Name: confocal microscopy for protein localization
Uploaded: 2023-04-30T07:08:35.000Z
Duration: 13 min 13 s
Channel: JoVE

1. חומרים
מאגרי
<ol><li>חוצץ כביסה: 1 X תמיסת מלח סטרילית חוצצת פוספט (PBS) ללא סידן או מגנזיום</li>
	<li>מאגר קיבעון: 1% paraformaldehyde ב- PBS</li>
	<li>מאגר פרמזביליזציה: 0.1% טריטון X-100 ב- PBS</li>
	<li>חוסם חוצץ: 1% אלבומין סרום בקר ב- PBS</li>
	<li>בינוני לצמיחת תאים: DMEM בתוספת סרום בקר עוברי 10% (FBS), פניצילין/סטרפטומיצין ו-L-גלוטמין</li>
</ol>ציוד
<ol start="6"><li>מכסה המנוע של זרימה למינאר</li>
	<li>אינקובטור לח (37°C, 5% CO2)</li>
	<li>מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלית; הנה, ניקון ליקוי חמה Ti לייזר</li>
</ol>חומרים ריגנטים
<ol start="9"><li>שקופיות של תרבית תאים קאמרית</li>
	<li>מדיה נגד עמעום הרכבה עם DAPI (להכתמת גרעינים)</li>
	<li>זכוכית כיסוי מיקרוסקופ</li>
	<li>מגבוני משימה עדינים</li>
	<li>פיפטורים וטיפים</li>
</ol>ריאגנטים ספציפיים לאסיי
<ol start="14"><li>תאים חסידיים (תאים ראשיים או שורות תאים); כאן, פיברובלסטים עכבר transfected עם CD1d שימשו (LCD1).</li>
	<li>נוגדנים עיקריים לזיהוי מטרות תאיות; כאן, עכברוש נגד עכבר CD107a (LAMP-1) ועכבר נגד עכבר CD1d שימשו.</li>
	<li>נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור ספציפיים לאיזוטיפים נוגדנים ראשוניים; כאן אנטי חולדה IgG מצומד אל Alexafluor 488 ו נגד עכבר IgG מצומד אל Alexafluor 647 שימשו.</li>
</ol>2. פרוטוקול
הכנה להכתמת נוגדנים
זריעת תאים
<ol><li>resuspend התאים של עניין בתקשורת הצמיחה.</li>
	<li>לאחר מכן, זרע 500 μL של השעיית התא / לכל באר לתוך בארות של שקופית תא 4-טוב. (כאן, תאי LCD1 נזרעו ב 2.5x105 תאים / תא ב 500 μL של מדיה צמיחה. צפיפות הזריעה עשויה להשתנות בין קווי תאים).</li>
	<li>לדגור על החלקה התא לילה באינקובטור 5% CO2 ב 37°C, כדי לאפשר לתאים לדבוק בכוס.</li>
	<li>למחרת, לשאוף את המדיה מכל באר ולאחר מכן לשטוף את התאים 1X עם 500 μL PBS.</li>
</ol>קיבוע
<ol start="5"><li>כדי לתקן את התאים, להוסיף 500 μL 1% פתרון paraformaldehyde לתוך כל באר ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לאחר הדגירה, לאסוף את paraformaldehyde לתוך מיכל פסולת נוזלית מסוכנת מתאימה.</li>
	<li>לאחר מכן, לשטוף את התאים 3 פעמים עם 500 μL PBS כדי להסיר את כל שרידי הקיבעון.</li>
</ol>פרמזביליזציה
<ol start="8"><li>Permeabilize התאים על ידי דגירה עם 500 μL permeabilization חוצץ / באר במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לאחר מכן, לשטוף את התאים לזמן קצר 3 פעמים עם 500 μL של PBS.</li>
</ol>חסימת
<ol start="10"><li>לדגור על התאים בכל באר עם 500 μL חסימת חוצץ במשך 1 שעה ב 4 ° C, כדי לחסום כריכת נוגדנים ספציפית.</li>
</ol>דגירה ראשונית של נוגדנים
<ol start="11"><li>שאף את מאגר החסימה מתאי השקופיות.</li>
	<li>לאחר מכן, להוסיף 500 μL של פתרון נוגדנים ראשוני מדולל לתאים. (כאן, אנטי CD107a (LAMP-1) היה מדולל 1:500 ו anti-CD1d שימש לא מדולל (נוגדן חד שבטי 1H6 סופק בחביבות על ידי ד"ר רנדי Brutkiewicz)).</li>
	<li>לדגור את השקופיות בלילה ב 4°C.</li>
</ol>הערה: אם אתם מחפשים יותר מיעד אחד, ודאו שהנוגדנים העיקריים הם איזוטיפים שונים. ריכוזי הנוגדנים המומלצים משתנים בין היצרנים ויש לתבל לפני השימוש.
דגירה משנית של נוגדנים
<ol start="14"><li>שאפו את תמיסת הנוגדנים העיקרית מהבארות.</li>
	<li>לשטוף את תאי הבאר 4 פעמים עם 500 μL PBS.</li>
	<li>לאחר מכן, להוסיף 500 μL של פתרון נוגדנים משני מדולל לכל באר. (כאן, הן הנוגדנים המשניים - אנטי עכבר IgG Alexafluor 647 ו נגד חולדה IgG Alexafluor 488 היו מדוללים 1:2000 במאגר חסימה).</li>
	<li>דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה בחושך.</li>
	<li>לאחר הדגירה, שאפו את תמיסה נוגדן משני.</li>
	<li>לשטוף את התאים 4 פעמים עם 500 μL PBS כדי להסיר כל נוגדן משני מאוגד.</li>
</ol>הערה: ריכוזי הנוגדנים המומלצים משתנים בין היצרנים ויש לצייץ לפני השימוש. אם מחפשים יותר מיעד אחד, יש להטות נוגדנים משניים לפלורופורים שונים עם ספקטרום עירור/פליטה ייחודי. כמו כן, זכור את העירור / פליטה של הנגד הגרעיני (כלומר DAPI) בעת בחירת פלואורופורים. בחירת פלואורופור עשויה להיות מושפעת מתצורת הלייזר של המיקרוסקופ הקונפוקלי המשמש. תצורת הלייזר של המכונה תכתיב אילו פלואורופורים מתאימים לניסוי.
3. כיסויי הרכבה
<ol><li>ראשית, הסר בזהירות את התאים מהשקופית.</li>
	<li>לאחר מכן, החזק את השקופית בזווית מעל מחיקת משימה עדינה והסר את הנוזל מהקצוות מבלי לגעת בתאים.</li>
	<li>הוסף טיפה אחת של מדיום הרכבה נגד דבק, המכיל את הכתם הגרעיני DAPI, על כל חלק של תאים.</li>
	<li>לאחר מכן, מניחים כיסוי 20 מ"מ x 60 מ"מ מעל השקופית על ידי החזקתה מעל הקצוות באמצעות קצות האצבעות. (הימנע היווצרות בועה על התאים, כפי שהם מפריעים הדמיה).</li>
	<li>נגב את כל מדיום הרכבה נוסף בצדדים עם ניגוב משימה עדין ולאחסן את השקופיות בחושך בטמפרטורת החדר עד שבוע.</li>
</ol>4. הדמיה קונפוקלית
דגימות תמונה על מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. לנתונים המוצגים באיור 2, נעשה שימוש ב-Nikon Eclipse Ti A1R עם תוכנת מחקר מתקדם של אלמנטים שקלים. הסעיף הבא מפרט את ההליך ללכידת תמונות באמצעות התוכנה הנ"ל.
<ol><li>כדי להתחיל להדמיה את התאים, פתחו אתתוכנת 'מחקר מתקדם של אלמנטים ש"ח'על ידי לחיצה על'סמל התוכנה NIS'.</li>
	<li>לאחר מכן, בחלון הבקרה לחץ על הכרטיסיה 'TiPad' ובחר את המטרה הרצויה להדמיה. (כאן, המטרה הראשונה 40x שימש).</li>
	<li>טען את השקופית עם תאים על הבמה ומרכז אותה מתחת לעדשה.</li>
	<li>עכשיו, בכרטיסייה 'A1plus Compact GUI', הגדר את הלייזרים המתאימים לפלורופורים המשמשים. לחץ על סמל גלגל השיניים כדי לפתוח את תפריט הצבע וההגדרות הספקטרליות ולבחור את הערוצים הדרושים ולהגדיר את הלייזר לכל ערוץ.</li>
	<li>לאחר מכן, בחר את הפליטות המתאימות בתפריט הנפתח תחת המראה הדיכרואית הראשונה.</li>
	<li>לאחר מכן, תחת חלון 'A1plus Compact GUI', לחץ על 'סדרת Ch.' כדי להגדיר את סדרת ערוצי הקו, המגדירה אם הלייזרים המשמשים יורים על המדגם בו זמנית או ברצף. (כאן נבחרו מעברים רצפים, החל מערוץ 1, ואחריו ערוץ 2, ואז 4).</li>
	<li>לאחר מכן, התחל לסרוק על-ידי לחיצה על סמל 'קצה החץ' בחלק העליון. בשלב זה, כאשר ההדמיה חיה, תחת חלון 'A1plus Compact GUI', לחץ על סולם ההזזה ושנה את גודל חור הסיכה כדי להבטיח הגבלה מחוץ לאור המיקוד. (כאן נעשה שימוש בהגדרה הזמינה הנמוכה ביותר (0.5).</li>
	<li>לאחר מכן, התאם את הגדרות 'המתח הגבוה' ו'היסט' מתחת לכל לייזר לרמות המתאימות, באמצעות סולמות ההזזה כדי לאפשר זיהוי של הכתמים הספציפיים תוך הגבלת כל כתמי רקע פוטנציאליים. אם קיימת דגימה עם כתמים חיוביים, התחל בהדמיית דגימה זו עבור כל ערוץ כדי לוודא שהגדרות הלייזר מניבות יחסי אות ורעשי אופטימליים. אזהרה: עוצמת לייזר גבוהה לתקופות ממושכות עלולה לגרום להלבנה.
</li>
	<li>לאחר הגדרת ערכי HV והיסט אופטימליים עבור כל לייזר, לחץ על הכרטיסיה 'רכישת ND' ולאחר מכן בחר את סמל 'Z' כדי להגדיר את הפרמטרים עבור סדרת z. לאחר מכן, בעת רכישת תמונה חיה של המדגם, הגדר תחילה את החלק התחתון על ידי מציאת תחתית התמונה ולחיצה על לחצן 'התחתון' ולאחר מכן מצא את המיקום העליון של המדגם ולחץ על לחצן 'עליון'. הגדר את גודל השלב על-ידי הקלדה ספציפית של גודל השלב המועדף ב- μm עבור כל שלב או על-ידי ציון מספר השלבים הכולל הדרושים.</li>
	<li>לאחר הגדרת הפרמטרים של סידרת z, בחרו ברזולוציית הגודל/הפיקסלים הרצויה של התמונה. כדי לעשות זאת, לחץ על החלון 'A1plus Compact GUI' ותחת הסמל 'גודל' בחר את הרזולוציה הרצויה. כדי להקטין את רעש התמונה, ניתן לבחור את התפריט הנפתח לצד הסימן 'ø' כדי לממוצע את מספר התמונות שנבחר.</li>
	<li>כעת, לחץ על הכרטיסיה 'הפעל כעת' בתפריט 'רכישת ND' כדי להתחיל להדמיה את הדוגמה.</li>
	<li>לאחר השלמת ההדמיה, שמור את התמונה על-ידי לחיצה על 'קובץ'ולאחר מכן 'שמירה בשם', אשר ייצא את קובץ התמונה עם הסיומת '.nd2'. לבסוף, חזור על התהליך עבור כל אחת מהדגימות האחרות.</li>
</ol>

כתמי פלואורסצנטי קונפוקלי הוא הליך פשוט יחסית המביא לתמונות באיכות גבוהה מאוד של דגימות המוכנות באופן דומה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית. בקצרה, הדגימות קבועות, מחלחלות, ואז נחסמות. נוגדנים ראשוניים נגד חלבון או חלבונים בעלי עניין מותרים להיקשר, ואז נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור משמשים כדי לדמיין את הכתמים. למיקרוסקופיית פלואורסצנטיות קונפוצלית יש יישומים בתחומים רבים של מחקר. לדוגמה, על ידי כתמים עבור סמנים של אברונים תת-תאיים יחד עם חלבון של עניין, מיקרוסקופיה קונפוקלית יכולה לשמש כדי לקבוע את המיקומים התת...

מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות קונפוקלית: טכניקה לקביעת לוקליזציה של חלבונים בפיברובלסטים של עכברים

Confocal Fluorescence Microscopy: A Technique to Determine the Localization of Proteins in Mouse Fibroblasts

מקור: דומיניק ר. בולינו1, אריק א. לגנצוב2, טוניה ג'יי ווב1 1 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מרילנד ומרכז הסרטן המקיף מרלן וסטיוארט גרינבאום, בולטימור, מרילנד 21201 2 המרכז להנדסה וטכנולוגיה ביו-רפואית, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מרילנד, בולטימור, מרילנד 21201
מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות קונפוקלית היא טכניקת הדמיה המאפשרת רזולוציה אופטית מוגברת בהשוואה למיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית קונבנציונלית "רחבת שדה". מיקרוסקופים קונפוקליים מסוגלים להשיג רזולוציה אופטית משופרת x-y באמצעות "סריקת לייזר" - בדרך כלל קבוצה של מראות מבוקרות מתח (מראות גלוונומטר או "גלבו") המכוונות את תאורת הלייזר לכל פיקסל של הדגימה בכל פעם. חשוב מכך, מיקרוסקופים קונפוקליים משיגים רזולוציה z-צירית מעולה באמצעות חור סיכה כדי להסיר מאורת מיקוד שמקורה במיקומים שאינם במישור z נסרקים, ובכך מאפשרים לגלאי לאסוף נתונים ממישור z שצוין. בגלל רזולוציית z גבוהה בר השגה במיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתן לאסוף תמונות מסדרה של z-planes (המכונה גם z-stack) ולבנות תמונה תלת-ממדית באמצעות תוכנה.
לפני דיון במנגנון של מיקרוסקופ קונפוקלי, חשוב לשקול כיצד מדגם אינטראקציה עם אור. האור מורכב מפוטונים, חבילות של אנרגיה אלקטרומגנטית. פוטון הפוחת במדגם ביולוגי יכול לקיים אינטראקציה עם המולקולות המרכיבות את המדגם באחת מארבע דרכים: 1) הפוטן אינו מתקשר ועובר דרך המדגם; 2) הפוטן משתקף / מפוזר; 3) הפוטון נספג על ידי מולקולה והאנרגיה הנספגת משתחררת כחום באמצעות תהליכים הידועים בשם ריקבון לא-רעיקטיבי; ו-4) הפוטן נספג והאנרגיה נספגת במהירות כפוטון משני בתהליך המכונה פלואורסצנטיות. מולקולה שהמבנה שלה מאפשר פליטת פלואורסצנטיות נקראת פלואורופור. רוב הדגימות הביולוגיות מכילות פלואורופורים אנדוגני זניחים; לכן פלואורופורים אקסוגניים חייבים לשמש כדי להדגיש תכונות של עניין במדגם. במהלך מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות, המדגם מואר באור של אורך הגל המתאים לספיגה על ידי הפלואורופור. עם ספיגת פוטון, פלואורופור הוא אמר להיות "נרגש" ואת תהליך הקליטה מכונה "עירור". כאשר פלואורופור מוותר על אנרגיה בצורה של פוטון, התהליך מכונה "פליטה", והפוטון הנפלט נקרא פלואורסצנטיות.
קרן האור המשמשת לרגש פלואורופור מתמקדת בעדשה האובייקטיבית של מיקרוסקופ ומתכנסת ב"נקודת מוקד "שבה היא ממוקדת באופן מקסימלי. מעבר לנקודת המוקד האור שוב מתפצל. ניתן לדמיין את הקורות הנכנסות והיוצאות כצמד קונוסים הנגעים בנקודת המוקד (ראו איור 1, החלונית השמאלית). תופעת עקיפה מטילה מגבלה על מידת ההדוקה של קרן אור יכולה להיות ממוקדת - הקרן מתמקדת למעשה בנקודה בגודל סופי. שני גורמים קובעים את גודל נקודת המוקד: 1) אורך הגל של האור, ו -2) את יכולת איסוף האור של העדשה האובייקטיבית, המאופיינת בצמצם המספרי שלה (NA). המוקד "ספוט" משתרע לא רק במישור x-y, אלא גם בכיוון z, והוא למעשה נפח מוקד. הממדים של אמצעי אחסון מוקדי זה מגדירים את הרזולוציה המרבית הניתנת להשגה על-ידי הדמיה אופטית. למרות שמספר הפוטונים הוא הגדול ביותר בנפח המוקד, נתיבי האור החרוטיים מעל ומתחת למוקד מכילים גם צפיפות נמוכה יותר של פוטונים. כל פלואורופור בנתיב האור יכול אפוא להתרגש. במיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית קונבנציונלית (רחבת-שדה), פליטה מפלואורופורים מעל ומתחת למישור המוקד תורמת פלואורסצנטיות מחוץ לפוקוס ("רקע מעורפל"), מה שמפחית את רזולוציית התמונה ואת הניגודיות, כפי שמדגים באיור 1, כאשר הקובייה האדומה מייצגת את פליטת הפלורופור מעל המישור המוקדי (כוכב אדום) שגורמת לפלאורסצנטיות מחוץ לפוקוס (מימין למעלה). בעיה זו משופכת במיקרוסקופיה קונפוצלית, עקב ניצול של חור סיכה. (איור 2, מימין למטה). כפי שמתואר באיור 3, חור הסיכה מאפשר לפליטות שמקורן במוקד להגיע לגלאי (משמאל), תוך חסימת הפלואורסצנטיות מחוץ לפוקוס (מימין) מלהגיע לגלאי, ובכך לשפר הן את הרזולוציה והן את הניגודיות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig1.jpg"> איור 1. רזולוציה אופטית של אפיפלואורסצנטיות לעומת מיקרוסקופיה קונפוקלית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
קרן האור המשמשת לרגש פלואורופור מתמקדת בעדשה האובייקטיבית של מיקרוסקופ ומתכנסת בנפח מוקד ואז מתפצלת (משמאל). הכוכב האדום מייצג את מישור המוקד של דגימה שתמונה בעוד הריבוע האדום מייצג פליטת פלואורופור מעל מישור המוקד. בעת לכידת תמונה של מדגם זה באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי, הפליטה מהכיכר האדומה מחוץ לפוקוס תהיה גלויה ותתרום ל"רקע מעורפל " (מימין למעלה). למיקרוסקופים קונפוקליים יש חור סיכה המונע גילוי אור הנפלט מחוץ למישור המוקד, ומבטל את "הרקע המעורפל" (מימין למטה).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig2.jpg"> איור 2. אפקט חור הסיכה במיקרוסקופיה קונפוקלית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
למרות שהעוצמה הגבוהה ביותר של אור העירור נמצאת במוקד העדשה (שמאל, אליפסה אדומה), חלקים אחרים של המדגם שאינם במוקד (ימין, כוכב אדום) יקבלו אור ופלואורסצ'ה. כדי למנוע אור הנפלט מאזורים אלה מחוץ לפוקוס כדי להגיע לגלאי, מסך עם חור סיכה נמצא מול הגלאי. רק האור בפוקוס (משמאל) הנפלט ממטוס המוקד מסוגל לנוע דרך חור הסיכה ולהגיע לגלאי. האור מחוץ לפוקוס (מימין) נחסם עם חור הסיכה ואינו מצליח להגיע לגלאי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig3.jpg"> איור 3. רכיבים עיקריים של מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
למען הפשטות, התיאור המכניסטי של מיקרוסקופ קונפוקל יהיה מוגבל לזה של ניקון אקליפס Ti A1R. למרות ייתכנו הבדלים טכניים קלים בין מיקרוסקופים קונפוקליים שונים, A1R משמש היטב כמודל טוב לתיאור פונקציית מיקרוסקופ קונפוקלית. קרן אור העירור, המיוצרת על ידי מערך של לייזרי דיודה, משתקפת על ידי המראה הדיכרואית העיקרית אל המטרה, הממקדת את האור על הדגימה המצולמת. המראה הדיכרואית הראשית משקפת באופן סלקטיבי את אור העירור ומאפשרת לאור באורכי גל אחרים לעבור דרכם. לאחר מכן, האור נתקל במראות הסריקה שסוחפות את קרן האור על פני הדגימה באופן x-y, ומאירות פיקסל יחיד (x,Y) בכל פעם. פלואורסצנטיות הנפלטת על ידי פלואורופורים בפיקסל המואר נאספה על ידי העדשה האובייקטיבית ועוברת דרך המראה הדיכרואית הראשית כדי להגיע למערך של צינורות פוטומולטיפלייר (PMTs). מראות דיכרואיות משניות מכוונות את נורית הפליטה אל ה-PMT המתאים. אור העירור הפזור על ידי המדגם בחזרה למטרה משתקף על ידי המראה הדיכרואית הראשית בחזרה לכיוון הדגימה, ובכך נמנע מלהיכנס לנתיב אור הזיהוי ולהגיע ל-PMTs (ראו איור 3). זה מאפשר את הפלואורסצנטיות החלשה יחסית להיות כימות ללא זיהום על ידי אור מפוזרים מן קרן אור העירור, שהוא בדרך כלל סדרי גודל אינטנסיביים יותר מאשר פלואורסצנטיות. מכיוון שחור הסיכה חוסם אור מחוץ לנפח המוקד, האור המגיע לגלאי מגיע ממטוס zצר ונבחר. לכן, ניתן לאסוף תמונות מסדרה של מטוסי zסמוכים; סדרת תמונות זו מכונה לעתים קרובות 'z-stack'. באמצעות התוכנה המתאימה, z-stack ניתן לעבד כדי ליצור תמונה 3D של הדגימה. יתרון מסוים של מיקרוסקופיה קונפוקלית הוא היכולת להבחין בין לוקליזציה תת-תאית של כתמים. לדוגמה, ההבחנה בין מכתים ממברנה מכתמים תאיים, וזה מאוד מאתגר עם מיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית קונבנציונלית (1, 2, 3).
הכנת מדגם היא היבט חשוב של הדמיה קונפוקלית. חוזק של טכניקות מיקרוסקופיה אופטית הוא הגמישות לתמונה של תאים חיים או קבועים. בעת ניסיון לייצר תמונות תלת-ממד, בגלל מספר התמונות שיש לרכוש עבור z-stack, הקושי לשמור על בריאות התא, ואת התנועה של תאים חיים organelles שלהם, השימוש בתאים קבועים אופייני. ההליך לתיקון והכתמת תאים לפלואורסצנטיות קונפוצלית דומה לזה המשמש באופן קונבנציונלי באימונופלואורסצנטיות. לאחר תרבית בשקופיות הקאמריות או על כיסויים, התאים קבועים באמצעות paraformaldehyde כדי לשמר את המורפולוגיה התאית. כריכת נוגדנים לא ספציפית נחסמת באמצעות אלבומין בסרום בקר, חלב או סרום רגיל. על מנת לשמור על הספציפיות של הנוגדנים המשניים, הפתרון המשמש לא צריך להיות מאותו מין שבו נוצרו הנוגדנים העיקריים. התאים דוגרים בנוגדנים ראשוניים שקושרים את האנטיגן של עניין. בעת סימון מספר מטרות תאיות, הנוגדנים העיקריים חייבים להיגזר כל אחד ממין אחר. נוגדנים המתייגים אנטיגן קשורים לאחר מכן בנוגדנים משניים מצומדים פלואורופור. נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור יש לבחור כך שהם תואמים לאורכי הגל של עירור לייזר זמין במיקרוסקופ הקונפוקלי. כאשר מדמיינים אנטיגנים מרובים, ספקטרום העירור/ הפליטה של הפלורופורים צריך להיות שונה מספיק, כך האותות שלהם ניתן להפלות על ידי ניתוח מיקרוסקופי. הדגימה המוכתמת מותקנת לאחר מכן על שקופית להדמיה. מדיום הרכבה משמש למניעת התייבשות של פוטו-דגימות. אם תרצה, ניתן להשתמש במדיום הרכבה המכיל כתם נגד גרעיני (למשל DAPI או Hoechst) (4).
בפרוטוקול הבא, פיברובלסטים עכבר transfected כדי לבטא CD1d (LCD1) היו מוכתמים בנוגדנים המזהים CD1d ו CD107a (LAMP-1). CD1d הוא קומפלקס היסטו-תאימות גדול 1 (MHC 1)דמוי קולטן נוכח על פני השטח של אנטיגן מציג תאים המציגים אנטיגנים שומנים בדם. LAMP-1 (חלבון ממברנה הקשורים ליזומלית-1) הוא חלבון טרנס-מברן הנמצא בעיקר בממברנות ליזומליות. עבור מצגת אנטיגן נכונה, CD1d נסחר דרך תא ליסומלי pH נמוך, כך LAMP-1 משמש כסמן של התא הליסומלי עבור פרוטוקול זה. על ידי בדיקות תאי LCD1 עם אנטי CD1d ו- ANTI-LAMP-1 שיוצרו במינים שונים, נוגדנים משניים עם פלואורופורים ייחודיים יכולים לשמש כדי לקבוע את לוקליזציה של כל חלבון בתא והאם CD1d קיים בתאים ליזוזום חיובי LAMP-1.

בניסוי זה, פיברובלסטים עכבר מבטאים את פני השטח גליקופרוטאין גן CD1d תוקנו, חיסונים ותמונה על מיקרוסקופ קונפוקלי. תמונה מייצגת המתקבלת באמצעות הפרוטוקול שלעיל מוצגת באיור 4. בחלונית העליונה של A מוצגות תמונות בעלות ערוץ יחיד המציגות את תבנית הכתמים של כל יעד בודד. תמונות אלה מהוות מקטע יחיד (פרוסה) של ערימת z שנלכדה. החלונית הימנית מציגה כתמי DAPI של גרעיני התאים. הלוחות המרכזיים מראים CD1d מוכתם באדום ו LAMP-1, סמן ליסום, מוכתם בירוק. החלונית השמאלית היא תמונה מורכבת שבה ממוזגים שלושת הער...

Source: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine ...

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית היא טכניקת הדמיה מיוחדת ללוקליזציה של חלבון או אנטיגן מעניין בדגימת תא או רקמה על ידי תיוג האנטיגן בצבע פלואורסצנטי מצומד נוגדן וזיהוי האות הפלואורסצנטי. הוא מציע רזולוציה מרחבית גבוהה יותר ממיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה, בעזרת שני חורים הממוקמים במישורי המוקד של עדשת האובייקטיב, מה שמעניק לה את השם קונפוקל. זה מאפשר למשתמשים לדמיין את הצביעה ברמה התת-תאית, כגון ההבחנה בין צביעת קרום פני השטח לצביעה תוך תאית. מיקרוסקופ קונפוקלי עוקב אחר עיקרון בסיסי דומה למיקרוסקופ פלואורסצנטי קלאסי. הקרן ממקור אור, בדרך כלל לייזר לקונפוקל, מוחזרת על ידי מראה דיכרואית וממוקדת על ידי עדשת אובייקט על הדגימה. אור זה מעורר את הפלואורופורים לפלוט אורך גל שונה, שנוסע בחזרה דרך עדשת האובייקט והמראה הדיכרואית למצלמה או לעינית. הרזולוציה המשופרת של מיקרוסקופ קונפוקלי נובעת בעיקר מנוכחותם של שני חורים, שהם חורים קטנים מאוד לאור לעבור דרכם בנתיבי האור העירור והפליטה. החורים ממוקמים אסטרטגית במישור המוקד של עדשת האובייקט. כעת, בואו נעבור לסכמת מבט מהצד של סידור המיקרוסקופ כדי לסקור את נתיב האור. לאחר שעברה דרך חור העירור, לאלומת אור העירור יש אפקט של מקורה בנקודת מוקד, המאפשרת לעדשת האובייקט למקד את האור גם לנקודה על הדגימה. אלומת הפליטה מנקודת מוקד זו מתכנסת בחור הפליטה, המאפשר לה לעבור דרכו. כעת במהלך העירור, פלואורופורים בתוך נתיב האור, מעל ומתחת לנקודת המוקד, גם הם נרגשים מעט. בעוד שאור הפליטה שמקורו בנקודת המוקד עובר דרך חור הסיכה, הפליטות מנקודות היציאה מהמיקוד מתכנסות לפני או אחרי חור הפליטה, ולכן נחסמות, וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות רקע מופחתת. יש לחזור על מחזור העירור-פליטה-זיהוי עבור כל נקודת הדמיה באזור העניין, מה שניתן לעשות בכמה דרכים שונות. לדוגמה, סריקת לייזר קונפוקלית משתמשת במראות סריקת גלוונומטר, המסיטות את אור העירור בזוויות שונות. לפיכך, סחף את קרן האור על פני הדגימה במישור XY. דיסק מסתובב קונפוקלי משתמש בדיסק עם מערך של חורים, המסתובב כדי להזיז את סידור החורים. זה מאפשר למשתמשים להאיר מספר נקודות הדמיה קטנות בדגימה בכל פעם, ולכסות בהדרגה את כל האזור בזמן שהדיסק מסתובב. כתוצאה מהחורים, תמונת ה-XY בגלאי מייצגת מישור Z צר. לכן, ניתן לאסוף תמונות מסדרה של מישורי Z עוקבים, המכונים לעתים קרובות מחסנית Z. מתמונות אלה, תוכנה מתאימה יכולה ליצור תיאור תלת מימדי של דפוס אות הקרינה בדגימה. בפרוטוקול זה, תצפו בצביעה חיסונית של פיברובלסטים של עכברים, ואחריה הדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לדמיין באופן דיפרנציאלי חלבון פני התא וחלבון ליזוזומלי. כדי להתחיל, באמצעות טכניקות סטריליות, השעו מחדש את התאים המעניינים ב-500 מיקרוליטר של מצע גידול לבאר, ולאחר מכן זרעו אותם לבארות של מגלשת תא של ארבע בארות. כאן, אנו משתמשים בפיברובלסטים של עכברים שעברו טרנספטציה כדי לבטא את המולקולה המציגה אנטיגן, CD1d. כדי לאפשר לתאים להיצמד לזכוכית, הנח את מגלשת החדר בחממה של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ודגר למשך הלילה. בבוקר יש לשאוב את המדיה מכל באר, ולאחר מכן לשטוף את התאים פעם אחת עם 500 מיקרוליטר PBS למשך מספר שניות. כדי לתקן את התאים, הוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסת פרפורמלדהיד 1% לכל באר, ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, אספו את הפרפורמלדהיד למיכל פסולת נוזלי מסוכנת מתאים, ולאחר מכן הסירו את שאריות הקיבוע על ידי שטיפת התאים שלוש פעמים עם PBS למשך מספר שניות. כדי לאפשר חדירת נוגדנים לתאים, הוסיפו 500 מיקרוליטר של מאגר חדירות לכל באר, ודגרו על הספסל למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר חדירה, יש לשטוף את התאים בקצרה שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר PBS. לאחר מכן, הוסיפו 500 מיקרוליטר של חוצץ חוסם לכל באר, ודגרו במשך שעה בארבע מעלות צלזיוס כדי למנוע קשירת נוגדנים לא ספציפיים. הכן את הנוגדנים העיקריים, anti-CD1d ו-anti-LAMP-1, בריכוזי עבודה מתאימים. לאחר מכן, שאפו את המאגר מהבארות וכסו את התאים בכל באר ב-500 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית מדוללת ולאחר מכן דגרו את המגלשה על משטח ישר למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, יש לדלל את הנוגדנים המשניים, במקרה זה נוגדן נגד עכבר ונגד חולדות עם תגים פלואורסצנטיים ברורים, בחסימת המאגר לריכוזי עבודה מתאימים. לאחר מכן, שאפו את תמיסת הנוגדנים העיקרית מהבארות ולאחר מכן שטפו את התאים ארבע פעמים עם 500 מיקרוליטר PBS. לאחר מכן, הוסיפו 500 מיקרוליטר מתמיסת הנוגדנים המשנית המדוללת לכל באר, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת בחושך. לאחר הדגירה, שאפו את תמיסת הנוגדנים המשנית ושטפו את הבארות ארבע פעמים עם 500 מיקרוליטר PBS כדי להסיר כל נוגדן משני לא קשור. כדי להרכיב את הדגימות לאחר הכביסה הסופית, נתק בזהירות והסר את התאים מהמגלשה. כדי להסיר את שאריות ה-PBS, החזק את השקופית בזווית מעל מגבון משימה עדין, והסר את הנוזל מהקצוות מבלי לגעת בתאים. לאחר הסרת ה-PBS העודף, הוסף טיפה אחת של אמצעי הרכבה נגד דהייה, המכיל את הכתם הגרעיני DAPI, על כל חלק של תאים. לאחר מכן, קח כיסוי בגודל 20 על 60 מילימטר, ובעזרת קצות האצבעות בלבד התחל להוריד את הכיסוי לאט משני הקצוות, תוך הקפדה על היווצרות בועות מעל התאים. נגב כל אמצעי הרכבה נוסף על השקופיות בעזרת משימה עדינה, נגב ואחסן את השקופיות בחושך בטמפרטורת החדר עד שבוע. כדי להתחיל בהדמיה של התאים, לחץ תחילה על סמל תוכנת NIS בשולחן העבודה. לאחר חלון הבקרה, לחץ על הכרטיסייה TiPad בחלק העליון ובחר את המטרה הרצויה להדמיה. לאחר מכן, טען את השקופית עם תאים על הבמה, ומרכז אותה מתחת לעדשה. לאחר מכן, בכרטיסייה A1plus Compact GUI לצד הכרטיסייה TiPad, הגדר את הלייזרים המתאימים לפלואורופורים המשמשים. לחץ על סמל גלגל השיניים כדי לפתוח את תפריט הגדרות הצבע והספקטרל. לאחר פתיחת תפריט הגדרות הצבע והספקטרום, בחר את הערוצים הדרושים והגדר את הלייזר עבור כל ערוץ. לאחר מכן, בחר את הפליטות המתאימות בתפריט הנפתח מתחת למראה הדיכרואית הראשונה. לאחר מכן, תחת חלון ממשק המשתמש הקומפקטי A1plus, לחץ על Ch.Series כדי להגדיר את סדרת ערוצי הקו, המגדירה אם הלייזרים המשמשים יורו על הדגימה בו זמנית או ברצף. לאחר מכן, התחל לסרוק על ידי לחיצה על סמל קצה החץ בחלק העליון. בשלב זה, בזמן שההדמיה פעילה, תחת חלון ממשק המשתמש הקומפקטי A1plus, לחץ על סולם ההזזה ושנה את גודל החור כדי להבטיח הגבלת אור לא ממוקד. לאחר מכן, התאם את הגדרות המתח הגבוה וההיסט מתחת לכל לייזר לרמות המתאימות על ידי שימוש בסולמות ההזזה כדי לאפשר זיהוי של הצביעה הספציפית תוך הגבלת כל כתמי רקע פוטנציאליים. אם דגימת צביעה חיובית זמינה, התחל בהדמיה של דגימה זו עבור כל ערוץ כדי לוודא שהגדרות הלייזר מניבות יחסי אות לרעש אופטימליים. לאחר הגדרת ערכי ה-HV וההיסט האופטימליים עבור כל לייזר, לחץ על הכרטיסייה רכישת ND ולאחר מכן בחר בסמל Z כדי להגדיר את הפרמטרים עבור סדרת z. לאחר מכן, בעת רכישת תמונה חיה של הדגימה, הגדר תחילה את החלק התחתון על ידי מציאת החלק התחתון של התמונה ולחיצה על הכפתור התחתון. לאחר מכן, מצא את המיקום העליון של המדגם ולחץ על הכפתור העליון. הגדר את גודל הצעד על ידי הקלדה ספציפית של גודל הצעד המועדף במיקרונים עבור כל שלב או על ידי ציון מספר השלבים הכוללים הדרושים. כדי לבחור את הגודל/רזולוציית הפיקסלים הרצויים של התמונה, לחץ על חלון ממשק המשתמש הגרפי הקומפקטי של Aiplus, ומתחת לסמל הגודל, בחר את הרזולוציה הרצויה. כדי להפחית את הרעש של התמונה, אתה יכול לבחור בתפריט הנפתח לצד סמל התטא כדי לחשב ממוצע של מספר התמונות שנבחר. לאחר מכן, לחץ על הפעל עכשיו הכרטיסייה בתפריט רכישת ND על מנת להתחיל לדמות את הדגימה. לאחר השלמת ההדמיה, שמור את התמונה על ידי לחיצה על קובץ ולאחר מכן שמור בשם, אשר ייצא את קובץ התמונה עם הסיומת dot-nd2. לבסוף, חזור על התהליך עבור כל אחת מהדגימות האחרות. בניסוי זה, פיברובלסטים של עכברים המבטאים את גן הגליקופרוטאין CD1d על פני השטח תוקנו, נצבעו במערכת החיסון וצולמו במיקרוסקופ קונפוקלי. תמונה זו מציגה קטע יחיד של מחסנית Z בהגדלה של פי 40, כאשר CD1d צבוע באדום. הדגימה הייתה מוכתמת ב-LAMP-1, סמן ליזוזומלי, בירוק. כתם גרעיני DAPI שימש להצגת גרעיני התאים. בתמונה מורכבת שבה שלושת הערוצים השונים ממוזגים, הופעת הצהוב נובעת מחפיפה של הערוצים האדומים והירוקים, ומציינת אזור שבו CD1d ו-LAMP-1 ממוקמים יחד בליזוזומים. אזורים שבהם קיים רק צבע אחד מצביעים על נוכחות של CD1d או LAMP-1 ללא לוקליזציה משותפת. תמונה זו מציגה עיבוד תלת מימדי של התאים שנבנו מתמונות שצולמו ב-z-stack ושיטה זו אפשרה בניית מבט מהצד של קבוצת תאים זו. התמונה הבאה מציגה פרוסה מתוך מחסנית ה-z בהגדלה של פי 100, ומדגימה את דפוסי הביטוי של שני החלבונים הללו בפירוט רב יותר. התיבה הוורודה המתוארת בצד ימין של התמונה מציגה את חתך הרוחב של קואורדינטת ה- x המסומנת על-ידי הקו הוורוד בתמונה, המייצג את התצוגה הצדדית בקו הוורוד. באופן דומה, התיבה הכחולה המתוארת בתחתית התמונה מציגה את חתך הרוחב של קואורדינטת y המסומנת על ידי הקו הכחול בתמונה, המייצג את המבט הקדמי בקו הכחול. העיבוד התלת-ממדי של תמונת z-stack מאפשר למשתמשים להציג את התמונה בתלת-ממד, תוך המחשה חזותית של כל המישורים x, y ו-z. זה יכול לשמש לחקר לוקליזציה משותפת של הכתמים השונים באזורים שונים בתוך התא.

confocal-fluorescence-microscopy-technique-to-determine-localization

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

ביולוגיה מתקדמת

Immunology

אימונולוגיה

confocal microscopy for protein localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell.

The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a molecule that can fluoresce. Because most biological samples have very little natural fluorescence, researchers usually add fluorescent labels to highlight the structures they want to study.

A confocal microscope focuses light into a small focal volume, not just a single point in the x-y plane. The size of that volume depends on the wavelength of light and the numerical aperture, or NA, of the objective lens. Light above and below the focal plane can still excite fluorophores, but the pinhole removes most of the unwanted emission before it reaches the detector.

Compared with conventional epifluorescence microscopy, this design reduces the hazy background caused by out-of-focus fluorescence. The result is sharper images and better contrast. Confocal microscopy also allows collection of images from a series of z-planes, called a z-stack, which can be processed into a 3D image with software.

The microscope described in the protocol uses diode lasers, a primary dichroic mirror, scanning mirrors, and photomultiplier tubes, or PMTs. The dichroic mirror reflects the excitation light into the objective while letting other wavelengths pass through. The scanning mirrors move the beam across the sample one pixel at a time, and the PMTs detect the emitted fluorescence. The pinhole and optical path also help keep scattered excitation light out of the detector so the weaker fluorescence signal can be measured more clearly.

One major advantage of confocal imaging is that it can separate membrane staining from intracellular staining more clearly than wide-field methods. This is useful when studying where a protein is found inside a cell. It is especially helpful when a 3D view is needed from a z-stack.

Preparing the sample is an important part of the process. For 3D imaging, fixed cells are often used because live cells can move and are harder to keep healthy while many z-planes are collected. Cells are grown on chamber slides or coverslips, fixed with paraformaldehyde, and blocked with bovine serum albumin, milk, or normal serum to reduce nonspecific antibody binding. The blocking solution should not come from the same species used to make the primary antibodies.

Next, the cells are stained with primary antibodies that bind the target antigen. If several targets are being labeled, each primary antibody must come from a different species. Fluorophore-conjugated secondary antibodies then bind the primary antibodies. Their excitation and emission properties must match the lasers on the confocal microscope, and the fluorophores should be different enough that the signals can be separated. A mounting medium is used to protect the sample from photobleaching and drying, and it may include a nuclear counterstain such as DAPI or Hoechst.

In the protocol shown here, mouse fibroblasts were made to express CD1d and were stained for CD1d and CD107a, also called LAMP-1. CD1d is a major histocompatibility complex 1, or MHC 1, like receptor that presents lipid antigens on antigen-presenting cells. LAMP-1 is a transmembrane protein found mainly in lysosomal membranes and serves as a marker for the lysosomal compartment. Because CD1d must travel through this low-pH compartment for proper antigen presentation, confocal imaging can show whether CD1d is present in LAMP-1-positive lysosomes.

Confocal Microscopy for Protein Localization

confocal-microscopy-for-protein-localization

flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

flow-cytometry-fluorescence-activated-cell-sorting-facs-isolation

Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

magnetic-activated-cell-sorting-macs-isolation-of-thymic-t-lymphocytes

Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

elisa-assays-indirect-sandwich-and-competitive

ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

elispot-assay-detection-of-ifn-secreting-splenocytes

ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

immunohistochemistry-immunocytochemistry-tissue-imaging-via-light

Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

antibody-generation-producing-monoclonal-antibodies-using-hybridomas

Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

immunofluorescence-microscopy-immunofluorescence-staining-paraffin

Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

immunoprecipitation-based-techniques-purification-endogenous-proteins

Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

cell-cycle-analysis-assessing-cd4-cd8-t-cell-proliferation-after

Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

adoptive-cell-transfer-introducing-donor-mouse-splenocytes-to-host

Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

assay-for-cell-death-chromium-release-assay-of-cytotoxic-ability

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

This collection covers many staple techniques of immunology labs, including the labeling and sorting of immune cells. It also demonstrates proliferation methods for immune cells and antibodies, as well as common assays for immune activity including ELISA. Finally, it demonstrates staining and imaging of immune tissue and cell samples.

See how confocal fluorescence microscopy uses lasers, a pinhole, and z-stacks to reveal protein location in mouse fibroblasts and other cells.

Confocal Microscopy for Protein Localization

Description

Transcript

Tags