Name: chromium release assay for immune cell killing
Uploaded: 2023-04-30T07:09:15.000Z
Duration: 11 min 48 s
Channel: JoVE

מבט כולל על שגרה
ההסתה האופיינית של 51Cr-release למדידת מוות תאי כוללת את השלבים הבאים:
<ol><li>ראשית, תאי היעד מסומנים עם Na2[51Cr]O4. זה מבדיל אותם מתאי האפקטים שבבחינה.</li>
	<li>בעוד שתאי היעד מתייגים, התאים האפקטור נאספות, ובאמצעות טכניקת הדילול הסדרתי, ירידה בטיטורציה של תאי האפקטור נוצרת בלוח בדיקת תחתון עגול של 96 באר.</li>
	<li>בסוף תיוג תא היעד, התאים נשטפים תחילה ולאחר מכן מספר קבוע של תאים מתווספים ללוח בדיקת ה- assay שכבר מכיל סדרה של דילול תאים משפיעים.</li>
	<li>לאחר מכן, תערובת התאים של אפקט היעד מודגרת לפרק זמן מוגדר כדי לאפשר אינטראקציה מספקת בתאים עם תאי היעד, כדי לתווך תמה של תאים.</li>
	<li>לבסוף, תרבות-העל נקצרים ונאספים לצינורות. כמות 51Cr היא כמות באמצעות מונה גמא.</li>
	<li>בסוף, הנתונים נאספים ומשמשים לחישוב "תמוגת התא הספציפית באחוזים" של תאי היעד.</li>
</ol>1. תיוג תאי יעד עם 51Cr
<ol><li>כדי להתחיל, להכין את תאי היעד, (כאן - קו תא מלנומה אנושי WM793), לתוך השעיית תא יחיד.</li>
	<li>כדי לעשות זאת, ראשית להסיר את המדיה מן בקבוקון תרבית הרקמות.</li>
	<li>לאחר מכן, לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של 1X PBS.</li>
	<li>Trypsinize התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של טריפסין לצלחת במשך ~ 2 דקות.</li>
	<li>הקש בעדינות על הבקבוק כדי לשחרר את התאים מפני השטח הבקבוקון.</li>
	<li>הוסף 5 מ"ל של מדיית RPMI לבקבוקון והעבר את המדיה למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים.</li>
	<li>לאסוף את השעיית התא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל וצנטריפוגה השעיית התא במשך 5 דקות ב 1200 סל"ד. דקאנט סופר-טבעי.</li>
	<li>הוסף 10 מ"ל של מדיה לכדור וצינור בעדינות את המדיה למעלה ולמטה כדי להביא את התאים להשעיה.</li>
	<li>לקבוע את ריכוז התא באמצעות hemocytometer.</li>
	<li>העבר 1x106 תאים לתוך צינור חרוט חדש 15 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגות מתלה התא במשך 5 דקות ב 1200 סל"ד decant supernatant.</li>
	<li>מערבולת בקצרה את הצינור כדי resuspend גלולה התא בנפח הקטן של בינוני נשאר מאחור.</li>
	<li>הוסף 100 μCi של 51Cr ישירות להשעיית תא היעד WM793. הערה: צריך להיות שטח מעבדה ייעודי שהוקם לרדיואקטיביות המסוימת. בנוסף, צריך להיות מיגון עופרת בשפע לאחסון בטוח ושימוש ב- 51Cr במהלך כל השלבים, כמו גם שילוט מתאים כדי לציין היכן נשמרות דגימות עם 51Cr. מונה גייגר המצויד בגשושית פנקייק הוא גם הכרחי, לסקר את המרחב לזיהום אפשרי.
</li>
	<li>הוסף חתיכה קטנה של סרט רדיואקטיבי לצינור כדי לציין כי הצינור הוא עכשיו רדיואקטיבי.</li>
	<li>מניחים את הצינור באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם מגן עופרת ודגרה למשך שעה אחת. תעיף את הצינור כל 15-20 דקות כדי להגדיל את ספיגת תאי המטרה של הכרום.</li>
	<li>לאחר תקופת הדגירה, לשטוף את תאי היעד עם 5 מ"ל של FBS כדי להסיר כל עודף 51Cr.</li>
	<li>צנטריפוגות התאים ב 1200 סל"ד במשך 5 דקות. דקאנט רדיואקטיבי FBS לשטוף לתוך מיכל פסולת מתאים.</li>
	<li>respend הכדור ולשטוף בפעם השנייה עם FBS. בדוק את הכדור עבור רדיואקטיביות משולבת באמצעות מונה גייגר.</li>
	<li>Resuspend הכדור במדיום מלא 10 מ"ל, השגת ריכוז תא של 105 תאים / מ"ל. הערה: שלב ספירת התאים לאחר תיוג 51Cr מושמט כאן בעיקר מטעמי בטיחות. ניתן להניח כי ריכוז התא WM793 זהה כפי שהיה לפני תיוג 51Cr.
</li>
</ol>2. הכנת תאים משפיעים
<ol><li>ניתן להשתמש במגוון תאים משפיעים, כגון תאי T אנושיים או עכבר ותאי NK. בדוגמה זו, PBMCs, מבודדים מדם שלם על ידי צנטריפוגה הדרגתית צפיפות סטנדרטית (לריכוז של 5x106), שימשו.</li>
	<li>כדי להתחיל, להוסיף 100 μL של תרבית רקמות בינוני לכל באר של אחת השורות (כאן שורה A, ראה טבלה 1) של צלחת עגולה 96-היטב. כאן, לא מתווספים תאים משפיעים, והם ישמשו "ריק" לקביעת "שחרור מינימום / ספונטני 51Cr" מתאי היעד.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10505/10505table1.jpg"> טבלה 1: 51Cr לשחרר פריסת assay: שורה A- תאים היעד (104 תאים / 100 μL) דגירה עם מדיה בלבד (יוצר 'ריק' לקביעת "שחרור מינימום / ספונטני 51Cr"). שורות B עד C - בארות המכילות אפקט שונה: יחסי תא יעד (E:T), הנעים בין 50:1 ל- 1.5:1. שורה H - תאי יעד (104 תאים /100 μL) דגירה עם 1% NP-40 (NP-40 lyses את תאי היעד, יצירת "מקסימום או סך של 51שחרור Cr"). כל יחס E:T נבדק משולש עבור כל מצב ניסיוני. מחשבי PBMCs ומחשבי PBM בעלי גירוי של עמודה 1-3 ומחשבי PBMC מגורה CPG. 
<ol start="3"><li>לאחר מכן, ליצור דילול תאים סדרתיים פי 2 של מחשבי ה- PBMCs (במשולש עבור כל מצב ניסיוני), כדי להשיג ריכוז תא אפקט הנע בין 5x105 ל 15,625 תאים / 100 μL של מדיה (כאן שורות B עד G). הערה: בדוגמה זו, המחולל ההתחלתי: יחס תא היעד (E: T) הוא 50:1. עם זאת, ניתן להתאים יחס זה בהתאם לפרטים הניסיוניים.
</li>
	<li>השאר את השורה האחרונה ריקה (כאן שורה H) על-ידי אי הוספת תאים משפיעים לבארות אלה. (שורה זו תשמש ליצירת "ספירות כוללות/דקות, או (ג. p.m)" או "מהדורת 51Cr המרבית").</li>
	<li>מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס עד שתאי היעד מוכנים להוספתם.</li>
</ol>3. הוספת 51Cr שכותרתו WM793 תאי יעד לאסאי
<ol><li>לאחר תקופת הדגירה, להסיר את תאי היעד מן האינקובטור לשטוף עם 5 מ"ל של FBS כדי להסיר כל עודף 51Cr.</li>
	<li>צנטריפוגה התאים ב 1200 סל"ד במשך 5 דקות, באמצעות צנטריפוגה ייעודית.</li>
	<li>הסר את שטיפת FBS (supernatant רדיואקטיבי) לתוך מיכל פסולת מתאים.</li>
	<li>חזור על שלב הכביסה על ידי שימוש חוזר את הכדור ב 5 מ"ל טרי של FBS.</li>
	<li>צנטריפוגות התאים שוב ב 1200 סל"ד במשך 5 דקות.</li>
	<li>לבסוף, respend הכדור ב 10 מ"ל של מדיום מלא.</li>
	<li>יוצקים את ההשעיה של תא WM793 עם תווית 51Cr (105 תאים/מ"ל) למאגר ריאגנט חד פעמי.</li>
	<li>לאחר מכן, הוסף 100 μL של תאי יעד אלה שכותרתו, לכל באר של לוח התאים אפקט 96-well, באמצעות pipette רב ערוצי.</li>
	<li>לאחר מכן, להוסיף 100 μL של 1% NP-40 (במים) לשורת הבארות כי הם נטולי כל תאים אפקט (כאן שורה H). 1% NP-40 יהיה ליזה את תאי היעד, ולכן בארות אלה ישמשו פקדים כדי לקבוע את "ספירה כוללת / דקה, או (c. p.m)" או את המהדורה המרבית 51Cr.</li>
	<li>אבטחו את המכסה לצלחת על ידי הוספת פיסת סרט קטנה חדירת גז לכל צד של הצלחת ומניחים פיסת סרט רדיואקטיבי על המכסה כדי לציין שהיא מכילה 51Cr.</li>
	<li>בקצרה, צנטריפוגה הצלחת ב 1200 סל"ד. אם נעשה שימוש בלוח ניסוי אחד בלבד, הוסיפו צלחת איזון לצנטריפוגה. הערה: חשוב להשתמש בצנטריפוגה המסומנת לטיפול בדגימות רדיואקטיביות.
</li>
	<li>מוציאים את הצלחת מהצנטריפוגה.</li>
	<li>מניחים את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם חתיכת עופרת קטנה שמגנה על הצלחת לבטיחות נוספת. דגירה במשך 16 שעות כדי לאפשר תמה של תאי היעד. הערה: תקופת הדגירה יכולה להשתנות בין 4 ל 18 שעות בהתאם לתאי האפקטים המשמשים ומנגנון פוטנציאלי של הרג מועסק.
</li>
</ol>4. קצירת סופרנטנטים
<ol><li>בסוף תקופת הדגירה, להסיר בזהירות את הסרט סביב קצה הצלחת ולהסיר את המכסה.</li>
	<li>לאחר מכן, מניחים את מסגרת הקציר על הצלחת, ומוודאים לאשר כי דיסקי המסנן הקטנים נמצאים במקום עבור כל אחד מצעי הכותנה. זה יבטיח את האוסף של סופרנט ללא תאים.</li>
	<li>עכשיו, לאט ובעדינות לחץ על תקעי הכותנה לתוך בארות.</li>
	<li>לאחר כ -10 שניות, לשחרר את הלחץ על תקעים כותנה ולאחר מכן להעביר את תקעים כותנה לרצועות צינור.</li>
	<li>מניחים כל אחד מהצינורות האלה לתוך צינור FACS משני.</li>
	<li>לבסוף, לטעון צינורות FACS על מונה גמא ולהפעיל את הדגימות כדי כמות של 51Cr שוחרר בכל תנאי. דגימות נמדדות בדרך כלל במשך דקה אחת, ומאפשרות קביעה קלה של "ספירות / דקה".</li>
	<li>בזהירות, להקליט את הסדר שבו הצינורות היו טעונים לתוך הדלפק.</li>
</ol>5. ניתוח נתונים
<ol><li>כאן, מחשבי PBMCs לא מנוסים נוספו לשלוש העמודות הראשונות, ומחשבי PBMCs מגורה CpG (CpG ODN, (1 מיקרוגרם/מ"ל) עבור 24 שעות) נוספו לעמודות 4-6. ראה טבלה 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>1251</td>
			<td>1157</td>
			<td>1086</td>
			<td>917</td>
			<td>1118</td>
			<td>1140</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>1832</td>
			<td>1986</td>
			<td>1971</td>
			<td>7629</td>
			<td>7913</td>
			<td>8180</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>1677</td>
			<td>1739</td>
			<td>1428</td>
			<td>5454</td>
			<td>5055</td>
			<td>5268</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>1638</td>
			<td>1552</td>
			<td>1734</td>
			<td>4239</td>
			<td>3582</td>
			<td>3786</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>1658</td>
			<td>1580</td>
			<td>1339</td>
			<td>2818</td>
			<td>2623</td>
			<td>2750</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>1579</td>
			<td>1472</td>
			<td>1483</td>
			<td>2028</td>
			<td>1779</td>
			<td>1769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>G</td>
			<td>1326</td>
			<td>1325</td>
			<td>1184</td>
			<td>1801</td>
			<td>1654</td>
			<td>1565</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>H</td>
			<td>9220</td>
			<td>9367</td>
			<td>8067</td>
			<td>8774</td>
			<td>9647</td>
			<td>8236</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>אני</td>
			<td colspan="2">ממוצע של A1,A2,A3 -&gt;</td>
			<td>1164.67</td>
			<td>סי.פי ספונטני.m</td>
			<td></td>
			<td>1058.33</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>J</td>
			<td colspan="2">ממוצע של B1,B2,B3 -&gt;</td>
			<td>1929.67</td>
			<td>9.91%</td>
			<td></td>
			<td>7907.33</td>
			<td>87.50%</td>
			<td>50:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>K</td>
			<td colspan="2">ממוצע של C1,C2,C3 -&gt;</td>
			<td>1614.67</td>
			<td>5.83%</td>
			<td></td>
			<td>5259</td>
			<td>53.67%</td>
			<td>25:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>L</td>
			<td colspan="2">ממוצע של D1,D2,D3 -&gt;</td>
			<td>1641.33</td>
			<td>6.17%</td>
			<td></td>
			<td>3869</td>
			<td>35.91%</td>
			<td>12.5:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>M</td>
			<td colspan="2">ממוצע של E1,E2,E3 -&gt;</td>
			<td>1525.67</td>
			<td>4.68%</td>
			<td></td>
			<td>2730.33</td>
			<td>21.36%</td>
			<td>6.25:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>N</td>
			<td colspan="2">ממוצע של F1,F2,F3 -&gt;</td>
			<td>1511.33</td>
			<td>4.49%</td>
			<td></td>
			<td>1858.67</td>
			<td>10.22%</td>
			<td>3.12:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>O</td>
			<td colspan="2">ממוצע של G1,G2,G3 -&gt;</td>
			<td>1278.33</td>
			<td>1.47%</td>
			<td></td>
			<td>1673.33</td>
			<td>7.86%</td>
			<td>1.56:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>P</td>
			<td colspan="2">ממוצע H1,H2,H3 -&gt;</td>
			<td>8884.67</td>
			<td>מקסימום C.p.m</td>
			<td></td>
			<td>8885.67</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Unstim PBMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CpG-stim PBMC</td>
			<td>יחס E:T</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: 51Cr לשחרר נתוני צ'ק: ערכי נתונים 'ספירה לדקה' / 'c. p.m', ערכי c. p.m ממוצעים וערכי תמותה ספציפיים באחוזים מחושבים.
<ol start="2"><li>הנתונים שנאספו (ספירות לדקה, כלומר.c.p.m) הוזנו לתאי גיליון אלקטרוני באותו אופן שבו הדגימות הונחו בלוח המקורי.</li>
	<li>ראשית, הממוצעים של הטריפליקאטים חושבו. טבלה 2 - תאים I3 עד P3, עבור מחשבי PBMCs ותאים לא מנוסים I6 עד P6, עבור מחשבי PBMC מגורה CpG.</li>
	<li>לאחר קביעת הממוצעים, אחוז תמיסת הספציפית עבור כל תנאי חושב באמצעות הנוסחה הבאה- <img src="/files/ftp_upload/10505/10505eq1.jpg">
</li>
	<li>אחוז תמוגה ספציפית חושב עבור כל תנאי (טבלה 2 - תאים J4 עד O4, עבור מחשבי PBMCs unstimulated ו- J7 ל- O7, עבור מחשבי PBMCs לא מנוסים).</li>
</ol>

ההבחנה המתוארת כאן יש גמישות רבה, כמו מגוון של אפקט ותאי יעד ניתן להשתמש בהתאם לשאלה הנשאלת. לדוגמה, הספציפיות לתאי האפקטים יכולה להיקבע על ידי שימוש בתאי מטרה שונים או מנגנון של הרג תאים משפיע יכול להיקבע על ידי שימוש בתאים לקויים בחלבונים ספציפיים או באמצעות מעכבים ספציפיים לחלבון. בעיה מרכזית עם 51Cr שחרור assay הוא הפוטנציאל לשיעורי שחרור ספונטניים גבוהים על ידי תאי היעד. כאשר תרבית לבד (ללא תאים אפקט), שחרור ספונטני של 51Cr על ידי תאי היעד צריך להיות באופן אידיאלי לא יותר מ 30% של שחרור הכולל (...

ת לבדיקת מוות בתא: כרום שחרר את ההסתה של היכולת הציטוטוקסית

Assay for Cell Death: Chromium Release Assay of Cytotoxic Ability

מקור: פרנסס נגד סג'אאסטד1,2,ויטני סוונסון2,3ותומאס ס. גריפית'1,2,3,4 1 מיקרוביולוגיה, אימונולוגיה, ותוכנית לתואר שני בביולוגיה של הסרטן, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455 2 המרכז לאימונולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455 3 המחלקה לאורולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455 4 מרכז הסרטן הבונים החופשיים, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
אחת הפונקציות העיקריות של תאי מערכת החיסון היא להסיר תאי יעד שנדבקו בווירוסים או עברו טרנספורמציה לתא גידול. מביכה לבדיקות למדידת היכולת הציטוטוקסית של תאי מערכת החיסון היו מרכיב עיקרי במעבדות במשך שנים רבות. בדיקות אלה שימשו כדי לקבוע את היכולת של תאי T, תאי NK, או כל תא חיסוני אחר להרוג תאי מטרה באופן אנטיגן ספציפי או לא ספציפי. ליגנדים של מוות (למשל, ליגנד פאס או TRAIL), ציטוקינים (למשל, IFNg או TNF), או גרגירים ציטוטוקסיים (כלומר, perforin/granzyme B) המובעים על ידי תאים משפיעים הן כמה דרכים שבהן מוות תאי היעד יכול להיגרם. עם הפיצוץ במחקר אימונותרפי הגידול בשנים האחרונות, יש עניין גובר במציאת סוכנים כדי להגביר את הפעילות הציטוטוקסית של תאי החיסון כדי לשפר את תוצאות המטופל. לעומת זאת, מחלות מסוימות מסומנות על ידי פעילות מוגזמת של פעילות ציטוטוקסית של תאי מערכת החיסון, וכתוצאה מכך מאמצים לזהות סוכנים למתן תגובות אלה. לכן, לאחר מבחן שבו המשתמש יכול בקלות לשלב כל מספר של תאים משפיעים שונים, תאי יעד, ו / או מכפילי תגובה לתוך העיצוב הניסיוני יכול לשמש כאמצעי יקר ערך להערכה מהירה של היכולת הציטוטוקסית של תאים אפקטים ו / או התגובה של תא היעד.
בדיקות במבחנה אלה כרוכות בערבוב של אוכלוסיות תאים שונות, כמו גם באמצעות מספר נמוך יחסית של תאים משפיעים ויעד. לכן, אחד הצורך של ה- assay הוא לתייג את תאי היעד באופן שניתן לזהות בקלות כמות, ומאפשר למשתמש אז לקבוע את "אחוז תמוגה ספציפית" בתיווך התאים המשפיעים. רדיואקטיביות - במיוחד, כרום 51 (51Cr) בצורה של Na251CrO4- היא דרך זולה לתייג במהירות ולא מדעית חלבונים תאיים בתוך תאי היעד (1). התיוג הקצר ואת זמני ההסתה הכוללת מקטין את הפוטנציאל לשינויים משמעותיים במספר ו /או פנוטיפ של תאי היעד, אשר יכול להשפיע על התוצאה של ההסתה. עם אובדן שלמות הממברנה של תאי היעד כתוצאה מהפעילות הציטוטוקסית של התאים האפקטורקטיביים, 51החלבונים התאיים המסומנים על-ידי Cr בתוך תאי היעד משתחררים לתוך ה- supernatant התרבותי, הופכים לזמינים לכמות. כמו בכל בדיקה הבוחנת את תפקוד תאי החיסון במבחנה, ישנם מספר שיקולים חשובים לשקול שיפור ביצועי הניסוי. אחת התכונות הקריטיות ביותר היא להשתמש במשפיע בריא (לפעילות ציטוטוקסית מקסימלית) ולמקד (להיענות מקסימלית ומוות ספונטני מינימלי/51Cr שחרור) תאים. נדרש מגע עם אפקט ותא יעד (מה שמוביל לשימוש נפוץ בלוחות עגולים בני 96 בארות כדי לעודד מגע בין תאים) (2). לבסוף, ניתוח הנתונים תלוי בהכללה של אוכלוסיות תאי יעד שליטה חיובית ושלילית.
הפרוטוקול הבא יתווה את השלבים לביצוע בדיקת שחרור סטנדרטית של 51Cr כדי למדוד את היכולת הציטוטוקסית של אוכלוסייה של תאים משפיעים, אם כי לאחרונה פותחה גרסה לא רדיואקטיבית באמצעות Europium. 51 Cr הוא פולט קרינת γ רב עוצמה. כתוצאה מכך, השימוש בבדיקה זו דורש אימון בטיחות קרינה נאות, שטח מעבדה ייעודי, מונה גמא וסילוק דגימות רדיואקטיביות.
רצף האירועים הכללי בבחינה זו הם: 1) להכין 51מטרות מתויגות Cr; 2) להכין תאים אפקט ולהוסיף צלחת בזמן תאי היעד הם תיוג; 3) להוסיף יעדים מסומנים לצלחת; 4) צלחת דגירה; 5) קציר סופר-טבעי; ו-6) לנתח נתונים לאחר הפעלת דגימות על מונה. דגימות מוכנות בדרך כלל במשולש, ולאחר מכן ממוצע להסביר את כל הבדלי pipetting עדין.
PPE נכון חשוב לבדיקה זו. באופן ספציפי, המשתמש צריך ללבוש חלוק מעבדה וכפפות. משקפי בטיחות עשויים להידרש על בסיס המעבדה או המוסד. צריך להיות מיגון עופרת בשפע לאחסון בטוח ושימוש ב- 51Cr במהלך כל השלבים. לבסוף, צריך להיות שטח מעבדה ייעודי וציוד להפריש לשימוש 51Cr, כולל כל השילוט הנכון כדי לציין היכן נשמרות דגימות עם 51Cr ודלפק גייגר מצויד בגשושית גמא כדי לסקור את החלל לזיהום אפשרי.
בתרגיל מעבדה זה, אנו נקבע את היכולת של תאים מונוניקלאריים אנושיים לדם היקפי (PBMCs), (CpG מגורה לעומת unstimulated) להרוג תאי מלנומה, באמצעות קו תא מלנומה אנושי WM793 כמודל ואת בדיקת שחרור כרום.

בדוגמה זו, תאים משפיעים מגורה עם CpG (איור 1, עיגולים שחורים) הרגו את תאי היעד בצורה יעילה יותר, ככל שהיחס בין התאים האפקטיביים לתאי היעד גדל. עלייה זו לא נצפתה PBMCs unstimulated (עיגולים לבנים),המציין כי גירוי CpG נחוץ עבור הגידול שנצפה תמוגה תא היעד.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10505/10505fig1.jpg"> איור 1: 51Cr assay פיזור עלילה: פעילות גידול על ...

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

בסרטון זה תוכלו לראות כיצד לבצע את בדיקת שחרור הכרום ולקבוע את הפוטנציאל הציטוטוקסי של תאי האפקטור. תאי חיסון אחראים על זיהוי והסרה של תאים שעלולים להזיק, כמו סרטן או תאים נגועים בנגיף, מהגוף, שהם חלק בלתי נפרד מהתגובה החיסונית. למספר תאי חיסון, כמו תאי T ותאי NK, יש תכונה המכונה פוטנציאל ציטוטוקסי, שהיא היכולת לזהות תאי מטרה ולהפריש חלבונים הגורמים לפירוק חלבונים, ליזה ומוות של תאי המטרה הללו. כימות פוטנציאל ציטוטוקסי הוא קריטי למדידת הפעלה ועוצמה של תאי חיסון, ובדיקת שחרור הכרום משמשת בדרך כלל למטרה זו. שיטה זו מאפשרת למשתמשים להשוות ציטוקסיות הנגרמת על ידי סוגים ספציפיים של תאים חיסוניים בתנאים שונים, דבר בעל ערך לחקר אימונותרפיה של סרטן ומחלות הקשורות למערכת החיסון. ראשית, תאי המטרה, כמו תאי סרטן, מודגרים עם איזוטופ רדיואקטיבי, כרום 51, שנקלט על ידי התאים. לאחר מכן, תאים אלה המסומנים ברדיו עוברים תרבית משותפת עם תאי החיסון המבודדים המעניינים, הנקראים גם תאי אפקטור, בצלחת תחתית עגולה עם 96 בארות כדי להקל על האינטראקציה בין שני סוגי התאים. המערך הכולל של הבדיקה כולל דגירה של מספר מסוים של תאי מטרה עם ריכוזים שונים של תאי החיסון, יחד עם בקרות מתאימות. התרבות המשותפת מאפשרת לתאי האפקטור לגרום לאפופטוזיס וליזה בתאי המטרה, וכתוצאה מכך לשחרר את הכרום התוך-תאי 51 לתוך הסופרנטנט. לאחר מכן, בנקודת זמן אופטימלית מראש, הסופרנטנט המכיל את הכרום המשוחרר נקצר מכל הבארות. הכרום 51, בהיותו רדיואקטיבי, עובר דעיכה רדיואקטיבית באופן ספונטני כדי לפלוט קרינת גמא. רמות קרינת הגמא בסופרנטנטים מכל הבארות בלוחית הבדיקה מייצגות תפוקה ניתנת לכימות של הליזיס של תאי המטרה. זה נמדד באמצעות מונה גמא, המשמש לאחר מכן לקביעת הפוטנציאל הציטוטוקסי של תאי החיסון. כדי להתחיל, תאי המטרה, קו תאי מלנומה אנושיים WM793 בדוגמה זו, מוכנים לתרחיף תא בודד. לשם כך, הסר תחילה את המדיה מבקבוק תרבית הרקמות ושטוף את התאים בחמישה מיליליטר של 1X PBS. רוקנים את ה-PBS ואז מוסיפים מיליליטר אחד של טריפסין לצלחת למשך כשתי דקות. הקש בעדינות על הבקבוק כדי לשחרר את התאים ממשטח הבקבוק ולאחר מכן הוסף חמישה מיליליטר של מדיה RPMI לבקבוק. פיפטו את המדיה למעלה ולמטה כדי לאסוף את התאים ולהוסיף את התרחיף הזה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. הנח את הצינור בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-1200 סל"ד. לאחר מכן, הסר את המדיה מהצינור והקפד לא לשבש את גלולת התא. החלק בעדינות את תחתית הצינור כדי לשבש את גלולת התא והוסף 10 מיליליטר מדיה לצינור. לאחר מכן, פיפטה בעדינות את המדיה למעלה ולמטה כדי להביא את התאים לתרחיף. לאחר מכן, קבע את ריכוז התא באמצעות המוציטומטר והעביר שני מיליליטר של תרחיף התא המקורי לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר. הכניסו את הצינור לצנטריפוגה וגלו את התאים במהירות של 1200 סל"ד למשך חמש דקות. לאחר הצנטריפוגה, שפכו את עודפי המדיה מהצינור למיכל פסולת. מערבב לזמן קצר את הצינור כדי להשעות מחדש את כדור התא בנפח הקטן של המדיום שנותר מאחור. לאחר מכן, התכוננו לשימוש בכרום 51 על ידי מעבר לחלל מעבדה המוקדש לרדיואקטיביות מסוימת זו. צריך להיות מיגון עופרת בשפע לאחסון ושימוש בטוח בכרום 51 במהלך כל השלבים, כמו גם שילוט מתאים כדי לציין היכן נשמרות דגימות עם כרום 51. דלפק גייגר המצויד בבדיקת פנקייק נחוץ גם כדי לשרת בחלל לזיהום אפשרי. לאחר ההגדרה לשימוש נכון ברדיואקטיביות, הוסף 100 מיקרוקוריות של כרום 51 ישירות לתרחיף תא המטרה. לאחר מכן, הוסף חתיכה קטנה של סרט רדיואקטיבי לשפופרת כדי לציין שהדגימה והשפופרת הם כעת רדיואקטיביים. הנח את הצינור באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם מגן עופרת ודגירה למשך שעה, תוך החלקת הצינור כל 15 עד 20 דקות. בזמן שתאי המטרה מתויגים, הכינו תרחיף תא בודד של תאי אפקטור. בדוגמה זו, תאים חד-גרעיניים מדם היקפי אנושי, או PDMCs, בודדו מדם מלא על ידי צנטריפוגה שיפוע בצפיפות סטנדרטית לריכוז של 5 כפול 10 עד ה-6. העבירו את מתלה תא האפקטור הזה למאגר ריאגנט חד פעמי ולאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטר של מתלה זה לכל באר בשורה B בצלחת תחתונה עגולה של 96 בארות. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר RPMI לכל באר בשורה C עד G של הצלחת. כעת, התחל לבצע דילולים סדרתיים של ה-PBMCs כדי לקבל מגוון של מספרי תאים אפקטורים על ידי הסרת 100 מיקרוליטר מהתאים בבארות בשורה B והוספתם לשורה C. לאחר מכן, יש לדלל עוד יותר את תאי האפקטור על ידי העברת 100 מיקרוליטר של תאים משורה C לשורה D. המשך בדילול הסדרתי. ברגע שמגיעים לשורה G, הזיזו 100 מיקרוליטר מהבארות כדי להשאיר נפח סופי של 100 מיקרוליטר בכל באר באותה שורה. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית רקמות לבארות בשורה A כדי לשמש כבקרה לשחרור ספונטני של כרום 51 מתאי המטרה, מכיוון שאין להוסיף תאי אפקטור לשורה זו. לאחר מכן, הניחו צלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עד שתאי המטרה מוכנים להוספה. לאחר תקופת הדגירה, הסר את תאי המטרה מהחממה ושטוף עם 5 מיליליטר FBS כדי להסיר עודפי כרום 51. לאחר מכן, הנח את הצינור בצנטריפוגה ייעודית וסובב ב-1200 סל"ד למשך 5 דקות. הסר את שטיפת ה-FBS הרדיואקטיבית למיכל פסולת מתאים וחזור על שלב הכביסה על ידי השעיית הגלולה ב-5 מיליליטר FBS טריים. הנח את הצינור בצנטריפוגה ייעודית וסובב את התאים שוב ב-1200 סל"ד למשך 5 דקות. הסר את הכביסה השנייה ובדוק אם הגלולה משולבת רדיואקטיביות באמצעות מונה גייגר. לבסוף, השעו מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של מדיום שלם ושפכו את תרחיף תאי המטרה המסומן בכרום 51 לתוך מאגר ריאגנטים חד פעמי. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של תאי המטרה המסומנים הללו לכל באר של לוחית תאי האפקטור של 96 הבארות. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של 1% NP-40 במים לבארות בשורה H כדי לבזבז את כל תאי המטרה בכל שורה. בארות אלו ישמשו כבקרה לקביעת הספירה הכוללת לדקה, או cpm. כעת, לאחר שהצלחת מוכנה, אבטח את המכסה על ידי הוספת פיסת סרט קטנה לכל צד של הצלחת והנח חתיכת סרט רדיואקטיבי על המכסה כדי לציין שהוא מכיל כרום 51. לאחר מכן, הנח את הצלחת בצנטריפוגה המסומנת לטיפול בדגימות רדיואקטיביות. אם משתמשים רק בצלחת ניסיונית אחת, הוסף לוחית איזון לצנטריפוגה. הגדר את הצנטריפוגה ל -1200 סל"ד, והעלה את הצלחת למהירות. ברגע שהגעתם למהירות, עצרו את המכונה. הסר את הצלחת מהצנטריפוגה. לאחר מכן, הנח את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם חתיכה קטנה של מיגון עופרת מעל הצלחת לבטיחות נוספת. דגירה למשך 16 שעות כדי לאפשר לתאי המטרה ליז. בתום תקופת הדגירה, הסר בזהירות את הקלטת סביב קצה הצלחת והסר את המכסה. לאחר מכן, הניחו את מסגרת הקטיף על הצלחת והקפידו לוודא שדיסקיות המסנן הקטנות נמצאות במקומם עבור כל אחד מפקקי הכותנה. כעת, לחץ לאט ובעדינות את פקקי הכותנה לבארות. לאחר כעשר שניות, שחרר את הלחץ על פקקי הכותנה, ולאחר מכן העביר את פקקי הכותנה לרצועות צינור. הנח כל אחד מהצינורות הללו לתוך צינור FACS משני. לבסוף, טען את צינורות ה-FACS על מונה גמא והפעל את הדגימות כדי לכמת את כמות הכרום 51 המשתחררת בכל מצב. רשום בזהירות את הסדר בו הועמסו הצינורות לדלפק. כאן, PBMCs לא מגורים נוספו לשלושת הנתיבים הראשונים ו-PMBCs מגורים CPG נוספו לנתיבים 4 עד 6. בדוגמה זו, הספירה לדקה הוזנה לתאים של גיליון אלקטרוני באותו אופן שבו הדגימות הונחו בלוח המקורי וחושבו הממוצעים של המשולשות. לדוגמה, עבור התנאי הראשון, התאים A1, A2 ו- A3 היו בממוצע בתא I3. לאחר קביעת הממוצעים, ניתן לחשב את אחוז הליזיס הספציפי עבור כל מצב באמצעות נוסחה זו. לדוגמה, כדי לחשב את אחוז הליזיס הספציפי עבור התאים הלא מגורים שהיו להם יחס של 50 ל-1 תאי אפקטור לתאי מטרה, ה-CPM הספונטני, שבדוגמה זו, הוא 1164.67, הופחת מה-CPM הניסיוני, 1129. 67. לאחר מכן ניתן לחלק את המספר הזה בהפרש בין ה-CPM המקסימלי ל-CPM הספונטני, ולאחר מכן להכפיל אותו ב-100 כדי לתת את האחוז הספציפי. לאחר מכן הוא מחושב עבור כל תנאי. לאחר מכן ניתן לשרטט נתונים אלה בגרף כדי להראות השוואה של יחס E ל-T עם אחוז הליזיס הספציפי הן עבור PBMCs לא מגורים, והן עבור PBMCs מגורים CPG. בדוגמה זו, תאי אפקטור שעוררו עם CPG הרגו תאי מטרה בצורה יעילה יותר ככל שהיחס בין תאי אפקטור לתאי מטרה גדל. עלייה זו לא נצפתה ב-PBMCs הלא מגורים, מה שמצביע על כך שגירוי CPG הכרחי לעלייה הנצפית בליזה של תאי המטרה.

assay-for-cell-death-chromium-release-assay-of-cytotoxic-ability

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

ביולוגיה מתקדמת

Immunology

אימונולוגיה

chromium release assay for immune cell killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells.

This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant and can be measured.

Researchers use this setup to study antigen-specific and nonspecific killing. It is also useful in tumor immunotherapy research, where scientists may look for agents that boost immune cell killing. In other cases, the assay can help test ways to reduce overly strong immune cytotoxic activity.

Several practical points matter for a good result. Healthy effector cells give stronger killing, and healthy target cells help keep spontaneous death and background chromium release low. Because cell-to-cell contact is needed, round-bottom 96-well plates are often used. Proper data analysis also requires positive and negative control target cell groups.

The standard protocol includes preparing 51Cr-labeled targets, preparing effector cells, adding both cell groups to the plate, incubating, harvesting supernatants, and then analyzing the samples on a counter. Samples are often run in triplicate and averaged to reduce the effect of small pipetting differences. A nonradioactive Europium-based version is also available.

Because 51Cr is a powerful gamma radiation emitter, the assay requires radiation safety training, dedicated lab space, a gamma counter, and proper waste disposal. Users should wear a lab coat and gloves, and safety glasses may also be required. Lead shielding, clear signage, and a Geiger counter with a gamma probe are important for safe handling and contamination checks. In this lab exercise, human peripheral blood mononuclear cells, or PBMCs, are tested as CpG-stimulated or unstimulated effector cells against WM793 human melanoma cells.

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

chromium-release-assay-for-immune-cell-killing

flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

flow-cytometry-fluorescence-activated-cell-sorting-facs-isolation

Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

magnetic-activated-cell-sorting-macs-isolation-of-thymic-t-lymphocytes

Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

elisa-assays-indirect-sandwich-and-competitive

ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

elispot-assay-detection-of-ifn-secreting-splenocytes

ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

immunohistochemistry-immunocytochemistry-tissue-imaging-via-light

Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

antibody-generation-producing-monoclonal-antibodies-using-hybridomas

Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

immunofluorescence-microscopy-immunofluorescence-staining-paraffin

Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

confocal-fluorescence-microscopy-technique-to-determine-localization

Confocal Microscopy for Protein Localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

immunoprecipitation-based-techniques-purification-endogenous-proteins

Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

cell-cycle-analysis-assessing-cd4-cd8-t-cell-proliferation-after

Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

adoptive-cell-transfer-introducing-donor-mouse-splenocytes-to-host

Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

This collection covers many staple techniques of immunology labs, including the labeling and sorting of immune cells. It also demonstrates proliferation methods for immune cells and antibodies, as well as common assays for immune activity including ELISA. Finally, it demonstrates staining and imaging of immune tissue and cell samples.

Measure immune cell killing with the chromium release assay. Learn how 51Cr-labeled target cells, PBMCs, and melanoma cells are used to assess cytotoxicity.

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

Description

Transcript