Name: Culture, congélation, traitement et imagerie d’organoïdes et de sphéroïdes entiers alors qu’ils sont encore dans un hydrogel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Découvrez une méthode complète de culture, congélation et imagerie d'organoïdes et de sphéroïdes entiers dans un hydrogel à l'aide d'un dispositif polyvalent. Cette technique préserve l'intégrité structurale des échantillons 3D pour une analyse fiable des biomarqueurs.

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Nous remercions Dale Mertes de l’Université de Chicago pour la préparation des diagrammes, le Dr Mehmet Serif Aydin pour son soutien technique à l’Institut de recherche en sciences et technologies de la santé de l’Université Medipol d’Istanbul, et le Dr Rana Kazemi de l’Université Maltepe pour l’édition du manuscrit.

1. Culture d’organoïdes et de sphéroïdes
<ol><li>Placez l’hydrogel sur de la glace pendant la nuit (dans un réfrigérateur ou une chambre froide) pour le décongeler.</li>
	<li>Placer l’appareil polyvalent disponible dans le commerce (DM; voir le tableau des matériaux) dans l’incubateur 1 jour avant l’expérience (37 °C, 5% CO2) pour le réchauffer.</li>
	<li>Placer les pointes de pipettes larges stériles au réfrigérateur à 4 °C. REMARQUE : Les étapes 1.1 à 1.3 doivent être effectuées le jour 0 et les étapes 1.4 à 1.11 doivent être effectuées le jour 1.</li>
	<li>Placez l’hydrogel sur de la glace dans une hotte à écoulement laminaire pendant 15 min.<ol><li>Facultatif : Diluer l’hydrogel dans un milieu de culture cellulaire froid conformément aux recommandations du fabricant.</li>
	</ol></li>
	<li>Placer le tube contenant une pastille de cellules HepG2 (lignée cellulaire de carcinome hépatocellulaire obtenue commercialement; voir le tableau des matériaux) sur de la glace.</li>
	<li>Plaque 30-35 μL d’hydrogel 100% dans la niche de l’appareil préchauffé pour créer une goutte de gel.</li>
	<li>Placer 10 000 cellules HepG2 au milieu du haut de chaque goutte d’hydrogel (Figure 2) et incuber pendant 15 min à 37 °C.</li>
	<li>Couvrir la goutte d’hydrogel avec 200 μL de milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10% de sérum bovin fœtal.</li>
	<li>Couvrez le couvercle du MD dans la bonne position pour permettre l’écoulement du gaz et placez l’appareil dans l’incubateur.</li>
	<li>Alimentez les cellules avec 200 μL de DMEM avec 10% FBS tous les deux jours.</li>
	<li>Vérifiez la croissance des sphéroïdes au microscope inversé (Figure 3). La formation sphéroïde commence après le3ème jour. La vidéo 1 montre l’emplacement des sphéroïdes à différents niveaux dans un dôme d’hydrogel. NOTES: Il est fortement recommandé d’aspirer doucement le liquide entourant l’hydrogel et d’ajouter lentement le nouveau liquide à l’environnement pour éviter d’endommager les gouttes d’hydrogel.</li>
</ol>2. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine d’organoïdes/sphéroïdes entiers dans un hydrogel
<ol><li>Réchauffer le fixateur (4% de paraformaldéhyde; PFA), PBS et hématoxyline (voir le tableau des matières) jusqu’à 37 °C.</li>
	<li>Aspirer le milieu entourant la goutte d’hydrogel avec une pipette, ajouter 100-200 μL de PFA à 4% à fixer, et incuber pendant 15-20 min à 37 °C.</li>
	<li>Aspirer le PFA à 4 % et ajouter 200 μL de PBS pour laver 3x pendant 5 min chacun à 37 °C. Ensuite, aspirer le PBS et incuber avec 200 μL de solution d’hématoxyline pendant 15-20 min à 37 °C.</li>
	<li>Aspirer l’hématoxyline et ajouter 200 μL dedH2Opour laver 3x pendant 10 min chacun à 37 °C. Aspirer ledH2Oet incuber avec 200 μL d’éthanol pendant 5-10 min à 37 °C.</li>
	<li>Aspirer l’éthanol et incuber avec 200 μL d’éosine (voir tableau des matériaux) pendant 10 min à 37 °C. Aspirer l’éosine et ajouter 200 μL dedH2Opour laver pendant 5 min à température ambiante (RT).</li>
	<li>Aspirer ledH2Oet ajouter 100 μL de glycérol pour couvrir la goutte d’hydrogel comme support de montage.</li>
	<li>Facultatif : Montez la niche avec un couvercle. Cette étape peut être omise pour éviter de presser des organoïdes / sphéroïdes de taille considérable.</li>
	<li>Fermez fermement le couvercle de MD pour éviter le séchage jusqu’à l’examen. L’échantillon est stable pour examen pendant au moins 6 mois.</li>
</ol>3. Immunohistochimie d’organoïdes/sphéroïdes entiers dans un hydrogel
<ol><li>Réchauffer la solution commercialement obtenue pour l’immunohistochimie (S-IHC; voir le tableau des matériaux) à 37 °C.</li>
	<li>Incuber les organoïdes ou sphéroïdes dans l’hydrogel avec 3% de peroxyde d’hydrogène (H2O2) dans 200 μL dedH2O pendant 5 min à 37 °C.</li>
	<li>Aspirer la solution de peroxyde d’hydrogène et laver endH2Opendant 5 min à 37 °C. Aspirer ledH2Oet incuber deux fois avec 100 μL de S-IHC à 37 °C pendant 10 min chacun.</li>
	<li>Aspirer le S-IHC et incuber avec 100 μL d’anticorps primaire (voir le tableau des matériaux) dilué dans du S-IHC pendant 1-2 h à 37 °C (en suivant les recommandations du fabricant concernant la dilution de travail).</li>
	<li>Aspirer la solution d’anticorps primaires et incuber avec 100 μL de S-IHC 3x pendant 5 min chacun à 37 °C.</li>
	<li>Aspirer 100 μL de S-IHC et incuber avec un anticorps secondaire biotinylé (voir le tableau des matières) pendant 10 min à 37 °C.</li>
	<li>Aspirer la solution d’anticorps secondaires et incuber avec 100 μL de S-IHC 3x pendant 5 min chacun à 37 °C. Aspirer le S-IHC et incuber avec 100 μL de streptavidine marquée peroxydase de raifort (HRP) (voir le tableau des matériaux) pendant 10 min à 37 °C.</li>
	<li>Aspirer la streptavidine marquée HRP et incuber avec 100 μL de S-IHC 3x pendant 5 min chacun à 37 °C.</li>
	<li>Aspirer le S-IHC et incuber avec 100 μL de mélange de solution chromogène DAB/AEC (voir le tableau des matières) pendant 5-10 min à 37 °C.</li>
	<li>Surveillez l’intensité de la coloration au microscope optique.</li>
	<li>Laver avecdH2O3x pendant 2 min chacun.</li>
	<li>Facultatif : Incuber avec 100 μL d’hématoxyline (voir le tableau des matières) pour la contre-coloration nucléaire pendant 5 min à 37 °C.</li>
	<li>Aspirer l’hématoxyline et laver endH2Opendant 5 min.</li>
	<li>Aspirer ledH2Oet couvrir la goutte d’hydrogel avec 100 μL de glycérol comme support de montage.</li>
	<li>Fermez fermement le couvercle du MD jusqu’à l’examen microscopique. NOTES: Les étapes de récupération d’antigènes et de blocage des protéines sont omises dans ce protocole puisque S-IHC élimine ces étapes.</li>
</ol>4. Marquage par immunofluorescence d’organoïdes/sphéroïdes entiers dans un hydrogel
<ol><li>Réchauffer les matières suivantes à 37 °C : PFA à 4 %, PBS, S-IF, solution d’anticorps primaires dans S-IF, solution d’anticorps secondaires dans S-IF, coloration nucléaire et glycérol (voir le tableau des matières).</li>
	<li>Aspirer le milieu de culture cellulaire et fixer avec 200 μL de PFA à 4% pendant 15-30 min à 37 °C. Aspirer le fixateur et laver en S-IF 3x pendant 10 min chacun à 37 °C.</li>
	<li>Ajouter dH2O sur le côté entourant la niche pour fournir de l’humidité pendant les étapes suivantes.</li>
	<li>Aspirer le S-IF entourant la goutte d’hydrogel et incuber la goutte d’hydrogel avec 100 μL de solution d’anticorps primaires (voir le tableau des matériaux) dans du S-IF pendant 30-60 minutes à 37 °C.</li>
	<li>Aspirer la solution d’anticorps primaire et laver en S-IF 3x pendant 10 min chacun à 37 °C.</li>
	<li>Aspirer le S-IF et incuber avec 100 μL de solution d’anticorps secondaires (voir Tableau des matériaux) dans S-IF pendant 30-60 min à 37 °C dans l’obscurité.</li>
	<li>Aspirer la solution d’anticorps secondaires et laver avec du PBS 3x pendant 10 min chacun à 37 °C dans l’obscurité.</li>
	<li>Aspirer le PBS et incuber avec 100 μL de coloration d’ADN nucléaire contenant un milieu de montage ou du glycérol à 37 °C dans l’obscurité.</li>
	<li>Remplissez la niche avec du glycérol pour éviter le dessèchement.</li>
	<li>Facultatif : Couvrez la niche avec un bordereau de couverture. Cette étape peut être omise pour éviter de presser les organoïdes/sphéroïdes.</li>
	<li>Fermez bien le MD. Les échantillons en DM peuvent être conservés à 4 °C dans l’obscurité pendant au moins 6 mois avec une perte minimale de fluorescence.</li>
	<li>Utilisez les paramètres suivants pour l’examen microscopique confocal : réglez la valeur du sténopé de tous les canaux sur 20,1, maintenez la constante du gain maître à 550 pour 488 nm, 485 pour 550 nm et 450 pour 594 nm, maintenez la puissance laser constante pour toutes les expériences et le pourcentage le plus bas à 2,0. NOTES: Anticorps primaires: Anti-Na-K ATPase (1:100), Anti-Arginase (1:50), Anti-Albumine (1:50), Anti-Bêta-galactosidase (1:25), Anticorps antimitochondrial (1:100), Anti-Golgi Antibody (1:50), Anti-Cytokeratin 5 (1:100), Ov6 anticorps (1:100). Anticorps secondaires : IgG (H+L)-488 de chèvre, IgG (H+L)-550 de chèvre anti-lapin, IgG (H+L)-488 de chèvre anti-souris, IgG (H+L)-550 de chèvre, IgY(H+L)-647 de chèvre. La dilution pour tous les anticorps secondaires est de 1:100. De plus, la FITC-phalloïdine (1:100), un anticorps conjugué, est également utilisée (voir le tableau des matières).</li>
</ol>5. Marquage de la membrane plasmique et du noyau d’organoïdes vivants et de sphéroïdes dans un hydrogel
<ol><li>Préparer une solution d’étiquetage contenant de l’agglutinine de germe de blé fluor Alexa (5,0 μg/mL) et Hoechst (2 μM) dans la solution saline équilibrée de Hank (HBSS), conformément aux recommandations du fabricant (voir le tableau des matériaux), et chauffer à 37 °C.</li>
	<li>Aspirer le milieu de culture cellulaire et ajouter 100 μL de solution de marquage pour couvrir la goutte d’hydrogel. Incuber pendant 15-30 min à 37 °C.</li>
	<li>Retirer la solution d’étiquetage et laver deux fois dans du PBS 2x pendant 10 min chacun à 37 °C. Facultatif : Fixer avec 200 μL de formaldéhyde à 4 % pendant 15 min à 37 °C.</li>
	<li>Couvrir la goutte d’hydrogel avec du glycérol comme support de montage. Facultatif : Montez la niche avec un verre de couverture.</li>
	<li>Fermez hermétiquement le couvercle du MD et conservez-le au réfrigérateur dans l’obscurité jusqu’à l’examen microscopique confocale/fluorescent. Il est stable pendant au moins 6 mois.</li>
</ol>6. Congélation et décongélation d’organoïdes/sphéroïdes entiers dans un hydrogel
<ol><li>Congelez les organoïdes en suivant les étapes ci-dessous.<ol><li>Réchauffer la solution de congélation obtenue commercialement (FS; voir tableau des matières) à 37 °C.</li>
		<li>Aspirez doucement le milieu de culture cellulaire entourant le dôme d’hydrogel.</li>
		<li>Ajouter délicatement 200 μL de FS. Incuber l’échantillon avec FS à 37 °C pendant 1 h.</li>
		<li>Fermez hermétiquement le couvercle de l’appareil et placez-le dans une boîte en mousse. Placez cette boîte en mousse dans une autre boîte en mousse, comme illustré à la figure supplémentaire 3. Fermez hermétiquement les deux boîtes en mousse. Deux boîtes en mousse l’une à l’intérieur de l’autre fournissent une plage de gradient de refroidissement de température de 1 à 2 ° C / min de l’échantillon dans un congélateur de -20 ° C.</li>
		<li>Placez la boîte à -20 °C pendant 2 h. Transférer la boîte dans un congélateur à -80 °C et la laisser toute la nuit.</li>
		<li>Sortez l’échantillon des boîtes. L’échantillon dans le MD peut être conservé dans le congélateur à -80 °C pendant 6 mois.</li>
		<li>Transférer le DM qui contient l’échantillon dans le réservoir d’azote liquide pour un stockage à plus long terme.</li>
	</ol></li>
	<li>Décongeler les organoïdes en suivant les étapes ci-dessous.<ol><li>Sortez le MD contenant l’échantillon du congélateur/réservoir d’azote et placez-le directement dans un incubateur à 37 °C. Incuber pendant 1 h à 37 °C.</li>
		<li>Ajouter 200 μL de milieu de culture chaud à la niche (le rapport FS/milieu de culture cellulaire est de 1:1) et incuber pendant 30 min à 37 °C.</li>
		<li>Ajouter plus de milieu de culture chaud à la niche (le rapport FS/milieu de culture cellulaire est de 1:2) et incuber pendant 30 min à 37 °C.</li>
		<li>Aspirer doucement le milieu et le mélange FS. Procéder à l’imagerie par microscopie électronique à balayage (étape 7) et par microscopie électronique à transmission (étape 8) des organoïdes/sphéroïdes montés sur l’ensemble dans l’hydrogel.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Microscopie électronique à balayage d’organoïdes/sphéroïdes entiers
<ol><li>Réchauffez la solution fixatrice et post-fixative de Karnovsky (voir le tableau des matériaux) à température ambiante (RT).</li>
	<li>Aspirer le milieu de culture cellulaire entourant l’hydrogel dans le MD. Placer l’échantillon dans le MD sur de la glace dans la hotte à flux laminaire pendant 15 min.</li>
	<li>Aspirez très doucement l’hydrogel liquéfié entourant les organoïdes/sphéroïdes. Une quantité limitée de matrigel peut rester dans la niche pour éviter d’endommager et de perdre l’échantillon.</li>
	<li>Fixer avec le fixateur de Karnovsky (PFA à 2 %, 2,5 % de glutaraldéhyde dans un tampon cacodylate 0,15 M et 2 mM de CaCl2; voir le tableau des matériaux) à TA pendant 1 h.</li>
	<li>Aspirer doucement le fixateur et laver à l’eau distillée (dH2O) 3x pendant 15 min chacun.</li>
	<li>Aspirer doucement ledH2Oet fixer avec une solution post-fixatrice (tétroxyde d’osmium aqueux à 1 % [OsO4]; voir tableau des matériaux) à TA pendant 1 h.</li>
	<li>Aspirer doucement le post-fixateur et laver à l’eau distillée (dH2O) 3x pendant 15 min chacun.</li>
	<li>Déshydrater dans une série graduée d’éthanol (30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 96 %, 100 %), mélange d’éthanol/acétone (1:1; 1:2) et d’acétone absolue à TA pendant 15 minutes chacun.</li>
	<li>Sécher avec un séchoir à point critique.</li>
	<li>Enduire l’échantillon de l’appareil avec de l’or/palladium de 6 nm à l’aide d’une pulvérisation (voir le tableau des matériaux) pendant 90 s.</li>
	<li>Observer au microscope électronique à balayage avec un détecteur d’électrons secondaire intégré à la lentille à 2-3 kV en mode vide (5 x 10-6 mA). Prenez des images avec une distance de travail de 8,1 à 8,2 mm et à des grossissements de 675x, 1050x et 1570x. NOTES: Toutes les étapes sont effectuées dans le MD. Utilisez 200-250 μL de solution pour chaque étape.</li>
</ol>8. Microscopie électronique à transmission d’organoïdes/sphéroïdes entiers dans un hydrogel
<ol><li>Réchauffer le fixateur de Karnovsky à 37 °C. Aspirer le milieu de culture cellulaire entourant l’hydrogel dans le MD.</li>
	<li>Fixez l’échantillon avec le fixateur de Karnovsky à RT pendant 1 h. Laver avec dH2O 3x pendant 15 min chacun.</li>
	<li>Post-fixation avec 2% d’OsO4 aqueux et 2,5% de ferrocyanure de potassium à TA pendant 45 min. Laver avec dH2O 3x pendant 10 min chacun.</li>
	<li>Incuber dans 0,5 % de thiocarbohydrazide (TCH; voir tableau des matières) à TA pendant 30 min. Laver avec dH2O 3x pendant 10 min chacun.</li>
	<li>Incuber dans 2% d’OsO4 aqueux à TA pendant 30 min. Laver avec dH2O 3x pendant 10 min chacun.</li>
	<li>Incuber dans une solution d’acétate d’uranyle à 2 % (voir tableau des matières) à TA pendant 1 h. REMARQUE: Dans cette étape, les sphéroïdes peuvent être maintenus à 4 ° C pendant la nuit.</li>
	<li>Incuber dans une solution d’aspartate de plomb (voir tableau des matières) à 60 °C pendant 45 min. Laver avec dH2O 3x pendant 10 min chacun.</li>
	<li>Déshydrater dans une série graduée d’éthanol (50 %, 70 %, 90 %, 100 % [x2]) et d’acétone absolue à TA pendant 15 min chacun.</li>
	<li>Traiter avec un mélange de (1:1; 1:2) d’acétone/résine Epon et de résine Epon pure (voir tableau des matériaux) à TA pendant 2 h chacun.</li>
	<li>Polymériser la résine à 60 °C pendant une nuit (minimum 16 h). Après la polymérisation, retirer le bloc de résine du MD, comme indiqué à la figure supplémentaire 4.</li>
	<li>Fixez le bloc de résine à un plus grand avec une colle à résine. Coupez le bloc et atteignez l’emplacement des organoïdes ou des sphéroïdes.</li>
	<li>Obtenez des sections semi-minces (1 000 nm) et ultra-minces (60 nm) à l’aide d’un ultramicrotome (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Placez les sections ultra-minces sur des grilles de cuivre à 100 mailles et observez-les au microscope électronique à balayage avec un détecteur STEM à une tension d’accélération de 30 kV. Capturez des images avec une distance de travail de 44 mm et des grossissements de 2580x, 5020x et 6060x. NOTES: Utilisez 200-250 μL de solution pour chaque étape. Les étapes 8.1 à 8.10 sont effectuées dans le DM.</li>
</ol>

Ranan Gulhan Aktas est propriétaire de demandes de brevets MD, S-IHC, S-IF et FS. Olgu Enis Tok a participé au développement de ces produits. Olgu Enis Tok et Gamze Demirel sont membres de l’équipe de R&D de la société Cellorama. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut et Ozgecan Kayalar n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Le MD, complétant les formulations et les protocoles décrits ici, facilite la croissance 3D rapide et spontanée des organoïdes et des sphéroïdes dans un environnement plus contrôlé et poursuit l’expérience dans les mêmes conditions. Le spécimen reste dans le même environnement pendant tout le processus, et près de 100% des architectures de culture 3D restent intactes dans le conteneur. Cela améliore l’homogénéité pendant les expériences séquentielles et permet une période de culture prolongée. En outre, le nombre d’étape...

L’avenir de la recherche et de la thérapie cellulaires réside dans les cultures cellulaires 3D 1,2,3. Les modèles organoïdes et sphéroïdes comblent l’écart entre les expériences in vitro et les modèles animaux en créant de meilleurs modèles qui imitent le développement du corps humain, la physiologie et les maladies 4,5,6,7,8,9. Cependant, la reproductibilité et la répétabilité de ces modèles restent difficiles. De plus, la manipulation, la récolte, le transfert et la centrifugation de ces structures avec les technologies actuelles entraînent la perte ou l’endommagement des organoïdes et des sphéroïdes dans de nombreuses conditions, ce qui affecte considérablement les résultats.

Malgré de nombreux protocoles de coloration histologique, de coloration immunohistochimique, de marquage par immunofluorescence et de cryoconservation, il n’existe pas d’approche universelle liée à la normalisation des conditions expérimentales, à la manipulation et au traitement de ces structures délicates sans les perdre ou les endommager. Les protocoles actuels sont également incroyablement longs, alternant de quelques jours à plusieurs semaines, et comprennent des procédures complexes avec divers réactifs 10,11,12,13,14. De plus, la récolte, le pipetage, la centrifugation et le transfert de structures de culture 3D entre les récipients de culture cellulaire et les cryoviales provoquent des changements dans le positionnement des structures et des forces mécaniques, et affectent finalement la différenciation et la maturation des organoïdes et des sphéroïdes. Il a été rapporté que la topologie des tissus, le positionnement des cellules et les forces mécaniques ont un impact significatif sur la différenciation et la maturation cellulaires 6,15,16,17.

Par conséquent, il est souhaitable d’améliorer les technologies conventionnelles actuelles pour générer des organoïdes et des sphéroïdes de qualité stable. Une méthode/un dispositif qui sautera la centrifugation et les autres étapes décrites ci-dessus et fournira le matériau dans un seul environnement sûr du début à la fin des multiples processus serait bénéfique pour obtenir les données les plus cohérentes et les plus fiables. De plus, cela réduira les contraintes de temps, de main-d’œuvre et de coûts.
Le dispositif polyvalent (DM) décrit ici fournit un environnement sûr unique pour de multiples processus d’organoïdes et de sphéroïdes (Figure supplémentaire 1). Ce dispositif et les protocoles complémentaires éliminent les étapes de récolte, de pipetage, de transfert et de centrifugation. Les organoïdes et les sphéroïdes restent dans leur environnement in vitro pendant les processus séquentiels. Cet environnement comprend principalement des composants naturels ou synthétiques de la matrice extracellulaire, comme les hydrogels disponibles dans le commerce. En d’autres termes, les méthodes décrites ici permettent de traiter, d’examiner et de congeler un échantillon entier d’organoïdes / sphéroïdes tout en restant dans une goutte d’hydrogel.
Le dispositif biocompatible résiste à des températures comprises entre 60 °C et -160 °C, ce qui permet de restaurer les organoïdes/stéroïdes dans un réservoir d’azote liquide à -160 °C ou de préparer des blocs de résine pour la microscopie électronique à 60 °C. La niche du dispositif a été conçue pour définir un espace limité pour les structures de croissance 3D et stimuler la formation de sphéroïdes ou d’organoïdes sur la base des études précédentes 18,19,20,21,22,23. Cette partie de l’appareil est transparente et contient un plastique spécifique qui offre une qualité optique élevée (indice de réfraction : 1,43 ; valeur abbe : 58 ; épaisseur : 7,8 mil [0,0078 in ou 198 μm]). La niche et la partie « latérale » environnante provoquent une autofluorescence. La niche transparente au centre a une surface de 80 mm 2, tandis que la partie latérale est de 600 mm2. La profondeur du conteneur est de 15 mm et l’épaisseur est de 1,5 mm. Ces caractéristiques, outre la taille et la conception de l’appareil, permettent de réaliser des observations sous différents types de microscopes de haute technologie et de préparer les échantillons pour des examens au microscope électronique (Figure 2). Le système de fermeture de l’appareil fournit deux positions, l’une scellée dans le congélateur et l’autre permettant l’écoulement du gaz dans l’incubateur. Les essais de prolifération et de cytotoxicité CCK8 démontrent des effets similaires sur les cellules par rapport aux boîtes de culture cellulaire traditionnelles (figure supplémentaire 2). Le test d’exclusion du bleu de trypan démontre une viabilité cellulaire élevée (94%) lors de la culture cellulaire dans la DM (Figure 3).
Les processus qui peuvent être effectués pour un échantillon dans le dispositif unique comprennent (1) la culture, (2) la coloration histologique, (3) l’immunomarquage, y compris le marquage immunohistochimique et immunofluorescence, (4) la congélation, (5) la décongélation, (6) l’examen au microscope optique, tel que les microscopes à fond clair, à fond noir, à fluorescence, confocaux et à superrésolution, (7) le revêtement et l’examen directement sous un microscope électronique à balayage, ou (8) la préparation à la microscopie électronique à transmission ( Graphique 2).
Différentes méthodologies existent pour la coloration histologique, le marquage immunohistochimique ou le marquage fluorescent des organoïdes et des sphéroïdes 10,11,12,13,14,24,25. Les récolter à partir de l’hydrogel est la première et principale étape de la technologie actuelle. Après cette étape, certaines méthodes permettent l’immuno-marquage à montage entier. Les organoïdes récoltés sont incorporés dans de la paraffine, sectionnés et étiquetés pour la coloration et l’immunomarquage chez les autres. Cependant, les sections peuvent ne pas présenter l’échantillon complet et ne fournir que des données limitées liées à l’architecture 3D de la structure. De plus, les dommages causés à ces structures 3D et la perte d’antigénicité sont des effets secondaires bien connus de ces technologies.
Les nouveaux protocoles complémentaires pour les examens microscopiques de cet article permettent une analyse d’échantillons entiers encore dans un hydrogel. Les protocoles décrits ici comprennent deux formulations nouvellement développées : solution pour immunohistochimie (S-IHC) et solution pour marquage par immunofluorescence (S-IF). Les méthodes avec ces solutions permettent aux chercheurs d’obtenir des données plus précises, car il n’y a pas d’effets néfastes des flux de travail traditionnels, tels que la centrifugation, le pipetage et le transfert des structures délicates. Le protocole décrit ici élimine également le besoin d’étapes de prélèvement, de blocage, de défrichage et de récupération de l’antigène, et raccourcit l’ensemble de la procédure à 6-8 heures. De plus, la méthodologie permet d’ajouter simultanément un à trois anticorps au même S-IF. Par conséquent, il est possible d’obtenir les résultats le même jour même après les multiples expériences d’étiquetage, ce qui est un autre avantage du protocole décrit ici; Les protocoles traditionnels d’étiquetage par immunofluorescence à montage entier prennent généralement entre 3 jours et plusieurs semaines 10,11,12,13,14.
L’incorporation de paraffine, une autre étape néfaste qui réduit l’antigénicité, est également omise. La structure 3D reste dans son environnement in vitro du début à la fin de l’examen microscopique. Étant donné que la structure 3D reste dans ses conditions de croissance, les données d’expression et de localisation des protéines imitent mieux les conditions in vivo . Des résultats plus précis sont attendus, car la méthodologie élimine les étapes affectant l’expression de l’antigène de l’échantillon. Les tableaux 1 et 2 montrent comment ces nouveaux protocoles éliminent les étapes, permettent d’économiser du temps et de la main-d’œuvre en laboratoire et de réduire les coûts et les déchets par rapport aux flux de travail traditionnels.
En plus des étapes cruciales décrites ci-dessus, un autre problème est de fournir un milieu de cryoconservation et une méthode pour préserver la structure 3D de l’échantillon avec des taux de viabilité cellulaire plus élevés 26,27,28,29,30,31. La cryoconservation est essentielle pour créer un système modèle stable et permettre la biobanque d’organoïdes et de sphéroïdes32,33. La biobanque de l’ensemble de la structure 3D originale permettra une récapitulation plus fidèle de l’état naturel de santé ou de maladie. Les considérations clés sont la commodité et la fiabilité de la cryoconservation et la décongélation des organoïdes / sphéroïdes. La récupération des organoïdes post-dégel est très faible dans la plupart des technologies actuelles, souvent inférieure à 50%. Cependant, des études récentes ont montré des résultats prometteurs avec des taux de survie améliorés26,27,28,29. Lee et al. ont démontré que 78% des cellules sphéroïdes ont survécu après la cryoconservation lorsqu’ils ont utilisé la solution de l’Université du Wisconsin contenant 15% de DMSO28. Le rapport de survie cellulaire a augmenté à 83% dans l’étude d’Arai et al.29. Cependant, les résultats après cryoconservation sont considérablement affectés car les structures 3D ne peuvent pas maintenir les mêmes caractéristiques et qualités. En outre, des réactifs sans sérum sont nécessaires pour les bonnes pratiques de fabrication dans les environnements pharmaceutiques et diagnostiques. Les flux de travail traditionnels utilisent un milieu contenant du sérum bovin fœtal (FBS) et du diméthylsulfoxyde (DMSO) pour la méthode de congélation lente, qui sont tous deux associés à des handicaps. FBS est un produit d’origine animale et peut avoir des variations de lot. Le DMSO est un cryoprotecteur très efficace, mais une exposition à long terme, en particulier lors de la décongélation, peut provoquer des effets cytotoxiques30,31.
Cet article décrit également la méthodologie de congélation / décongélation d’organoïdes entiers ou de sphéroïdes encore dans un hydrogel. Deux formules pour congeler des organoïdes et des sphéroïdes sont utilisées dans l’étude : (1) 10% de DMSO contenant une solution de congélation traditionnelle (FS) et (2) un milieu de cryoconservation sans sérum et DMSO. Ce milieu de cryoconservation contient des composants de matrice extracellulaire, qui sont différents des formules actuelles. La matrice extracellulaire comprend deux classes principales de macromolécules, les protéoglycanes et les protéines fibreuses, qui sont essentielles pour l’échafaudage physique des constituants cellulaires, mais qui initient également les processus nécessaires à la morphogenèse, à la différenciation et à l’homéostasie tissulaires 34,35,36,37,38,39,40 . Les collagènes fournissent une résistance à la traction, régulent l’adhésion cellulaire, soutiennent la chimiotaxie et la migration, et dirigent le développement tissulaire37. De plus, les fibres d’élastine assurent le recul des tissus qui subissent des étirements répétés38. Une troisième protéine fibreuse, la fibronectine, dirige l’organisation de la matrice extracellulaire interstitielle et joue un rôle crucial dans la médiation de la fixation cellulaire et fonctionne comme un mécano-régulateur extracellulaire39. Du et al. ont démontré l’effet cryoprotecteur de l’hydrolysat de collagène de poulet sur le système modèle naturel d’actomyosine41. Leurs résultats suggèrent que l’hydrolysat de collagène peut inhiber la croissance des cristaux de glace, réduire la dénaturation et l’oxydation des protéines de la même manière que les cryoprotecteurs commerciaux et fournir une meilleure structure de gel après les cycles de gel-dégel. Par conséquent, l’ajout de composants de matrice extracellulaire au milieu de cryoconservation fournit un environnement plus sûr et protecteur pour l’échantillon et favorise la guérison des structures vivantes après congélation-décongélation.
De plus, la présente étude décrit un protocole simple pour marquer les membranes cytoplasmiques et les noyaux d’organoïdes et de sphéroïdes vivants alors qu’ils sont encore dans l’hydrogel.

<table><tbody><tr><td>Éthanol absolu (EtOH)</td><td>Merck</td><td>8187602500</td><td>Diluer dans du dH2O pour obtenir une solution à 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 % et 96 % et à stocker chez RT</td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Merck</td><td>8222512500</td><td>Stocker chez RT</td></tr><tr><td>Alexa fluor germe de blé agglutinine et Hoechst&nbsp ; dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) &nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>I34406</td><td>Image-IT LIVE Kit de marquage à membrane plasma et nucléaire, stocké à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>alpha-1-fœtoprotéine (AFP) Anticorps polyclonal concentré et prédilué</td><td>Biocare Medical</td><td>CP 028 A</td><td>Se conserve à +4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Anticorps anti-albumine</td><td>Abcam</td><td>EPR20195</td><td>Conserver à +4 &deg ; C, Dilution : 1:50</td></tr><tr><td>Anticorps anti-bêta-galactosidase, Poulet polyclonal</td><td>134435</td><td></td><td>Conserver à +4 &deg ; C, dilution : 1:25</td></tr><tr><td>Anti-cytokératine 5</td><td>Abcam</td><td>53121</td><td>Conserver à +4 &deg ; C, dilution : 1:100</td></tr><tr><td>Arginase-1 Anticorps monoclonal de lapin concentré et prédilué</td><td>Biocare Medical</td><td>ACI 3058 A, B</td><td>Conserver à +4 &deg ; C, Dilution : 1:50</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium (CaCl2)</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td>Dissoudre dans le fixateur de Karnovsky pour produire 2 mM de CaCl2 ; stocker chez RT</td></tr><tr><td>Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)</td><td>Abcam</td><td>ab228554</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger, 15 mL&nbsp ;</td><td>Nest</td><td>601051</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger, 50 mL&nbsp ;</td><td>Nest</td><td>602052</td><td></td></tr><tr><td>Classe II Enceinte de sécurité microbiologique Bio II Advance Plus</td><td>Telstar</td><td>EN12469</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubateur</td><td>Panasonic</td><td>KM-CC17RU2</td><td></td></tr><tr><td>Grilles en cuivre</td><td>Microscopie</td> électronique <td>Sciences G100-Cu</td><td>Sections ultra-minces posées sur les grilles ; 100 lignes/pouce maille carrée</td></tr><tr><td>Sécheur à point critique</td><td>Leica</td><td>EM CPD300</td><td>Pour le séchage d’échantillons biologiques pour les applications MEB dans un mélange de</td></tr><tr><td>solution chromogène absolue d’acétone DAB/AEC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AEC101</td><td>Magasin à +4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Couteau</td><td>diamanté Diatome</td><td>Ultra 45&deg ;, 40-US</td><td>Utilisation pour les sections ultra-minces pour TEM</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde pour la biologie moléculaire</td><td>Biofroxx</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Plastique jetable Pasteur Pippettes</td><td>Nest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM - Dulbecco’s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>41966-029</td><td>Store à +4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Eosin Y Solution Alcoolique</td><td>Brillante Slide</td><td>2.BS01-105-1000</td><td></td></tr><tr><td>Résine Epon&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>45359-1EA-F</td><td>Kit moyen d’enrobage époxy, Stocké à +4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Sérum Fœtal Bovin avec Additive Fortifiant</td><td>Pan Biotech</td><td>P30-3304</td><td>Stocker à +4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Freezing Solution (FS)</td><td>Cellorama</td><td>CellO-F</td><td>Se conserve à +4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Fabricant de couteaux en verre</td><td>Leica</td><td>EM KMR3</td><td>Pour la fabrication de couteaux en verre de 8 mm d’épaisseur</td></tr><tr><td>Bandes de couteau en verre (taille 8 mm x 25,4 mm x 400 mm)</td><td>Leica</td><td>7890-08</td><td>Utilisation pour les sections ultra-minces ou semi-minces pour la</td></tr><tr><td>solution aqueuse de glutaraldéhyde TEM, grade EM, 25 %&nbsp ;</td><td>Sciences de la microscopie électronique</td><td>16210</td><td>Diluer dans dH2O pour obtenir une solution à 2,5 % et la conserver à +4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Solution de glycérol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56-81-5</td><td>Conserver à -20 °C, Dilution :1:100</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-IgY (H+L) de chèvre, Alexa, 647</td><td>Invitrogen</td><td>A32933</td><td>Stocker chez RT</td></tr><tr><td>Anticorps secondaires anti-IgG de souris (H+L), DyLight, 488</td><td>Invitrogen</td><td>35502</td><td>Stocker à +4 &deg ; C,&nbsp ; Dilution :1:50</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-IgG de souris (H+L), DyLight, 550</td><td>Invitrogen</td><td>84540</td><td>Stocker à +4 &deg ; C,&nbsp ; Dilution :1:50</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) de chèvre, DyLight, 488</td><td>Invitrogen</td><td>35552</td><td>Stocker à +4 &deg ; C,&nbsp ; Dilution :1:50</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) de chèvre, DyLight, 550</td><td>Invitrogen</td><td>84541</td><td>Stocker à +4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Hématoxyline Harris&nbsp ;</td><td>Bright Slide</td><td>2.BS01-104-1000</td><td></td></tr><tr><td>Cellules HepG2</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td>Stocker dans un réservoir d’azote</td></tr><tr><td>Humain/Rat OV-6 Anticorps monoclonal souris IgG1 Clone # OV-6</td><td>R& D Systems</td><td>MAB2020</td><td>Stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Hydrogel</td><td>Corning</td><td>354248</td><td>Matrigel, matrice de membrane basale haute concentration (HC), sans LDV, 10 mL, stockage à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Hydrogel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Matrigel, Matrice de membrane basale, sans LDV, 10 mL, Stockage à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Hydrogel</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A1413201</td><td>Geltrex, sans LDEV Facteur de croissance réduit Membrane basale</td></tr><tr><td>Matrice Hydrogel</td><td>Biotechne, R& D Systems</td><td>BME001-01</td><td>Cultrex Ultramatrix RGF BME, Magasin à -20 &deg ; C</td></tr><tr>Fixateur <td></td><td></td><td>de Karnovsky</td><td> %2 PFA, %2,5 Glutaraldéhyde dans un tampon de cacodylate 0,15 M, 2 mM de CaCl2 ; préparer frais ; utiliser pour TEM & Échantillons MEB</td></tr><tr><td>d’acide L-aspartique</td><td>Sigma</td><td>11189-100G</td><td>Stocker chez RT Solution d’aspartate</td></tr><tr><td></td><td></td><td>de plomb</td><td>Dissoudre 40 mg d’acide aspartique dans 10 mL de ddH2O et ajouter 66 mg de nitrate de plomb. La solution se stabilise à 60 &deg ; C et ajuster le pH à 5 ; préparer du</td></tr><tr><td>nitrate de plomb</td> frais <td>Microscopie électronique Sciences</td><td>17900</td><td>Magasiner chez RT</td></tr><tr><td>Microscope confocal Leica</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>LSM 700 Microscope confocal à balayage laser</td><td>Zeiss Lecteur de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microplaques</td><td>Biotek Synergy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispositif polyvalent (MD)</td><td>Cellorama CellO-M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coloration à l’ADN nucléaire</td><td>Invitrogen</td><td>H3569</td><td>Hoechst 33258, Pentahydraté (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution dans l’eau, Conserver à +4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Coloration à l’ADN nucléaire</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>62248</td><td>solution DAPI, Conserver à +4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Tétroxyde d’osmium (OsO4) ,4 %</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>19190</td><td>Diluer dans dH2O pour obtenir une solution à 2 %; stocker à +4 &deg ; C et dans un contenant hermétique ; protéger la lumière Ov6</td></tr><tr><td></td><td>anticorps R& D systems</td><td>MAB2020</td><td>Stocker à +4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Solution de paraformaldéhyde (PFA), 4 %&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>1.04005.1000</td><td>Dissoudre 4 % de PFA dans dH2O et faire bouillir, refroidir et aliquote ; conserver à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Solution de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS, 1 L</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>Conserver à +4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), comprimés</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td> post-fixatrice<td> %2 OsO4, %2,5 Ferrocyanure de potassium en dH2O ; préparer une</td></tr><tr><td>solution aqueuse fraîche de ferrocyanure de potassium, 5 %&nbsp ;</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>26603-01</td><td>Store chez RT</td></tr><tr><td>Primovert - Microscope à champ clair inversé - ZEISS</td><td>Zeiss</td><td>N° d’article : 491206-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation à fond rond, 2 mL</td><td>Nest</td><td>620611</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie électronique à balayage avec embout STEM</td><td>Zeiss</td><td>GeminiSEM 500</td><td>Nous utilisons le détecteur d’électrons secondaires (SE) Inlens à 2-3 kV pour les micrographies électroniques à balayage et le détecteur aSTEM à 30 kV pour les micrographies électroniques à transmission.</td></tr><tr><td>SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack</td><td>ScyTek Laboratories</td><td>SHP125</td><td>Magasin à +4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Tampon cacodylate de sodium, 0,4 M, pH 7,2</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>11655</td><td>Diluer dans dH2O pour faire 0,2 M et stocker à +4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Anticorps ATPase alpha 1 sodium/potassium [M7-PB-E9]</td><td>GeneTex</td><td>GTX22871</td><td>Se conserve à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Solution pour le marquage par immunofluorescence (S-IF)</td><td>Cellorama</td><td>CellO-IF</td><td>Conserver à +4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Solution pour l’immunohistochimie (S-IHC)</td><td>Cellorama</td><td>CellO-P</td><td>Se conserve à +4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Dispositif de coupe d’échantillon</td><td>Leica</td><td>EM TRIM2</td><td>Pour préparer un bloc d’échantillon épon à un ultramicrotome</td></tr><tr><td>Coucheuse par pulvérisation cathodique</td><td>Leica</td><td>EM ACE200</td><td>Enduire les échantillons MEB avec 6 nm d’or/palladium pour 90 s</td></tr><tr><td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td><td>Sigma</td><td>223220-5G</td><td>Diluer dans dH2O pour obtenir une solution à 0,5 % et filtrer avec 0,22 &micro ; M filtre à membrane ; magasin chez RT ; préparer une</td></tr><tr><td>nouvelle solution de bleu de trypan, 0,4 %</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Super colle super gel</td><td>Pattex</td><td>PSG2C</td><td>Pour coller un bloc d’épon polymérisé avec l’échantillon au support du bloc d’épon</td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td>Pour préparer des sections ultra- ou semi-minces de haute qualité pour la microscopie électronique à transmission (MET)</td></tr><tr><td>Pointes de pipette universelles, 10 & micro ; L</td><td>Nest</td><td>171215-1101</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette universelles, 1000 & micro ; L</td><td>Isolab</td><td>L-002</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette universelles, 200 & micro ; L&nbsp ;</td><td>Nest</td><td>110919HA01</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’uranyle</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>22400</td><td>Diluer dans dH2O pour faire une solution à 2 % et filtrer avec 0,22 &micro ; M filtre à membrane ; garder le magasin de conteneurs bien fermé chez RT</td></tr></tbody></table>

culture, congélation, traitement et imagerie d’organoïdes et de sphéroïdes entiers alors qu’ils sont encore dans un hydrogel

Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel

Les organoïdes et les sphéroïdes, structures de croissance tridimensionnelles dans les laboratoires de culture cellulaire, sont de plus en plus reconnus comme des modèles supérieurs par rapport aux modèles de culture bidimensionnels, car ils imitent mieux le corps humain et présentent des avantages par rapport aux études animales. Cependant, ces études rencontrent souvent des problèmes de reproductibilité et de cohérence. Au cours des longs processus expérimentaux - avec les transferts d’organoïdes et de sphéroïdes entre différents vaisseaux de culture cellulaire, le pipetage et la centrifugation - ces structures de croissance 3D sensibles et fragiles sont souvent endommagées ou perdues. En fin de compte, les résultats sont considérablement affectés, car les structures 3D ne peuvent pas maintenir les mêmes caractéristiques et la même qualité. Les méthodes décrites ici minimisent ces étapes stressantes et assurent un environnement sûr et cohérent pour les organoïdes et les sphéroïdes tout au long de la séquence de traitement alors qu’ils sont encore dans un hydrogel dans un dispositif polyvalent. Les chercheurs peuvent cultiver, congeler, décongeler, traiter, colorer, étiqueter, puis examiner la structure des organoïdes ou des sphéroïdes sous divers instruments de haute technologie, des microscopes confocaux aux microscopes électroniques, à l’aide d’un seul dispositif polyvalent. Cette technologie améliore la reproductibilité, la fiabilité et la validité des études, tout en maintenant un environnement stable et protecteur pour les structures de culture 3D pendant le traitement. De plus, l’élimination des étapes stressantes minimise les erreurs de manipulation, réduit le temps nécessaire et diminue le risque de contamination.

Le présent article représente un dispositif polyvalent (DM) et des méthodologies complémentaires pour la culture, la congélation, la décongélation, la coloration histologique, la coloration immunohistochimique, le marquage par immunofluorescence, l’enrobage et le traitement d’organoïdes entiers ou de sphéroïdes tout en restant dans un hydrogel dans un seul environnement conçu de manière unique. La présente étude a été conçue pour préparer des sphéroïdes du cancer du foie HepG2 dans 35 gouttes d’hydrogel dans 35 MD. Les e...

La présente étude décrit des méthodologies pour la culture, la congélation, la décongélation, le traitement, la coloration, l’étiquetage et l’examen de sphéroïdes et d’organoïdes entiers sous divers microscopes, alors qu’ils restent intacts dans un hydrogel dans un dispositif polyvalent.

Culture, congélation, traitement et imagerie d’organoïdes et de sphéroïdes entiers alors qu’ils sont encore dans un hydrogel

Organoids and spheroids, three-dimensional growing structures in cell culture labs, are becoming increasingly recognized as superior models compared to ...

Les organoïdes et les sphéroïdes, étant très fragiles, sont gravement endommagés lors de la manipulation. Notre protocole garantit que ces structures de culture 3D restent intactes au cours de divers processus, augmentant ainsi la précision, la reproductibilité, la fiabilité et la répétabilité. Le chercheur peut cultiver, congeler, décongeler, traiter, colorer, étiqueter et examiner des organoïdes et des sphéroïdes entiers sous divers microscopes alors qu’ils restent intacts dans un hydrogel dans un seul appareil polyvalent.Il permet la création d’un modèle de maladie et le suivi des étapes séquentielles dans un dispositif polyvalent. La technologie apporte plus de précision lors de l’examen des biomarqueurs pour le diagnostic et le pronostic des maladies. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel système de culture 3D, y compris les organoïdes, les sphéroïdes, les cellules individuelles ou les organismes vivants.Pour commencer la culture organoïde ou sphéroïde, placez l’hydrogel correctement décongelé sur de la glace à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire pendant 15 minutes. Gardez également le tube contenant une pastille du carcinome hépatocellulaire, ou cellules HEPG2, sur de la glace. Ensuite, plaquez 30 à 35 microlitres d’hydrogel à 100% dans la niche du dispositif polyvalent préchauffé pour créer une goutte de gel, placez 10 000 cellules HEPG2 au centre du haut de la goutte d’hydrogel et incuber l’installation à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.Après l’incubation, couvrir la goutte d’hydrogel avec 200 microlitres de milieu aigle modifié de Dulbecco, ou DMEM, contenant 10% de sérum bovin fœtal, ou FBS. Placez le couvercle sur l’appareil correctement, permettant le flux de gaz, avant de le placer dans l’incubateur. Tous les deux jours, alimentez les cellules avec 200 microlitres de DMEM contenant 10% FBS.Vérifiez la croissance des sphéroïdes sous un microscope inversé. Avant de commencer le marquage par immunofluorescence des organoïdes, réchauffez les milieux et les solutions nécessaires à 37 degrés Celsius. Aspirez le milieu de culture cellulaire entourant la goutte d’hydrogel avant d’ajouter 200 microlitres de paraformaldéhyde à 4% préchauffé à 37 degrés Celsius et fixez-le en le plaçant dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes.Ensuite, aspirez le fixateur et lavez la solution pour le marquage par immunofluorescence, ou SIF, préchauffée à 37 degrés Celsius trois fois pendant 10 minutes chacune. Ajoutez de l’eau distillée à la zone entourant la niche pour fournir de l’humidité avant de passer aux étapes suivantes. Aspirez le SIF entourant la goutte d’hydrogel et ajoutez 100 microlitres de la solution d’anticorps primaires préchauffée dans le SIF à l’hydrogel avant de l’incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes.Ensuite, aspirez la solution d’anticorps primaire et lavez avec SIF préchauffé à 37 degrés Celsius trois fois pendant 10 minutes chacun. Après le lavage, aspirer le SIF restant et ajouter 100 microlitres de la solution d’anticorps secondaires préchauffée dans le SIF à l’hydrogel. Incuber l’hydrogel à 37 degrés Celsius dans l’obscurité pendant 30 à 60 minutes.Après l’incubation, aspirez la solution d’anticorps secondaire et lavez la goutte d’hydrogel avec du PBS à 37 degrés Celsius trois fois dans l’obscurité pendant 10 minutes chacune. Ensuite, aspirez le PBS résiduel et incuber l’hydrogel avec 100 microlitres de coloration d’ADN nucléaire contenant un milieu de montage ou du glycérol à 37 degrés Celsius dans l’obscurité. Remplissez la niche avec du glycérol pour éviter le séchage avant de fermer hermétiquement l’appareil polyvalent contenant l’hydrogel.Pour examiner les organoïdes par microscopie confocale, réglez les paramètres du microscope en suivant les instructions données dans le manuscrit. Pour congeler les organoïdes, aspirer le milieu de culture cellulaire, ajouter 200 microlitres de la solution de congélation préchauffée et incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant une heure. Fermez bien le couvercle de l’appareil avant de le placer dans une boîte en mousse.Placez cette boîte en mousse dans une autre boîte en mousse et fermez hermétiquement les deux boîtes en mousse. Conservez la boîte à moins 20 degrés Celsius pendant deux heures, puis laissez-la toute la nuit dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Pour conserver les organoïdes pendant plus de six mois, retirez le dispositif polyvalent contenant les organoïdes des boîtes et transférez-le dans le réservoir d’azote liquide.Pour décongeler les organoïdes, sortez l’appareil polyvalent contenant l’échantillon du congélateur ou du réservoir d’azote liquide et placez-le directement dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Une fois décongelé, aspirer doucement le mélange de milieu et de solution de congélation avant d’ajouter le milieu frais et de procéder à l’imagerie de l’hydrogel organoïde à montage entier. En imagerie en direct, les organoïdes en croissance à l’intérieur de l’hydrogel sont devenus visibles trois à cinq jours après l’insertion de la pastille cellulaire, en particulier à la périphérie du dôme d’hydrogel.La série chronologique d’images à différents niveaux d’un hydrogel contenant des sphéroïdes sous un microscope à contraste de phase inversé est montrée ici. Les images de microscopie confocale des organoïdes vivants entiers après coloration vivante de la membrane cellulaire et du noyau ont montré une densité de marquage similaire à la périphérie et au centre. En outre, le marquage par immunofluorescence des stéroïdes à montage entier pourrait être effectué avec succès avec un anticorps, deux anticorps et trois anticorps, éliminant ainsi tout besoin d’étapes de traitement supplémentaires.L’analyse représentative démontre deux organoïdes des voies respiratoires marqués par immunofluorescence dans un dispositif. Les images MEB des sphéroïdes entiers dans le dispositif polyvalent et 10 images de stéroïdes sectionnés ont indiqué une architecture 3D bien préservée de sphéroïdes, d’organites cytoplasmiques et d’autres caractéristiques cellulaires ultra-structurelles, démontrant l’efficacité du protocole décrit. Une irrégularité aux limites du dôme d’hydrogel était évidente après la congélation des échantillons.Cependant, la taille et la rondeur des sphéroïdes sont restées similaires. La migration cellulaire sur la surface de culture a été observée après la décongélation des échantillons congelés. La technique est très simple.Cependant, le chercheur doit être très doux lors de l’aspiration ou de l’ajout de liquides entourant la goutte d’hydrogel pour éviter d’endommager l’échantillon. Le chercheur peut examiner le même échantillon dans un seul appareil à l’aide d’un microscope de haute technologie et mener une étude corrélative.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ce protocole a été généré comme un moyen de produire des organoïdes cérébraux d’une manière simplifiée et peu coûteuse sans facteurs de croissance exogènes ou matrice de membrane de sous-sol tout en maintenant la diversité des types de cellules cérébrales et de nombreuses caractéristiques de l’organisation cellulaire.

Une méthode statique auto-dirigée pour générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches embryonnaires humaines

Toute la structure 3D et la teneur cellulaire des organoïdes, ainsi que leur ressemblance phénotypique avec le tissu d’origine peuvent être capturés à l’aide du protocole d’imagerie 3D à résolution unicellulaire décrit ici. Ce protocole peut être appliqué à un large éventail d’organoïdes variant dans l’origine, la taille et la forme.

Imagerie tridimensionnelle à résolution unicellulaire des Organoïdes intacts

Ici, nous fournissons des protocoles détaillés, robustes et complémentaires pour effectuer la coloration et l’imagerie de résolution subcellulaire de modèles de culture cellulaire tridimensionnelle fixes allant de 100 μm à plusieurs millimètres, permettant ainsi la visualisation de leur morphologie, de leur composition de type cellulaire et de leurs interactions.

Coloration et imagerie haute résolution de modèles organoïdes et sphéroïdes tridimensionnels

Ici, des méthodes détaillées pour générer, maintenir et caractériser des organoïdes de l’intestin grêle et du côlon dérivés de cellules souches pluripotentes humaines sont décrites. Ces méthodes sont conçues pour améliorer la reproductibilité, étendre l’évolutivité et réduire le temps de travail nécessaire au placage et au passage des organoïdes.

Génération, maintenance et caractérisation d’organoïdes intestinaux et coliques dérivés de cellules souches pluripotentes humaines

Un protocole détaillé est présenté ici pour décrire un modèle organoïde in vitro à partir de cellules épithéliales nasales humaines. Le protocole propose des options pour les mesures nécessitant un équipement de laboratoire standard, avec des possibilités supplémentaires pour l’équipement et les logiciels spécialisés.

Culture et imagerie des organoïdes épithéliaux nasaux humains

Ici, nous décrivons une méthode de génération d’organoïdes de glioblastome (GBM) à partir d’échantillons primaires de patients ou de cultures cellulaires dérivées de patients et de les maintenir jusqu’à maturité. Ces organoïdes GBM contiennent des populations cellulaires phénotypiquement diverses et recréent des microenvironnements tumoraux ex vivo.

Maintien ex vivo de la diversité cellulaire du glioblastome humain à l’aide d’une culture organoïde tridimensionnelle

Cet article présente un protocole de fabrication pour un nouveau type de substrat de culture avec des centaines de microconteneurs par mm2, dans lequel les organoïdes peuvent être cultivés et observés à l’aide de la microscopie à haute résolution. Les protocoles d’ensemencement cellulaire et d’immunomarquage sont également détaillés.

Une plateforme à haut débit pour la culture et l’imagerie 3D d’organoïdes

Nous présentons ici un protocole qui permet une fabrication rapide, robuste et peu coûteuse de sphéroïdes tumoraux, suivie d’une encapsulation d’hydrogel. Il est largement applicable car il ne nécessite pas d’équipement spécialisé. Il serait particulièrement utile pour explorer les interactions sphéroïde-matrice et construire des modèles de physiologie tissulaire ou de pathologie in vitro .

Fabrication et encapsulation de sphéroïdes tumoraux dans des hydrogels de polyéthylène glycol pour étudier les interactions sphéroïde-matrice

Cette étude présente une méthodologie rentable et efficace pour générer des structures cellulaires 3D à l’aide d’un système basé sur des tampons pour créer des micropuits dans des moules d’agarose. Le système favorise la formation de sphéroïdes/organoïdes uniformes, améliorant ainsi les interactions cellulaires. Cette approche réduit la variabilité expérimentale et soutient les applications dans les tests de médicaments et l’ingénierie tissulaire.

Génération de sphéroïdes/organoïdes tridimensionnels à partir de cultures cellulaires bidimensionnelles à l’aide d’un nouveau dispositif de tamponnage

Nous présentons un protocole étape par étape pour l’imagerie tridimensionnelle à haute résolution, sans marquage et des organoïdes à l’aide de l’holotomographie à faible cohérence. Ce protocole détaille la préparation de la culture d’organoïdes, l’acquisition d’images et l’analyse d’images informatiques, permettant de visualiser en temps réel la dynamique structurelle et les réponses aux médicaments dans les organoïdes vivants.

Imagerie 3D haute résolution sans marquage et analyse par apprentissage automatique d’organoïdes intestinaux par holotomographie à faible cohérence

Découvrez une méthode complète de culture, congélation et imagerie d'organoïdes et de sphéroïdes entiers dans un hydrogel à l'aide d'un dispositif polyvalent. Cette technique préserve l'intégrité structurale des échantillons 3D pour une analyse fiable des biomarqueurs.

Culture, congélation, traitement et imagerie d’organoïdes et de sphéroïdes entiers alors qu’ils sont encore dans un hydrogel

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