ניתוח אנזימי בידוד והגבלה של DNA
גילוי הדנ"א כמולקולה תורשתית בכל האורגניזמים הוביל לפריצות דרך מדעיות ורפואיות עצומות ושיפר משמעותית את הבנתנו את עצמנו ואת האורגניזמים האחרים. בידוד…
מיצוי DNA הוא הסרה וטיהור של DNA מהתאים. ראשית, התאים עוברים ליזה - שבירה פתוחה - בדרך כלל באמצעות שילוב של שיבוש פיזי וטיפול בכימיקלים, כגון חומר ניקוי הממיס את התא ואת קרומי הגרעין. SDS או סודיום דודציל סולפט הוא חומר ניקוי נפוץ הפועל על ידי מסיסים החלבונים והשומנים המרכיבים את הממברנות הללו. לאחר מכן התוכן יכול לצוף בחופשיות לתוך הפתרון שמסביב.
לאחר מכן, יש להפריד את הדנ"א מהמולקולות האחרות הקיימות. פרוטאינאז K המוסף לתגובה יפרק קשרים פפטידים ויעכל חלבונים מזהמים. לאחר מכן מוסיפים מלח לדגימה, אשר מייצב את קבוצות הפוספט הטעונות שלילית בעמוד השדרה של הדנ"א, ולאחר תוספת של אלכוהול קר כקרח, מזרז את הדנ"א מחוץ לתמיסה. המשקע הלבן נאסף על ידי סיבובו בצנטריפוגה שם הוא מתיישב לתחתית הצינור. לאחר שטיפה והשעיה מחדש בתמיסת חיץ, הדנ"א המופק יכול סוף סוף לשמש במחקר או ביישומי ביוטכנולוגיה.
יישומים ביוטכנולוגיים מסוימים, כמו טביעת אצבע של דנ"א, שיכולים לזהות דפוסים חדשים בדנ"א ספציפיים לאדם או ליחידים, כרוכים בשימוש באנזימי הגבלה. אנזימי הגבלה הם מולקולות המקיימות אינטראקציה עם דנ"א ומזהות רצפים ספציפיים. ברגע שהאתר הספציפי שלהם מזוהה, הם חותכים את הדנ"א. זה יגרום לגדיל להיחתך לחתיכה ליניארית אחת או יותר. אם הדנ"א שהופק היה פלסמיד, פיסת דנ"א עגולה המצויה לרוב בחיידקים, כל חתך יגרום לכך שהדנ"א ייצור מקטע ליניארי או מקטעים. אנזימי הגבלה שונים מזהים רצפי דנ"א שונים, ולכן שימוש בשילוב שלהם יכול לגרום ליצירת מקטעים נפרדים.
בטביעת אצבע של דנ"א אנו יכולים לבחון את המקטעים האלה באמצעות טכניקה שנקראת דנ"א או אלקטרופורזה בג'ל. כדי להכין ג'לים, אבקת agarose מעורבב עם חיץ מחומם עד מומס. לאחר מכן מוסיפים כתם נוקלאוטיד לתערובת החמה ואז מוזגים את התמיסה הזו לתבנית היציקה. מסרק מוכנס כדי ליצור את הבארות. לאחר שהתמצק, הג'ל מועבר לקופסת ג'ל מלאה בחיץ והמסרק מוסר. תערובת ייחוס של מקטעי דנ"א צבועים באורכים ידועים, סולם הדנ"א, מתווספת לבאר אחת ודגימות הדנ"א הצבועות המעניינות נטענות בבארות הנותרות. הקופסה מחוברת למקור חשמל והפעלת החשמל גורמת לנדידה של קבוצות הפוספטים הטעונים שלילית בנוקלאוטידים של הדנ"א דרך הג'ל לכיוון האנודה, הקצה החיובי. חתיכות קטנות יותר נעות מהר יותר מהשברים הגדולים יותר, הנודדים בקושי.
כאשר הריצה מסתיימת, הג'ל נחשף לאור אולטרה סגול כדי להמחיש את כתם הנוקלאוטיד בדגימות ה- DNA. ניתן לאשר את נוכחותם על סמך מיקומם היחסי לרצועות הסולם. מאחר שלדנ"א עם רצפים שונים יש אתרים חתוכים במקומות שונים, זה יכול לייצר תבניות פס חדשות, או טביעות אצבע, שניתן להשתמש בהן כדי להבחין בין אנשים או פרופילי דנ"א שונים.
במעבדה זו תבצע מיצוי DNA באמצעות חיץ עם ובלי SDS כדי להעריך את החשיבות של דטרגנטים בבידוד DNA ולאחר מכן לעכל DNA פלסמיד עם אנזימי הגבלה שונים כדי לבחון את פרופילי ה- DNA המתקבלים.
מיצוי DNA הוא הסרה וטיהור של DNA מהתאים. ראשית, התאים עוברים ליזה - שבירה פתוחה - בדרך כלל באמצעות שילוב של שיבוש פיזי וטיפול בכימיקלים, כגון חומר ניקוי הממיס את התא ואת קרומי הגרעין. SDS או סודיום דודציל סולפט הוא חומר ניקוי נפוץ הפועל על ידי מסיסים החלבונים והשומנים המרכיבים את הממברנות הללו. לאחר מכן התוכן יכול לצוף בחופשיות לתוך הפתרון שמסביב.
לאחר מכן, יש להפריד את הדנ"א מהמולקולות האחרות הקיימות. פרוטאינאז K המוסף לתגובה יפרק קשרים פפטידים ויעכל חלבונים מזהמים. לאחר מכן מוסיפים מלח לדגימה, אשר מייצב את קבוצות הפוספט הטעונות שלילית בעמוד השדרה של הדנ"א, ולאחר תוספת של אלכוהול קר כקרח, מזרז את הדנ"א מחוץ לתמיסה. המשקע הלבן נאסף על ידי סיבובו בצנטריפוגה שם הוא מתיישב לתחתית הצינור. לאחר שטיפה והשעיה מחדש בתמיסת חיץ, הדנ"א המופק יכול סוף סוף לשמש במחקר או ביישומי ביוטכנולוגיה.
יישומים ביוטכנולוגיים מסוימים, כמו טביעת אצבע של דנ"א, שיכולים לזהות דפוסים חדשים בדנ"א ספציפיים לאדם או ליחידים, כרוכים בשימוש באנזימי הגבלה. אנזימי הגבלה הם מולקולות המקיימות אינטראקציה עם דנ"א ומזהות רצפים ספציפיים. ברגע שהאתר הספציפי שלהם מזוהה, הם חותכים את הדנ"א. זה יגרום לגדיל להיחתך לחתיכה ליניארית אחת או יותר. אם הדנ"א שהופק היה פלסמיד, פיסת דנ"א עגולה המצויה לרוב בחיידקים, כל חתך יגרום לכך שהדנ"א ייצור מקטע ליניארי או מקטעים. אנזימי הגבלה שונים מזהים רצפי דנ"א שונים, ולכן שימוש בשילוב שלהם יכול לגרום ליצירת מקטעים נפרדים.
בטביעת אצבע של דנ"א אנו יכולים לבחון את המקטעים האלה באמצעות טכניקה שנקראת דנ"א או אלקטרופורזה בג'ל. כדי להכין ג'לים, אבקת agarose מעורבב עם חיץ מחומם עד מומס. לאחר מכן מוסיפים כתם נוקלאוטיד לתערובת החמה ואז מוזגים את התמיסה הזו לתבנית היציקה. מסרק מוכנס כדי ליצור את הבארות. לאחר שהתמצק, הג'ל מועבר לקופסת ג'ל מלאה בחיץ והמסרק מוסר. תערובת ייחוס של מקטעי דנ"א צבועים באורכים ידועים, סולם הדנ"א, מתווספת לבאר אחת ודגימות הדנ"א הצבועות המעניינות נטענות בבארות הנותרות. הקופסה מחוברת למקור חשמל והפעלת החשמל גורמת לנדידה של קבוצות הפוספטים הטעונים שלילית בנוקלאוטידים של הדנ"א דרך הג'ל לכיוון האנודה, הקצה החיובי. חתיכות קטנות יותר נעות מהר יותר מהשברים הגדולים יותר, הנודדים בקושי.
כאשר הריצה מסתיימת, הג'ל נחשף לאור אולטרה סגול כדי להמחיש את כתם הנוקלאוטיד בדגימות ה- DNA. ניתן לאשר את נוכחותם על סמך מיקומם היחסי לרצועות הסולם. מאחר שלדנ"א עם רצפים שונים יש אתרים חתוכים במקומות שונים, זה יכול לייצר תבניות פס חדשות, או טביעות אצבע, שניתן להשתמש בהן כדי להבחין בין אנשים או פרופילי דנ"א שונים.
במעבדה זו תבצע מיצוי DNA באמצעות חיץ עם ובלי SDS כדי להעריך את החשיבות של דטרגנטים בבידוד DNA ולאחר מכן לעכל DNA פלסמיד עם אנזימי הגבלה שונים כדי לבחון את פרופילי ה- DNA המתקבלים.
Q1: Why is SDS used during DNA extraction?
SDS, or sodium dodecyl sulfate, is a detergent that dissolves the lipids and proteins making up cell and nuclear membranes. By solubilizing these membrane components, SDS allows the cell contents, including DNA, to float freely into the surrounding solution, making DNA accessible for further purification steps.
Q2: What role does Proteinase K play in DNA isolation?
Proteinase K is an enzyme that breaks down peptide bonds in proteins, digesting contaminating proteins like histones that bind to DNA. This separation is essential because DNA is tightly condensed around histone proteins inside the nucleus, and removing these proteins allows pure DNA to be recovered.
Q3: How does salt help precipitate DNA from solution?
Salt, typically sodium chloride, stabilizes DNA by allowing Na+ ions to bind to and integrate into the negatively charged phosphate groups in the DNA backbone. This causes DNA strands to clump together, making the precipitate visible and collectible by centrifugation.
Q4: What determines where restriction enzymes cut DNA?
Restriction enzymes recognize and cut DNA at specific nucleotide sequences, typically six to twelve nucleotides long and usually palindromic, meaning they read the same in both the 3'-5' and 5'-3' directions. Different restriction enzymes recognize different sequences, allowing researchers to produce distinct DNA fragments for analysis.
Q5: Why do smaller DNA fragments move faster through gel electrophoresis?
During gel electrophoresis, negatively charged DNA migrates toward the anode through the gel matrix. Smaller DNA fragments navigate the gel's pores more easily than larger fragments, which experience greater resistance and migrate with difficulty, causing size-based separation of DNA pieces.
Q6: How can restriction enzyme digestion create unique DNA fingerprints?
Because different DNA sequences have cut sites at different locations, digesting DNA with restriction enzymes produces novel band patterns specific to each individual's genetic profile. These unique patterns, visualized through gel electrophoresis, can distinguish individuals or variant DNA profiles for forensic and genetic analysis.
Q7: What happens to plasmid DNA when restriction enzymes cut it?
Plasmids are circular DNA molecules commonly found in bacteria. When restriction enzymes cut a plasmid at their recognition sites, the circular DNA becomes linear, forming one or more linear fragments. These fragments can then be isolated and ligated into vectors for bacterial transformation using plasmids procedure applications.