémodynamique liée à une naissance prématurée. Le sang est libéré dans les ventricules latéraux lors de l’hémorragie de la matrice germinale (GMH)-IVH lorsque des vaisseaux sanguins fragiles dans la matrice germinale se rompent. Dans le cas de l’hémorragie de grade IV, l’infarctus hémorragique périventriculaire peut également contribuer à la libération de produits sanguins dans le cerveau. 1 L’association GMH-IVH peut provoquer une HTP, en particulier après une hémorragie de haut grade (grades III et IV)1. L’HPH peut être traitée avec la mise en place d’un shunt ventriculopéritonéal, mais la mise en place d’un shunt n’inverse pas la lésion cérébrale qui peut survenir à partir de l’hémorragie intraveineuse. Bien que les soins intensifs néonatals modernes aient réduit les taux d’HVN2, 3, il n’existe aucun traitement spécifique pour la lésion cérébrale ou l’hydrocéphalie causée par l’hémorragie intraveineuse une fois qu’elle s’est produite. Une limitation importante dans le développement de traitements préventifs pour les lésions cérébrales induites par l’HIV et l’HPH est la compréhension incomplète de la physiopathologie de l’HVN.
Récemment, il a été démontré que les taux précoces de LCR de l’hémoglobine, produit clé de dégradation du sang, étaient associés au développement ultérieur de l’HPH chez les nouveau-nés atteints d’HVN de haut grade4. De plus, les taux de LCR de protéines de la voie de traitement du fer – hémoglobine, ferritine et bilirubine – sont associés à la taille du ventricule dans l’hémorragie intranatale néonatale. Cela a également été montré dans une cohorte multicentrique de nourrissons atteints d’HPH prématurée, où des taux de ferritine ventriculaire plus élevés dans le LCR étaient associés à une taille de ventricule plus grande5.
Dans cette étude, nous avons développé un modèle cliniquement pertinent de lésion cérébrale et d’hydrocéphalie induite par l’hémoglobine en utilisant l’injection d’hémoglobine dans les ventricules cérébraux, ce qui permet de quantifier les lésions cérébrales et l’HPH et de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques (Figure 1)6, 7. Ce modèle d’hémorragie intraveineuse utilise des ratons nouveau-nés, qui sont placés sous anesthésie générale pendant toute la durée de la procédure. Une incision médiane est pratiquée sur le cuir chevelu et les coordonnées dérivées des repères du crâne – le bregma ou lambda – sont utilisées pour cibler les ventricules latéraux pour l’injection. L’injection lente à l’aide d’une pompe à perfusion délivre de l’hémoglobine dans le ventricule. Ce protocole est facile à utiliser, polyvalent et peut modéliser différents composants de l’HIV qui aboutissent à l’HPH.

<table><tbody><tr><td>Seringue à insuline de 0,3 mL</td><td>BD Microfine + Seringue à insuline</td><td>230-4533</td><td>Les seringues de 0,3 à 0,5 mL fonctionneront</td></tr><tr><td>Microtube de 1,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>N° de lot K194642H -3 511</td></tr><tr><td>4.7T IRM Agilent</td><td>/Varian</td><td>4.7T/33 cm</td><td>Système d’IRM Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) Suture</td></tr><tr><td>monofilament 6-0</td><td>ETHICON</td><td>667G</td><td></td></tr><tr><td>9.4T IRM</td><td>Bruker</td><td>BioSpec 94/20</td><td>Utilisé dans ce protocole sans la cryosonde</td></tr><tr><td>Balance analytique</td><td>CCURIS Instruments</td><td>W3200-320</td><td></td></tr><tr><td>LCR artificiel (aCSF)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3525</td><td>N° de lot : 72A</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>301005-00</td><td>NDC 67618-150-09</td></tr><tr><td>Carprofène (injectable)</td><td>Zoetis Inc.&nbsp ;</td><td>PI 4019448</td><td>Rimadyl</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Sunbeam</td><td>E12107-819</td><td>UL 612A, Z-1228-001</td></tr><tr><td>Hémoglobine</td><td>MP Biomedicals</td><td>100714</td><td>N° DE LOT SR02321</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Vaporisateur d’isoflurane</td><td>VETEQUIP</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Lumière pour l’inturmentation stéréotaxique</td><td>Dolan-Jenner industries</td><td>Fiber-Lite MI-150</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à seringue de micro-injection</td><td>World Precision Instruments</td><td>MICRO21</td><td>Série 184034 T08K</td></tr><tr><td>Logiciel d’IRM</td><td>Bruker BioSpin</td><td>Paravision 360 3.2</td><td></td></tr><tr><td>Oxygène</td><td>Airgas Soins de santé</td><td>UN1072</td><td>NUMÉRO DE LOT</td></tr><tr><td>S1432080XA02 Rats Sprague-Dawley</td><td>Charles River Laboratories</td><td>Code de souche : 001</td><td></td></tr><tr><td>Instrument stéréotaxique</td><td>KOPF Instuments</td><td>Modèle 900LS Lazy Susan</td><td></td></tr><tr><td>Applicateur stérile à pointe de coton</td><td>Fischerbrand</td><td>23-400-118</td><td></td></tr><tr><td>Lame chirurgicale</td><td>covetrus</td><td>#10</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique triple topique</td><td>Pommade antibiotique triple</td><td>NDC 51672-2120-1</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de quantification du volume ventricule</td><td>ITK-SNAP</td><td>ITK-SNAP 4.0.0 bêta</td><td></td></tr></tbody></table>

modélisation de l’hémorragie intraventriculaire néonatale par injection intraventriculaire d’hémoglobine

Modeling Neonatal Intraventricular Hemorrhage Through Intraventricular Injection of Hemoglobin

L’hémorragie intraventriculaire néonatale (hémorragie intraventriculaire) est une conséquence fréquente de la naissance prématurée et entraîne des lésions cérébrales, une hydrocéphalie posthémorragique (HPH) et des déficits neurologiques à vie. Bien que l’HPH puisse être traitée par des procédures temporaires et permanentes de dérivation du liquide céphalorachidien (LCR) (réservoir ventriculaire et shunt ventriculopéritonéal, respectivement), il n’existe aucune stratégie pharmacologique pour prévenir ou traiter les lésions cérébrales et l’hydrocéphalie induites par l’hémorragie intraveineuse. Des modèles animaux sont nécessaires pour mieux comprendre la physiopathologie de l’hémorragie intraveineuse et tester les traitements pharmacologiques. Bien qu’il existe des modèles d’hémorragie intranatale néonatale, ceux qui entraînent de manière fiable une hydrocéphalie sont souvent limités par la nécessité d’injections de grand volume, ce qui peut compliquer la modélisation de la pathologie ou introduire une variabilité dans le phénotype clinique observé.
Des études cliniques récentes ont impliqué l’hémoglobine et la ferritine dans l’hypertrophie ventriculaire après une hémorragie intraveineuse. Ici, nous développons un modèle animal simple qui imite le phénotype clinique de PHH en utilisant des injections intraventriculaires de petit volume de l’hémoglobine, produit de dégradation du sang. En plus d’induire de manière fiable l’élargissement ventriculaire et l’hydrocéphalie, ce modèle entraîne des lésions de la substance blanche, une inflammation et une infiltration de cellules immunitaires dans les régions périventriculaires et de la substance blanche. Cet article décrit cette méthode simple et cliniquement pertinente pour modéliser l’HPH-IV chez les rats néonatals par injection intraventriculaire et présente des méthodes pour quantifier la taille du ventricule après l’injection.

Le succès de l’injection a été confirmé par des moyens radiologiques et immunohistochimiques. Les animaux ayant reçu une injection d’hémoglobine ont développé une ventriculomégalie aiguë modérée lors de l’évaluation par IRM (figure 2A), avec des ventricules latéraux significativement plus grands à 24 h et 72 h après l’injection d’hémoglobine par rapport aux animaux injectés par aLCR (figure 2B,C). Bien qu’il n’y ait pas eu de différence signific...

Nous présentons un modèle d’hémorragie intraventriculaire néonatale utilisant des ratons qui imite la pathologie observée chez l’homme.

Modélisation de l’hémorragie intraventriculaire néonatale par injection intraventriculaire d’hémoglobine

Neonatal intraventricular hemorrhage (IVH) is a common consequence of premature birth and leads to brain injury, posthemorrhagic hydrocephalus (PHH), and ...

Ce protocole est important car nous développons un modèle cliniquement pertinent de lésion cérébrale et d’hydrocéphalie induite par l’hémorragie IVH, en utilisant l’injection d’hémoglobine dans les ventricules, ce qui permet de quantifier ultérieurement les volumes ventriculaires dans l’application, pour tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’étude de la pathologie de l’hémorragie intraveineuse qui est spécifiquement médiée par l’hémoglobine et les produits de dégradation du sang de la voie ferrique. Cette technique est également facile à utiliser et polyvalente.Les implications de cette technique s’étendent au développement de thérapies pour l’hydrocéphalie post-hémorragique, car elle permet une meilleure compréhension de la physiopathologie de l’HIV et l’évaluation de stratégies de traitement cliniquement pertinentes pour la prévention des séquelles neurologiques après une hémorragie intraveineuse. La procédure sera présentée par Sruthi Ramagiri, post-doctorant associé du laboratoire australien. Pour commencer, placez le rat anesthésié couché dans l’appareil stéréotaxique avec son nez positionné dans l’adaptateur d’anesthésie.Fixez ensuite la tête en serrant les barres auriculaires anti-rupture sur le méat auditif externe. Pour nettoyer la tête, touchez d’abord un applicateur à pointe de coton stérile imbibé de Betadine au centre de la tête et déplacez-vous vers l’extérieur pour étaler la Betadine en cercles. Répétez ensuite le processus avec un applicateur imbibé d’éthanol à 70%.Ensuite, à l’aide d’un scalpel, faites une incision de 0,3 centimètre verticalement au centre de la tête pour exposer le bregma du crâne. Séchez ensuite la zone à l’aide d’un applicateur à pointe de coton. Pour configurer l’injecteur stéréotaxique, aspirez la solution d’hémoglobine préalablement préparée dans une seringue de 0,3 ou 0,5 millilitre et placez la seringue dans le système d’injection stéréotaxique.Ensuite, allumez l’interface de l’injecteur stéréotaxique et cliquez sur le bouton de configuration pour entrer le volume d’injection et les paramètres de débit. Cliquez sur le volume et réglez le volume à 20 000 nanolitres. Cliquez ensuite sur débit de perfusion et réglez le débit à 8 000 nanolitres par minute.Cliquez sur le bouton de réinitialisation de la position pour quitter la configuration. Rincez l’extrémité de l’aiguille en cliquant sur le bouton d’infusion jusqu’à ce qu’un petit cordon d’hémoglobine apparaisse à l’extrémité de l’aiguille, puis utilisez un applicateur à embout de coton pour retirer délicatement la perle. Pour commencer l’injection animale, réglez le bregma sur zéro sur le système d’injection stéréotaxique en ajustant les positions médiolatérale et antéropostérieure de la seringue.Ensuite, abaissez l’aiguille de la seringue pour toucher doucement le crâne au niveau du bregma. Après avoir identifié les coordonnées de votre choix, soulevez l’aiguille de la seringue d’un centimètre au-dessus du crâne pour dégager le cuir chevelu. Définissez les coordonnées médiolatérales et antéropostérieures.Ensuite, abaissez la seringue pour que l’aiguille touche doucement le crâne et réglez la coordonnée dorso-ventrale sur 30 secondes. Une fois les coordonnées définies, commencez l’injection en cliquant sur le bouton Exécuter de l’interface de l’injecteur stéréotaxique. Une fois l’injection terminée, laissez l’aiguille en place pendant deux minutes pour minimiser le reflux de la solution.Ensuite, retirez lentement la seringue le long de la coordonnée dorso-ventrale pendant deux minutes, jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille soit à deux centimètres au-dessus du cuir chevelu. Ensuite, tournez le bras de l’injecteur stéréotaxique loin du champ opératoire et fermez le cuir chevelu avec une suture monofilament 6-O. Pour l’IRM, effectuez une imagerie pondérée T2 en sélectionnant une séquence d’écho de spin rapide pondérée T2.Après avoir défini les paramètres IRM comme décrit dans le texte, cliquez sur le bouton Continuer pour démarrer la séquence. Pour le traitement d’images et l’analyse du volume cérébral, ouvrez les données natives pondérées T2 dans le logiciel de segmentation. Pour délimiter manuellement les ventricules latéraux, cliquez sur le mode pinceau et sélectionnez le style de pinceau carré, puis ajustez la taille du pinceau à un.Ensuite, cliquez sur Inspecteur de mise en page, sélectionnez Vue axiale et cliquez sur Zoom pour l’ajuster. Ensuite, placez le curseur sur l’image et tracez et remplissez l’espace ventricile latéral. Enfin, cliquez sur segmentation dans la barre d’outils, suivi du volume et des statistiques pour afficher les volumes segmentés.Les animaux qui ont subi une injection d’hémoglobine ont développé une ventriculomégalie modérée lorsqu’ils ont été évalués par IRM. Avec des ventricules latéraux significativement plus grands à 24 heures et 72 heures après l’injection d’hémoglobine, par rapport aux animaux injectés par ACSF. Bien que la différence de volume ventriculaire latéral entre les deux groupes de rats n’était pas significative après 38 jours, les IRM ont démontré que 44% des rats recevant de l’hémoglobine avaient encore une ventriculomégalie non résolue.De plus, par rapport à l’ACSF, l’injection d’hémoglobine a entraîné une diminution significative du volume de substance blanche après 38 jours. L’hémoglobine a également favorisé une réponse inflammatoire in vivo, comme en témoigne le niveau significativement plus élevé du facteur de nécrose tumorale pro-inflammatoire cytokine alpha après injection d’hémoglobine, mais pas de solution saline ou de sang total. De plus, la coloration immunohistochimique de la protéine acide fibrillaire gliale a révélé une activation significativement plus élevée des astrocytes après injection d’hémoglobine qu’après injection d’ACSF.La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure est de définir les coordonnées d’injection correctes pour assurer l’administration de l’hémoglobine dans les ventricules latéraux. À la suite de cette procédure, des traceurs de LCR peuvent être livrés dans l’espace du LCR pour évaluer les changements dans la circulation du LCR et les modèles d’efflux après l’hémorragie intraveineuse. Cette méthode supplémentaire traite de la façon dont le flux de LCR est modifié dans l’HPH IVH.

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Le modèle d'injection de sang autologue d'hémorragie intracérébrale chez la souris décrites dans ce protocole utilise la technique de double injection pour minimiser le risque de reflux du sang jusqu'à la piste d'aiguille, pas d'anticoagulants dans le système de pompage, et élimine tous les espaces morts et tuyaux extensibles dans le système.

Injection de sang autologue au modèle spontané Hémorragie intracérébrale chez la souris

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Hémorragie intracérébrale chez la souris Modélisation: L&#39;injection de sang autologue ou collagénase bactérienne

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Des modèles précliniques d’hémorragie intracérébrale sont utilisés pour imiter certains aspects de la maladie clinique. Ainsi, les mécanismes de lésion et les stratégies thérapeutiques potentielles peuvent être explorés. Dans ce protocole, deux modèles d’hémorragie intracérébrale sont décrits, les injections intrastriatales (ganglions de la base) de sang autologue ou de collagénase.

Injection intrastriatale de sang autologue ou Clostridium collagénase comme modèles murins de Hémorragie intracérébrale

Les modèles animaux de la maladie pédiatrique peuvent éprouver précoce et la progression de la maladie agressive. Cliniquement l'administration du traitement pertinent de jeunes modèles de souris peut être techniquement difficile. Ce protocole décrit une méthode d'injection intraveineuse non-invasive pour les souris nouveau-nés dans les deux premiers jours après la naissance de la vie.

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Modélisation de l’hémorragie intraventriculaire néonatale par injection intraventriculaire d’hémoglobine

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