Modélisation de l’hémorragie intraventriculaire néonatale par injection intraventriculaire d’hémoglobine

Ce protocole est important car nous développons un modèle cliniquement pertinent de lésion cérébrale et d’hydrocéphalie induite par l’hémorragie IVH, en utilisant l’injection d’hémoglobine dans les ventricules, ce qui permet de quantifier ultérieurement les volumes ventriculaires dans l’application, pour tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’étude de la pathologie de l’hémorragie intraveineuse qui est spécifiquement médiée par l’hémoglobine et les produits de dégradation du sang de la voie ferrique. Cette technique est également facile à utiliser et polyvalente.

Les implications de cette technique s’étendent au développement de thérapies pour l’hydrocéphalie post-hémorragique, car elle permet une meilleure compréhension de la physiopathologie de l’HIV et l’évaluation de stratégies de traitement cliniquement pertinentes pour la prévention des séquelles neurologiques après une hémorragie intraveineuse. La procédure sera présentée par Sruthi Ramagiri, post-doctorant associé du laboratoire australien. Pour commencer, placez le rat anesthésié couché dans l’appareil stéréotaxique avec son nez positionné dans l’adaptateur d’anesthésie.

Fixez ensuite la tête en serrant les barres auriculaires anti-rupture sur le méat auditif externe. Pour nettoyer la tête, touchez d’abord un applicateur à pointe de coton stérile imbibé de Betadine au centre de la tête et déplacez-vous vers l’extérieur pour étaler la Betadine en cercles. Répétez ensuite le processus avec un applicateur imbibé d’éthanol à 70%.

Ensuite, à l’aide d’un scalpel, faites une incision de 0,3 centimètre verticalement au centre de la tête pour exposer le bregma du crâne. Séchez ensuite la zone à l’aide d’un applicateur à pointe de coton. Pour configurer l’injecteur stéréotaxique, aspirez la solution d’hémoglobine préalablement préparée dans une seringue de 0,3 ou 0,5 millilitre et placez la seringue dans le système d’injection stéréotaxique.

Ensuite, allumez l’interface de l’injecteur stéréotaxique et cliquez sur le bouton de configuration pour entrer le volume d’injection et les paramètres de débit. Cliquez sur le volume et réglez le volume à 20 000 nanolitres. Cliquez ensuite sur débit de perfusion et réglez le débit à 8 000 nanolitres par minute.

Cliquez sur le bouton de réinitialisation de la position pour quitter la configuration. Rincez l’extrémité de l’aiguille en cliquant sur le bouton d’infusion jusqu’à ce qu’un petit cordon d’hémoglobine apparaisse à l’extrémité de l’aiguille, puis utilisez un applicateur à embout de coton pour retirer délicatement la perle. Pour commencer l’injection animale, réglez le bregma sur zéro sur le système d’injection stéréotaxique en ajustant les positions médiolatérale et antéropostérieure de la seringue.

Ensuite, abaissez l’aiguille de la seringue pour toucher doucement le crâne au niveau du bregma. Après avoir identifié les coordonnées de votre choix, soulevez l’aiguille de la seringue d’un centimètre au-dessus du crâne pour dégager le cuir chevelu. Définissez les coordonnées médiolatérales et antéropostérieures.

Ensuite, abaissez la seringue pour que l’aiguille touche doucement le crâne et réglez la coordonnée dorso-ventrale sur 30 secondes. Une fois les coordonnées définies, commencez l’injection en cliquant sur le bouton Exécuter de l’interface de l’injecteur stéréotaxique. Une fois l’injection terminée, laissez l’aiguille en place pendant deux minutes pour minimiser le reflux de la solution.

Ensuite, retirez lentement la seringue le long de la coordonnée dorso-ventrale pendant deux minutes, jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille soit à deux centimètres au-dessus du cuir chevelu. Ensuite, tournez le bras de l’injecteur stéréotaxique loin du champ opératoire et fermez le cuir chevelu avec une suture monofilament 6-O. Pour l’IRM, effectuez une imagerie pondérée T2 en sélectionnant une séquence d’écho de spin rapide pondérée T2.

Après avoir défini les paramètres IRM comme décrit dans le texte, cliquez sur le bouton Continuer pour démarrer la séquence. Pour le traitement d’images et l’analyse du volume cérébral, ouvrez les données natives pondérées T2 dans le logiciel de segmentation. Pour délimiter manuellement les ventricules latéraux, cliquez sur le mode pinceau et sélectionnez le style de pinceau carré, puis ajustez la taille du pinceau à un.

Ensuite, cliquez sur Inspecteur de mise en page, sélectionnez Vue axiale et cliquez sur Zoom pour l’ajuster. Ensuite, placez le curseur sur l’image et tracez et remplissez l’espace ventricile latéral. Enfin, cliquez sur segmentation dans la barre d’outils, suivi du volume et des statistiques pour afficher les volumes segmentés.

Les animaux qui ont subi une injection d’hémoglobine ont développé une ventriculomégalie modérée lorsqu’ils ont été évalués par IRM. Avec des ventricules latéraux significativement plus grands à 24 heures et 72 heures après l’injection d’hémoglobine, par rapport aux animaux injectés par ACSF. Bien que la différence de volume ventriculaire latéral entre les deux groupes de rats n’était pas significative après 38 jours, les IRM ont démontré que 44% des rats recevant de l’hémoglobine avaient encore une ventriculomégalie non résolue.

De plus, par rapport à l’ACSF, l’injection d’hémoglobine a entraîné une diminution significative du volume de substance blanche après 38 jours. L’hémoglobine a également favorisé une réponse inflammatoire in vivo, comme en témoigne le niveau significativement plus élevé du facteur de nécrose tumorale pro-inflammatoire cytokine alpha après injection d’hémoglobine, mais pas de solution saline ou de sang total. De plus, la coloration immunohistochimique de la protéine acide fibrillaire gliale a révélé une activation significativement plus élevée des astrocytes après injection d’hémoglobine qu’après injection d’ACSF.

La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure est de définir les coordonnées d’injection correctes pour assurer l’administration de l’hémoglobine dans les ventricules latéraux. À la suite de cette procédure, des traceurs de LCR peuvent être livrés dans l’espace du LCR pour évaluer les changements dans la circulation du LCR et les modèles d’efflux après l’hémorragie intraveineuse. Cette méthode supplémentaire traite de la façon dont le flux de LCR est modifié dans l’HPH IVH.