Imagerie 3D haute résolution sans marquage et analyse par apprentissage automatique d’organoïdes intestinaux par holotomographie à faible cohérence

Notre objectif est d’établir des méthodes d’imagerie en temps réel et sans marquage lors du suivi des changements biophysiques dans les organoïdes vivants pendant le développement et en réponse aux médicaments. Ce protocole facilite l’échelle rationalisée de l’imagerie et les tests de médicaments non invasifs dans les organoïdes vivants, soutenus par la mutation induite par l’IA et la sélection quantitative de texture pour la recherche biomédicale. Nous prévoyons d’intégrer davantage l’imagerie 3D sans marquage et une analyse d’un an pour des études organoïdes non invasives à haute résolution dans la modélisation des maladies et la médecine précise.

Pour commencer, aspirez le milieu usé de chaque puits d’une plaque de 48 puits contenant la matrice extracellulaire. Ajoutez 200 microlitres de solution de récupération cellulaire dans chaque puits et incubez à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. À l’aide d’une pipette, prélevez délicatement la suspension organoïde et transférez-la dans un tube de microcentrifugation.

Centrifugez le tube à 150 g pendant trois minutes, puis retirez délicatement le surnageant. Pour dissocier mécaniquement la pastille, il faut la remettre en suspension dans 200 microlitres de milieu de culture et pipeter la suspension de haut en bas 20 à 30 fois à l’aide d’une pipette P200 avant de la centrifuger pendant trois minutes. Après la centrifugation et l’élimination du surnageant, ajoutez du milieu et de la matrice extracellulaire fraîche, ou ECM, dans un rapport de un à quatre à la pastille et pipetez doucement pour bien mélanger.

Distribuez 15 microlitres du mélange par dôme dans chaque puits d’une plaque de 48 puits. Placez la plaque à l’envers dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure pour permettre la polymérisation de l’ECM. Après la polymérisation, ajoutez 200 microlitres de milieu de culture frais dans chaque puits et remplissez les puits extérieurs vides avec du PBS.

Pour préparer l’échantillon à l’imagerie, distribuez 15 microlitres de dôme ECM organoïde sur une boîte d’imagerie à fond de lamelle numéro 1,5 et incubez-la à température ambiante pendant une minute. Placez l’assiette à l’envers dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Ensuite, ajoutez doucement suffisamment de milieu de culture pour immerger complètement les organoïdes.

Cinq jours après le passage, laver l’échantillon deux à trois fois avec du PBS immédiatement avant l’imagerie. Ensuite, pour l’imagerie, activez le contrôleur d’environnement. L’unité de contrôle de la chambre réglera automatiquement la température à 37 degrés Celsius et le dioxyde de carbone à 5 %Appuyez sur le bouton de la porte pour ouvrir la porte.

Ajoutez de l’eau pour former une fine couche à l’intérieur du puits de la chambre. Placez la parabole d’imagerie dans le support du récipient, insérez-la dans la chambre d’imagerie et fixez-la à l’aide d’une goupille pour éviter tout mouvement. Fermez la porte pour éviter les interférences de la lumière externe.

Maintenant, lancez le logiciel TomoStudio X et connectez-vous. Cliquez sur Démarrer pour ouvrir la fenêtre principale, puis cliquez sur Ajouter un projet dans le coin supérieur gauche et attribuez le test. Vérifiez que le type de support approprié est sélectionné pour une utilisation appropriée de l’indice de réfraction.

Cliquez sur le puits souhaité dans le panneau, puis cliquez sur Créer en haut pour enregistrer le puits en tant qu’échantillon. Ensuite, cliquez sur Configuration du retour sur investissement dans le coin supérieur droit pour définir la région d’intérêt dans l’antenne. Une fois défini, cliquez sur Exécuter l’expérience dans le coin inférieur droit pour ouvrir la fenêtre Acquisition d’images.

Cliquez sur Charger le récipient dans le coin pour afficher une image en fond clair. Ajustez la position Z à l’aide des boutons Z et Z pour mettre l’image au point. Dans l’onglet Imagerie unique, ajustez la taille de la zone d’intérêt.

Capturez des organoïdes dans un champ de vision de 160 micromètres sur 160 micromètres et acquérez des piles jusqu’à 140 micromètres de profondeur. Accédez à l’onglet Time Lapse Imaging pour configurer l’imagerie à long terme et définir la durée et l’intervalle de temps souhaités. Cliquez sur l’icône Scanner pour capturer l’emplacement actuel du retour sur investissement.

Cliquez sur le bouton BF pour régler l’intensité et les valeurs d’exposition de l’imagerie en fond clair. Déplacez la zone ROI dans le panneau Aperçu pour sélectionner la ROI. Une fois le retour sur investissement souhaité sélectionné, cliquez sur Ajouter un point en bas, la liste des points d’imagerie sera créée.

Maintenant, cliquez sur Acquérir pour commencer l’imagerie et acquérir les données d’image brutes. Lancez le serveur de traitement HTX en cliquant sur l’icône Bureau. Faites glisser et déposez des fichiers d’image brute sur le serveur de traitement HTX.

Cliquez sur Traiter pour générer un fichier TCF à partir du fichier d’image brute. Lancez TomoAnalysis Viewer en cliquant sur l’icône Bureau. Chargez les fichiers TCF traités en les faisant glisser et en les déposant dans la fenêtre du visualiseur.

Double-cliquez sur la vignette d’un fichier pour ouvrir le Tomogramme de retour sur investissement. Examinez la vue 2D en naviguant dans les plans X, Y et Z à l’aide des commandes de zoom, de panoramique et de défilement. Cliquez sur l’icône de la vue de rendu MIP sur la gauche pour passer en mode de rendu 3D.

Naviguez dans la vue 3D en faisant pivoter, zoomer et déplacer l’image. Pour la segmentation d’image basée sur l’apprentissage automatique, exportez le fichier image TCF au format HDF5 pour vous assurer que les données sont dans un format multidimensionnel, compatible avec ilastik. Ouvrez ilastik et accédez à Nouveau projet.

Sélectionnez Classification des pixels dans la section Workflow de segmentation et enregistrez le projet dans un dossier désigné. Pour charger le fichier HGF5, accédez à l’onglet Données d’entrée, cliquez sur Ajouter un nouveau fichier, sélectionnez le jeu de données H5 approprié et vérifiez les affectations de canaux d’image correctes. Maintenant, accédez à l’onglet Sélection de fonctionnalités pour choisir des caractéristiques telles que la couleur, l’intensité, le bord et la texture afin d’optimiser la segmentation.

Dans l’onglet Entraînement, étiquetez les régions organoïdes et non organoïdes à l’aide de traits de pinceau de couleurs différentes. Cliquez sur Mise à jour en direct pour prévisualiser les résultats de la segmentation et effectuer des ajustements, si nécessaire. Une fois cela fait, allez dans l’onglet Exportation de prédiction.

Sélectionnez Segmentation simple comme source pour exporter les prédictions étiquetées et cliquez sur Exporter tout. Définissez le format d’exportation sur H5 ou TIFF en fonction des exigences d’analyse. Pour l’analyse quantitative, ouvrez le Fichier supplémentaire de codage 2.

Désignez les chemins d’accès aux dossiers appropriés pour le fichier de masque et le fichier TCF correspondant dans le script. Exécutez le code pour lancer l’analyse quantitative. Le code calculera le volume des organoïdes, la densité des protéines et la teneur totale en protéines pour chaque ensemble de données.

Cette figure illustre les reconstructions tridimensionnelles à haute résolution de l’indice de réfraction utilisées pour visualiser la morphologie globale des organoïdes de l’intestin grêle. Les reconstructions rendues révèlent des différences structurelles distinctes entre les organoïdes traités en véhicule et traités au cisplatine sur les trois profondeurs de section optique. Les organoïdes traités au cisplatine ont montré un volume significativement plus élevé, une densité protéique plus faible et des teneurs totales en protéines plus élevées, par rapport aux organoïdes traités par véhicule 10 minutes après le traitement, indiquant un gonflement structurel précoce et une composition protéique altérée.

L’imagerie en accéléré sur 24 heures a montré que les organoïdes traités par véhicule maintenaient leur intégrité structurelle, tandis que les organoïdes traités au cisplatine présentaient une dégradation structurelle progressive, y compris l’effondrement de la crypte et une dissociation cellulaire accrue, suggérant des dommages cytotoxiques dépendants du temps. Le suivi quantitatif a confirmé que les organoïdes traités par véhicule ont augmenté en volume et en teneur en protéines au fil du temps, tandis que les organoïdes traités au cisplatine ont montré un déclin dépendant du temps des deux paramètres, indiquant que le cisplatine supprimait la croissance et induisait la dégradation cellulaire. La densité protéique est restée stable dans les organoïdes traités par véhicule, mais a progressivement diminué dans les organoïdes traités au cisplatine au cours de la période de 24 heures, suggérant une dégradation de la structure cellulaire et une augmentation de l’espace extracellulaire due à l’exfoliation.