Culture, congélation, traitement et imagerie d’organoïdes et de sphéroïdes entiers alors qu’ils sont encore dans un hydrogel

Les organoïdes et les sphéroïdes, étant très fragiles, sont gravement endommagés lors de la manipulation. Notre protocole garantit que ces structures de culture 3D restent intactes au cours de divers processus, augmentant ainsi la précision, la reproductibilité, la fiabilité et la répétabilité. Le chercheur peut cultiver, congeler, décongeler, traiter, colorer, étiqueter et examiner des organoïdes et des sphéroïdes entiers sous divers microscopes alors qu’ils restent intacts dans un hydrogel dans un seul appareil polyvalent.

Il permet la création d’un modèle de maladie et le suivi des étapes séquentielles dans un dispositif polyvalent. La technologie apporte plus de précision lors de l’examen des biomarqueurs pour le diagnostic et le pronostic des maladies. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel système de culture 3D, y compris les organoïdes, les sphéroïdes, les cellules individuelles ou les organismes vivants.

Pour commencer la culture organoïde ou sphéroïde, placez l’hydrogel correctement décongelé sur de la glace à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire pendant 15 minutes. Gardez également le tube contenant une pastille du carcinome hépatocellulaire, ou cellules HEPG2, sur de la glace. Ensuite, plaquez 30 à 35 microlitres d’hydrogel à 100% dans la niche du dispositif polyvalent préchauffé pour créer une goutte de gel, placez 10 000 cellules HEPG2 au centre du haut de la goutte d’hydrogel et incuber l’installation à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Après l’incubation, couvrir la goutte d’hydrogel avec 200 microlitres de milieu aigle modifié de Dulbecco, ou DMEM, contenant 10% de sérum bovin fœtal, ou FBS. Placez le couvercle sur l’appareil correctement, permettant le flux de gaz, avant de le placer dans l’incubateur. Tous les deux jours, alimentez les cellules avec 200 microlitres de DMEM contenant 10% FBS.

Vérifiez la croissance des sphéroïdes sous un microscope inversé. Avant de commencer le marquage par immunofluorescence des organoïdes, réchauffez les milieux et les solutions nécessaires à 37 degrés Celsius. Aspirez le milieu de culture cellulaire entourant la goutte d’hydrogel avant d’ajouter 200 microlitres de paraformaldéhyde à 4% préchauffé à 37 degrés Celsius et fixez-le en le plaçant dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes.

Ensuite, aspirez le fixateur et lavez la solution pour le marquage par immunofluorescence, ou SIF, préchauffée à 37 degrés Celsius trois fois pendant 10 minutes chacune. Ajoutez de l’eau distillée à la zone entourant la niche pour fournir de l’humidité avant de passer aux étapes suivantes. Aspirez le SIF entourant la goutte d’hydrogel et ajoutez 100 microlitres de la solution d’anticorps primaires préchauffée dans le SIF à l’hydrogel avant de l’incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes.

Ensuite, aspirez la solution d’anticorps primaire et lavez avec SIF préchauffé à 37 degrés Celsius trois fois pendant 10 minutes chacun. Après le lavage, aspirer le SIF restant et ajouter 100 microlitres de la solution d’anticorps secondaires préchauffée dans le SIF à l’hydrogel. Incuber l’hydrogel à 37 degrés Celsius dans l’obscurité pendant 30 à 60 minutes.

Après l’incubation, aspirez la solution d’anticorps secondaire et lavez la goutte d’hydrogel avec du PBS à 37 degrés Celsius trois fois dans l’obscurité pendant 10 minutes chacune. Ensuite, aspirez le PBS résiduel et incuber l’hydrogel avec 100 microlitres de coloration d’ADN nucléaire contenant un milieu de montage ou du glycérol à 37 degrés Celsius dans l’obscurité. Remplissez la niche avec du glycérol pour éviter le séchage avant de fermer hermétiquement l’appareil polyvalent contenant l’hydrogel.

Pour examiner les organoïdes par microscopie confocale, réglez les paramètres du microscope en suivant les instructions données dans le manuscrit. Pour congeler les organoïdes, aspirer le milieu de culture cellulaire, ajouter 200 microlitres de la solution de congélation préchauffée et incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant une heure. Fermez bien le couvercle de l’appareil avant de le placer dans une boîte en mousse.

Placez cette boîte en mousse dans une autre boîte en mousse et fermez hermétiquement les deux boîtes en mousse. Conservez la boîte à moins 20 degrés Celsius pendant deux heures, puis laissez-la toute la nuit dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Pour conserver les organoïdes pendant plus de six mois, retirez le dispositif polyvalent contenant les organoïdes des boîtes et transférez-le dans le réservoir d’azote liquide.

Pour décongeler les organoïdes, sortez l’appareil polyvalent contenant l’échantillon du congélateur ou du réservoir d’azote liquide et placez-le directement dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Une fois décongelé, aspirer doucement le mélange de milieu et de solution de congélation avant d’ajouter le milieu frais et de procéder à l’imagerie de l’hydrogel organoïde à montage entier. En imagerie en direct, les organoïdes en croissance à l’intérieur de l’hydrogel sont devenus visibles trois à cinq jours après l’insertion de la pastille cellulaire, en particulier à la périphérie du dôme d’hydrogel.

La série chronologique d’images à différents niveaux d’un hydrogel contenant des sphéroïdes sous un microscope à contraste de phase inversé est montrée ici. Les images de microscopie confocale des organoïdes vivants entiers après coloration vivante de la membrane cellulaire et du noyau ont montré une densité de marquage similaire à la périphérie et au centre. En outre, le marquage par immunofluorescence des stéroïdes à montage entier pourrait être effectué avec succès avec un anticorps, deux anticorps et trois anticorps, éliminant ainsi tout besoin d’étapes de traitement supplémentaires.

L’analyse représentative démontre deux organoïdes des voies respiratoires marqués par immunofluorescence dans un dispositif. Les images MEB des sphéroïdes entiers dans le dispositif polyvalent et 10 images de stéroïdes sectionnés ont indiqué une architecture 3D bien préservée de sphéroïdes, d’organites cytoplasmiques et d’autres caractéristiques cellulaires ultra-structurelles, démontrant l’efficacité du protocole décrit. Une irrégularité aux limites du dôme d’hydrogel était évidente après la congélation des échantillons.

Cependant, la taille et la rondeur des sphéroïdes sont restées similaires. La migration cellulaire sur la surface de culture a été observée après la décongélation des échantillons congelés. La technique est très simple.

Cependant, le chercheur doit être très doux lors de l’aspiration ou de l’ajout de liquides entourant la goutte d’hydrogel pour éviter d’endommager l’échantillon. Le chercheur peut examiner le même échantillon dans un seul appareil à l’aide d’un microscope de haute technologie et mener une étude corrélative.