Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
גילוי הדנ"א כמולקולה תורשתית בכל האורגניזמים הוביל לפריצות דרך מדעיות ורפואיות עצומות ושיפר משמעותית את הבנתנו את עצמנו ואת האורגניזמים האחרים. בידוד דנ"א ויצירת פרופיל היו הצעדים הראשונים הבסיסיים עבור רבים מהפיתוחים במאה האחרונה; מזיהוי תפקוד גנים ועד מהפכות בחקלאות ובזיהוי פלילי.
בידוד DNA הוא הליך פשוט למדי הדורש כמה צעדים אך חיוניים: קצירת תאים, ליזה, פירוק חלבונים, ולבסוף משקעים DNA. באופן כללי, ניתן לקצור דנ"א מכמויות קטנות של רקמות, כגון עלה בודד של צמח, זקיקי שיער של בעלי חיים, או תאי אפיתל שניתן להחליק בקלות בתוך הפה עם תמיסת מלח פשוטה. מאחר שהדנ"א ממודר בתוך הגרעין או המיטוכונדריה בתוך תאים איקריוטים, מדענים מפרקים תחילה את התא ואת קרום הגרעין כדי לחשוף את הדנ"א, וזה נעשה עם שלב הליזיס. עם זאת, ברגע שהדנ"א נחשף, הוא יכול להתפרק על ידי יוני מתכות כבדות ורמות קיצוניות של pH. לכן, תמיסת חיץ המכילה דטרגנט משמשת לא רק להמסת קרום התא, אלא גם להגנה על ה- DNA מפני אלמנטים מתפרקים בתמיסה. יתר על כן, דנ"א הוא מולקולה ארוכה במיוחד שמתעבה בתוך הגרעין על ידי אריזה הדוקה סביב חלבונים מיוחדים הנקראים היסטונים. לכן, אנזים בשם פרוטאינאז K, אשר מפרק קשרים פפטידים של חלבונים, מתווסף כדי להפריד את הדנ"א מהיסטונים וחלבונים אחרים. לאחר מכן, מדענים מפרידים דנ"א משאר תמצית התא באמצעות התכונות הכימיות שלה. בשל המבנה הטעון שלילית של חומצות גרעין, יוני Na+ בתמיסת נתרן כלורי נקשרים ומשתלבים בגדילי DNA שזורים. ברגע שהדנ"א מגובש, ניתן לצפות בו בעין בלתי. דנ"א אינו מסיס באלכוהול ומזרז בקלות בטמפרטורות נמוכות, ולכן מדענים מוסיפים אלכוהול קר כדי לזרז דנ"א. לבסוף, ניתן להמיס את הדנ"א המואץ ולאחסן אותו במים שעברו דה-יוניזציה או במאגר עדין, ללא אנזימים שיכולים לפרק חומצות גרעין, עד שייעשה בו שימוש.
תגובות המשתמשות בדנ"א דורשות לעתים קרובות טוהר גבוה וכמויות מדויקות של דנ"א. לכן, לאחר בידוד הדנ"א, מדענים משתמשים בספקטרופוטומטר כדי לכמת את כמות הדנ"א בדגימה שלהם, כמו גם את טוהר הדנ"א בדגימה. ספקטרופוטומטר מודד את עוצמת קרן האור המועברת דרך דגימה כפונקציה של אורך הגל שלה. חומצות גרעין בולעות אור ב-260 ננומטר, בעוד חלבונים בולעים אור ב-280 ננומטר. על ידי מדידת עוצמת קרן אור ב-260 ננומטר, מדענים יכולים לקבוע את ריכוז הדנ"א. יתר על כן, על ידי הערכת עוצמת האור הן ב-260 ננומטר והן ב-280 ננומטר, ניתן לקבוע את טוהר תכולת הדנ"א. בדגימה של DNA טהור, יחס 260/280 ננומטר צריך להתקרב לערך של 2.
עבור מספר ניתוחים, כגון שיבוט, ריצוף ומיפוי מקטעי DNA וגנומים, יש לחתוך את הדנ"א המבודד ברצפים ספציפיים באמצעות אנזימי הגבלה. אנזימים אלה מיוצרים על ידי חיידקים כמנגנונים של חסינות מולדת מפני חדירת DNA נגיפי ומתפקדים כמספריים מולקולריים. לכן, לאחר שאנזימי הגבלה מזהים דנ"א נגיפי, הם מתחילים לפרק אותו על ידי חיתוכו למקטעים ברצפי נוקלאוטידים מסוימים שהם מזהים. רצפי נוקלאוטידים אלה הם לרוב באורך שישה עד שנים עשר נוקלאוטידים והם בדרך כלל פלינדרומיים, מה שאומר שיש להם את אותו רצף נוקלאוטידים בכיוונים 3'-5' ו-5'-3'. לדוגמה, אנזים ההגבלה EcoRI חותך DNA ברצף 3'... GAATTC...-5', שקורא אותו דבר בכיוון 5'-3'. כמו EcoRI, ישנם מאות אנזימים המתאימים לרצפים פלינדרומיים שונים רבים. ברגע שהדנ"א נחתך על ידי אנזימים אלה, מדענים יכולים לטעון את הדנ"א על ג'ל בתא אלקטרופורזה ולהעביר זרם חשמלי דרך הג'ל. דנ"א נושא מטענים שליליים, מה שגורם למקטעי דנ"א לנדוד לכיוון האנודה. עם זאת, נקבוביות הג'ל מאטות מקטעי דנ"א גדולים יותר ביחס לרצפי דנ"א קטנים יותר, ולכן החתיכות נפרדות בהתאם לגודלן. לאחר השלמת האלקטרופורזה, ניתן לדמיין מקטעי DNA בעזרת צבעים הנקשרים באופן ספציפי למולקולות DNA.
חיתוך דנ"א באמצעות אנזימי הגבלה והפרדת מקטעי דנ"א באמצעות אלקטרופורזה מאפשרים לחוקרים לזהות גדלים של מקטעים לא ידועים ביחס לסולם סטנדרטי. לאחר מכן ניתן לבודד עוד יותר את רסיסי העניין הללו ולקשור אותם לווקטור פלסמיד לצורך שיבוט גנטי. הנדסה גנטית וניתוחי מעבדה שופרו מאוד עם שיטות אלה. בעזרת פרופיל דנ"א, מדענים מסוגלים לרצף גנומים כדי להבין עוד יותר את פעולתם של אורגניזמים והם גם מסוגלים לזהות ולאפיין גנים מסוימים1.
בידוד DNA ופרופיל הם גם מעשיים עבור אירועים המשפיעים ישירות על חיי היומיום. לדוגמה, מדעני זיהוי פלילי מנתחים באופן שגרתי דגימות DNA כדי לספק ראיות לתיקים פליליים ואזרחיים2. באופן דומה, עובדי בריאות מוציאים ומנתחים דנ"א כדי לבדוק אבהות ומחלות גנטיות. לאחרונה, ערכות ניתוח מוצא DNA הפכו פופולריות על ידי מתן אפשרות למשתמשים לקבוע את השושלת הגנטית שלהם, למצוא קרובי משפחה, ואפילו לגלות את הנטייה הגנטית שלהם למצבים בריאותיים שונים3. לבסוף, עם התקדמות הביוטכנולוגיה וההנדסה הגנטית, רפואה מותאמת אישית צוברת תאוצה בקרב חוקרים קליניים לפתח טיפולים באמצעות הנתונים הגנטיים של הפרט, וסוללת את הדרך לטיפול יעיל בחולים ללא תופעות לוואי מזיקות4.
מיצוי DNA הוא הסרה וטיהור של DNA מהתאים. ראשית, התאים עוברים ליזה - נפתחים - בדרך כלל באמצעות שילוב של שיבוש פיזי וטיפול בכימיקלים, כגון חומר ניקוי הממיס את התא ואת ממברנות הגרעין. SDS או נתרן דודציל סולפט הוא חומר ניקוי נפוץ הפועל על ידי המסת החלבונים והשומנים המרכיבים את הממברנות הללו. לאחר מכן התוכן יכול לצוף בחופשיות לתוך התמיסה שמסביב.
לאחר מכן, יש להפריד את הדנ"א מהמולקולות האחרות הקיימות. חלבון K שנוסף לתגובה יפרק קשרי פפטיד ויעכל חלבונים מזהמים. לאחר מכן מוסיפים לדגימה מלח, המייצב את קבוצות הפוספט הטעונות שלילית בעמוד השדרה של ה- DNA, ולאחר הוספת אלכוהול קר כקרח, מזרז את ה- DNA מהתמיסה. המשקעים הלבנים נאספים על ידי סיבובו בצנטריפוגה שם הוא מתיישב בתחתית הצינור. לאחר שטיפה והשעיה מחדש בתמיסת חיץ, ניתן סוף סוף להשתמש ב-DNA המופק ביישומי מחקר או ביוטכנולוגיה.
חלק מהיישומים הביוטכנולוגיים, כמו טביעת אצבע של DNA, שיכולים לזהות דפוסים חדשים ב-DNA ספציפיים לאדם או ליחידים, כוללים שימוש באנזימי הגבלה. אנזימי הגבלה הם מולקולות המקיימות אינטראקציה עם DNA ומזהות רצפים ספציפיים. ברגע שהאתר הספציפי שלהם מזוהה, הם חותכים את ה-DNA. זה יביא לכך שהגדיל ייחתך לחתיכה ליניארית אחת או יותר. אם ה-DNA שחולץ היה פלסמיד, פיסת DNA עגולה שנמצאת לרוב בחיידקים, כל חתך יגרום ל-DNA ליצור שבר או שברים ליניאריים. אנזימי הגבלה שונים מזהים רצפי DNA שונים, כך ששימוש בשילוב של אלה יכול לגרום ליצירת שברים נפרדים.
בטביעת אצבע של דנ"א, אנו יכולים לבחון את המקטעים האלה באמצעות טכניקה שנקראת דנ"א או אלקטרופורזה של ג'ל. להכנת ג'לים מערבבים אגרוז אבקה עם חיץ ומחממים עד להמסה. לאחר מכן מוסיפים כתם נוקלאוטיד לתערובת החמה ולאחר מכן יוצקים תמיסה זו לתבנית היציקה. מסרק מוחדר ליצירת הבארות. כאשר הוא מתמצק, הג'ל מועבר לקופסת ג'ל מלאה במאגר והמסרק מוסר. תערובת ייחוס של שברי DNA צבועים באורכים ידועים, סולם ה-DNA, מתווספת לבאר אחת ודגימות ה-DNA הצבועות המעניינות נטענות לבארות הנותרות. הקופסה מחוברת למקור חשמל והפעלת החשמל גורמת לנדידה של קבוצות הפוספט הטעונות שלילית בנוקלאוטידים של DNA דרך הג'ל לכיוון האנודה, הקצה החיובי. כלים קטנים יותר נעים מהר יותר מהשברים הגדולים יותר, הנודדים בקושי.
בסיום הריצה הג'ל נחשף לאור אולטרה סגול כדי לדמיין את כתם הנוקלאוטיד בדגימות ה-DNA. ניתן לאשר את נוכחותם על סמך מיקומם היחסי לרצועות הסולם. מכיוון של-DNA עם רצפים שונים יהיו אתרי חיתוך במיקומים שונים, זה יכול לייצר דפוסי פס חדשים, או טביעות אצבע, שניתן להשתמש בהם כדי להבחין בין פרטים או פרופילי DNA שונים.
במעבדה זו תבצעו מיצוי DNA באמצעות מאגר עם ובלי SDS כדי להעריך את חשיבות חומרי הניקוי בבידוד ה-DNA ולאחר מכן תעכלו DNA פלסמיד עם אנזימי הגבלה שונים כדי לבחון את פרופילי ה-DNA המתקבלים.
