כרומטוגרפיית עמודות

כרומטוגרפיית עמודות

קיימות טכניקות רבות לטיהור והפרדת תרכובות במעבדה לכימיה אורגנית. אחת מטכניקות ההפרדה האמינות ביותר להפרדות מיקרוסקולריות, שבה פחות מ-10 גרם של התרכובת זמינה לניתוח, היא כרומטוגרפיית עמודות. טכניקה זו מפרידה תרכובות בתערובת בהתבסס על תכונותיהן הפיזיקליות, כגון מסיסותן, קוטביותן, הידרופוביותן, גודלן ומטענן.

יסודות הכרומטוגרפיה

המרכיבים העיקריים של כל מערכת כרומטוגרפיה הם השלב הנייח, השלב הנייד ותערובת הדגימה שיש לנתח. בכרומטוגרפיית עמודות, השלב הנייח הוא בדרך כלל חרוזים מיקרוסקולריים, אשר ארוזים באופן אחיד בטור אנכי. זרימה רציפה של הפאזה הניידת, הידועה גם בשם הממס, מתווספת לחלק העליון של העמודה, אשר זורמת דרך הפאזה הנייחת באמצעות כוח הכבידה או בקצב זרימה מבוקר על ידי משאבה.

הדגימה מומסת בכמות קטנה של הממס ולאחר מכן מתווספת לראש העמודה. ממס נוסף כדי לאלץ את הדגימה לזרום דרך השלב הנייח. התרכובות בתערובת מחיצות בין הפאזה הניידת לשלב הנייח על פי תכונותיהן השונות ויוצרות פסים בדידים.

תרכובות עם אינטראקציות חזקות עם הפאזה הנייחת ינועו לאט יותר מאשר תרכובות עם אינטראקציות חלשות עם הפאזה הנייחת. לכן, תרכובות עם אינטראקציות חלשות ייצאו מהעמודה, או יבודדו, מוקדם יותר מאלה עם אינטראקציות חזקות. עוצמת האינטראקציה של תרכובת עם הפאזה הנייחת מוגדרת על ידי גורם הפיגור (R_f), שהוא היחס בין המרחק שעבר רכיב לזה שעבר הפאזה הניידת. גורם הפיגור נקבע על ידי ביצוע כרומטוגרפיה של שכבה דקה תחילה.

ערך גורם פיגור גבוה מצביע על כך שהדגימה מקיימת אינטראקציה חזקה עם השלב הנייח ולוקח זמן רב ללוטש. ערך גורם פיגור נמוך מצביע על כך שהדגימה אינה מתקשרת עם הפאזה הנייחת חזק מאוד ופולטת מהר יותר. מכיוון שתרכובות מתחלקות לרצועות בודדות ונפלטות מהעמודה בזמנים שונים בשל ערכי R_f השונים שלהן, ניתן לבודד אותן בנפרד על ידי איסוף הממס מתחת לעמודה בשברים.

שיקולי כרומטוגרפיה של עמודות

עמוד כרומטוגרפיה הוא צינור זכוכית או פלסטיק אנכי. גודל העמוד יכול לנוע בין סנטימטרים ספורים (כגון פיפטה של פסטר) למטרים (כגון עם עמודים תעשייתיים). קוטר העמודה תלוי בכמות הדגימה שיש להפריד, ואילו אורך העמודה תלוי בקושי ההפרדה. החלוקה היעילה ביותר לרצועות נפרדות דורשת שכבות מדגם דקות; לכן, קביעת הקוטר המתאים היא צעד חיוני. טעינת נפח דגימה גדול מדי ביחס לקוטר העמודה תיצור פסים רחבים יותר ומוגדרים פחות מאותו נפח דגימה בטור בקוטר גדול יותר.

בעת בחירת אורך העמודה, יש לקחת בחשבון את ערכי R_f של הרכיבים. רכיבים עם גורמי פיגור דומים עשויים להיות מאתגרים להפרדה ודורשים עמודה ארוכה יותר כדי לפתור את הפסים הבודדים. תרכובות עם גורמי פיגור שונים מאוד עשויות שלא להזדקק לטור ארוך, מכיוון שהן אמורות להתחלק בקלות. בעת בחירת הפאזה הנייחת, חשוב לבחור אחד שגורם לגורמי פיגור שונים עבור כל רכיב.

הכנת העמודה היא החלק הקריטי ביותר בהפעלת עמודת כרומטוגרפיה. המסה של הפאזה הנייחת הארוזה בטור צריכה להיות לפחות פי 20 מזו של המדגם. אם לעמודה אין דיסק נקבובי בתחתית, היא צריכה להיות ארוזה בכותנה ובשכבה דקה של חול. פעולה זו מונעת את אובדן השלב הנייח דרך יציאת העמודה.

ישנן שתי שיטות לאריזת העמודה: שיטת האריזה היבשה ושיטת הבוצה. בשיטה היבשה, השלב הנייח מועבר לעמודה בצורת האבקה שלה. לאחר מכן שוטפים את העמוד מספר פעמים עם הפאזה/ממס הנייד כדי להבטיח שהממס חודר לכל חלק בעמוד ג'ל הסיליקה. שיטה זו, אם לא נעשה כראוי, יכול להגדיל את ההסתברות של כתמים יבשים, תעלות, בועות אוויר להיווצר בעמודה. פגמים אלה ישפיעו על היכולת של העמודה לחלק רכיבים של תערובת.

שיטת הבוצה מספקת עמוד ארוז אחיד יותר שאינו מכיל בועות אוויר, אזורים יבשים ותעלות. עבור שיטה זו, השלב הנייח מעורבב עם ממס כדי ליצור slurry עקבי. לאחר מכן הבוצה מועברת לעמוד תוך הקשה בצדדים כדי להיפטר מבועות אוויר שנוצרו. הסטופר של העמודה, אם יש כזה, צריך להיות פתוח במהלך שלב זה כדי לאפשר לממס להתנקז.

כרומטוגרפיית ג'ל סיליקה

תכונות רבות ושונות מנוצלות להפרדת תערובת של תרכובות, כגון גודל, מטען והידרופוביות. תכונה אחת המשמשת להפרדת תרכובות בכימיה אורגנית היא קוטביות. לשם כך, ג'ל סיליקה וג'ל אלומינה הם השלבים הנייחים הנפוצים ביותר. ג'ל סיליקה הוא קוטבי ביותר ויוצר אינטראקציות חזקות של דיפול-דיפול עם תרכובות קוטביות. בנוסף, ג'ל סיליקה יכול ליצור קשרי מימן עם האנליט בשל נוכחות של קבוצות -OH על פני השטח שלה.

רכיבים של התערובת שהם הכי קוטביים נקשרים חזק לג'ל הסיליקה ונעים לאט דרך העמודה, בעוד רכיבים שאינם קוטביים מסיסים יותר בפאזה הניידת ונעים במהירות דרך העמודה. לכן, חיוני כי המרכיבים של תערובת יש קטבים שונים. רכיבים המקיימים אינטראקציה חזקה עם הפאזה הנייחת מדוללים על ידי הזרמת פאזה ניידת קוטבית דרך העמודה.

הפניות

1. Shuler, M.L., Kargi, K., DeLisa, M. (2017). הנדסת תהליכים ביולוגיים, מושגי יסוד. נהר האוכף העליון, ניו ג'רזי: פרנטיס הול.
2. Harris, D.C. (2015). אנליזה כימית כמותית. ניו יורק, ניו יורק: W.H. Freeman and Company.

כרומטוגרפיה של עמודות היא טכניקה המשתמשת בעמודה ארוזה כדי להפריד תרכובות על סמך האינטראקציות שלהן עם שלב נייח, שהוא בדרך כלל בצורה של חרוזים מיקרוסקופיים. הרווחים בין החרוזים מלאים בממס. פתיחת העמוד מאפשרת לממס לזרום דרך השלב הנייח. כאשר מורחים תערובת על החלק העליון של העמוד הארוז ואחריו יותר מהממס, התערובת עוברת לשלב הנייד וזורמת דרך השלב הנייח.

כל מרכיב בתערובת מקיים אינטראקציה עם השלב הנייח בצורה שונה. לחלק מהרכיבים יש אינטראקציות חלשות עם השלב הנייח ולכן נעים במהירות דרך העמודה, בעוד שלאחרים יש אינטראקציות חזקות עם השלב הנייח ולכן נעים לאט יותר. זה מפריד את התרכובות השונות לרצועות, שנאספות בשברים קטנים. זה מאפשר טיהור של כל תרכובת.

אז באיזה סוג של מאפיינים ניתן להשתמש כדי להפריד תערובות? אחד המאפיינים הנפוצים ביותר הוא קוטביות. לשם כך, סיליקה ג'ל, שהיא סוג של צורן דו חמצני, משמשת לעתים קרובות כשלב הנייח. סיליקה ג'ל מקיים אינטראקציה עם תרכובות על ידי אינטראקציות דיפול-דיפול וקשר מימן דרך קבוצות -OH הנוצרות על פני השטח שלו. לפיכך, תרכובות קוטביות יתקשרו חזק עם הפאזה הנייחת, בעוד שתרכובות לא קוטביות יתקשרו בצורה חלשה.

מאפיינים אחרים שניתן לנצל להפרדה כוללים גודל, מטען והידרופוביות. דרך נפוצה להעמיס את השלב הנייח לעמודה היא כתרחיץ של השלב הנייח והממס. לאחר מכן, השלב הנייח נארז על ידי הזרמת ממס נוסף דרך העמודה כדי לדחוס את התרחיץ. חיוני שהשלב הנייח יהיה ארוז באופן אחיד ללא בועות אוויר, תעלות ריקות או טלאים יבשים. אלה יכולים לשבש את הזרימה ולגרום לערבוב של רצועות.

בבחירת עמודה, הקוטר מבוסס על נפח המדגם שיש להפריד. המדגם צריך לכסות את החלק העליון של העמוד בשכבה דקה ואחידה. שכבת דגימה עבה יותר מובילה לרצועות רחבות יותר. אורך העמודה תלוי עד כמה התרכובות נפרדות בשלב הנייח. תרכובות בעלות זיקה דומה לשלב הנייח דורשות עמודה ארוכה להפרדה נאותה. עם זאת, ניתן להפריד תערובת של תרכובות בעלות זיקה שונה מאוד לשלב הנייח על עמודה קצרה יותר.

במעבדה זו, תחקור כרומטוגרפיה של עמודות על ידי אריזה והכנה של עמודת סיליקה ג'ל. לאחר מכן, תשתמש בעמודה שלך כדי להפריד את הרכיבים הצבעוניים בצבע מאכל ירוק.