מאמר שיטה

פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם

30.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/1405

⸱

1 בספטמבר 2009

 , 
1Unitat de Biologia Cel·lular (Facultat de Biociències), Universitat Autónoma de Barcelona

במאמר זה

סיכום

זה וידאו מאמר זה מתאר, צעד אחר צעד, כיצד תהליך דגימת זרע כדי להשיג באיכות טובה פלואורסצנטי באתרו הכלאה על בזרע אנושי. ההכנות שהושגו ניתן להשתמש להקרנה aneuploidy בהקשר של אבחנה קלינית.

תקציר

Aneuploidies הם פגמים בכרומוזומים השכיח ביותר בבני אדם. רוב הפרעות אלו נובעות שגיאות meiotic בתהליך gametogenic אצל ההורים. אצל גברים אנושיים, שגיאות אלה יכולים להוביל לייצור של זרע עם הפרעות כרומוזום מספריים המייצגים סיכון מוגבר להעברת אנומליות אלה לצאצאים.

מסיבה זו, את הטכניקה של הקרינה הכלאה באתרו (FISH) על גרעין הזרע הפך פרוטוקול שולבו נרחב בהקשר של אבחנה קלינית. בפועל זה מספק אומדן של תדרים של הפרעות כרומוזום מספריים הגמטות של המטופלים המבקשים ייעוץ גנטי הרבייה.

עד כה, את הכרומוזומים כללו לרוב בניתוח FISH הזרע הם כרומוזומי X, Y, 13, 18 ו - 21.

זה וידאו מאמר זה מתאר, צעד אחר צעד, איך לעבד ולתקן דגימת זרע אנושי, איך decondense ו לפגל הכרומטין זרע, כיצד להמשיך לקבל ההכנות FISH הזרע, וכיצד לחזות את התוצאות במיקרוסקופ. הערות מיוחדות הצעדים המשמעותיים ביותר ניתנים על מנת להשיג את התוצאות הטובות ביותר.

פרוטוקול

I. עיבוד המדגם קיבוע התא

  1. השאירו את מדגם הזרע במכלים סטריליים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות עד עיבוי.
  2. מעבירים את המדגם כדי צינור צנטריפוגות ספין אותו 1000g במשך 5 דקות.
  3. הוצא בעדינות וזורקים supernatant באמצעות פיפטה פסטר.
  4. הוסף פתרון hypotonic (KCl, 0.075M) מחומם מראש על 37 ° C, טיפה אחר טיפה, תוך כדי ערבוב על מערבולת לקבל נפח סופי של 10 מ"ל.
  5. מניחים את הצינור באמבטיה המים 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
  6. צנטריפוגה ב 1000g במשך 5 דקות. בזהירות להתעלמות supernatant ידי יציקה, מבלי להפריע גלולה.
  7. לאחר resuspending גלולה, להוסיף המוכן טרי (מתנול 03:01: חומצה אצטית) מקבע של Carnoy טיפה אחר טיפה תוך כדי ערבוב על מערבולת לקבל נפח הסופי של 8 מ"ל.
  8. חזור נקודות 6 ו -7 פעמים רבות ככל הדרוש כדי להשיג גלולה לבנה.
  9. הוסף מתנול מוכן טרי: חומצה אצטית (03:01) טיפה אחר טיפה כדי לכוונן את עוצמת הריכוז הסופי הסלולר הנדרש לקבלת תא טובה מתפשטת (באותם מקרים עם כדורית קטנה, כמה טיפות יספיקו ואילו דגימות עם כמות גבוהה הזרע התאוששה, הנפח הסופי יכול להגיע 1-2 מ"ל). שקופית הבדיקה יכולה להתבצע על ידי הטלת המדגם resuspended לשקופית משומנת ובוחן אותו תחת מיקרוסקופ לעומת שלב. זה יאפשר לבדוק את פיזור הסלולר שהושג יאפשר תיקון זה, אם יש צורך, על שקופיות נוספות.
  10. כדי להפוך את הרחבות, ירידה מגובה מינימלי של 40 ס"מ שתיים או שלוש טיפות של השעיה תא למרכז שקופיות unfrosted (מאוחסן בעבר ב -20 מעלות צלזיוס מתנול כדי degrease אותם). כדי לאפשר את מיקומו של המדגם לאורך הפרוטוקול, לסמן את האזור המכיל את הזרע הרחבה בצד השני של השקופית באמצעות עיפרון היהלומים.
  11. אחסן את השקופיות ב -20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות.
    הערה: תוספת של מתנול: חומצה אצטית (03:01) טיפה אחר טיפה תוך כדי ערבוב היא צעד חשוב מאוד כדי למנוע היווצרות של אגרגטים הזרע.

השנייה. Decondensation

  1. השקופיות המאוחסן -20 ° C חייב להיות מופשר להמשיך עם פרוטוקול (להשאיר אותם בטמפרטורת החדר).
  2. מניחים את השקופית בשתי צנצנות coplin רצופים עם תמיסת מלח נתרן 2x ציטרט (2xSSC) למשך 3 דקות כל אחד.
  3. העברת השקופית באמצעות סדרה של אתנול שוטף למשך 2 דקות בתוך צנצנת כל coplin. התחל עם 70% אתנול, פעל על ידי 90% ולסיים עם 100%. לייבש את השקופית להשאיר אותו בטמפרטורת החדר.
  4. דגירה השקופית בתמיסה dithiothreitol (1,4-dithiothreitol 5mm, טריטון 1% X-100, 2-אמינו-2 (hydroxymethyl) -1,3-propanediol 50mm) בשעה 37 ° C בחממה כדי decondense הכרומטין. מוצר זה פועל על ידי שבירת גשרים דיסולפיד של protamines כי סליל ה-DNA בגרעין תא הזרע. זהו צעד חשוב מאוד כי ה-DNA בגרעין הזרע נדחס מאוד. זמן הדגירה של שקופיות פתרון dithiothreitol (DTT) חייב להיות מותאם על פי התגובה של מדגם למוצר זה. בדרך כלל, הפעם הוא סביב 8 דקות, למרות שזה יכול להשתנות 2-15 דקות.
  5. מיד להעביר את השקופית שתי צנצנות ברציפות coplin עם 2xSSC במשך 3 דקות coplin כל אחד.
  6. המשך על ידי הצבת את השקופית באמצעות סדרה של אתנול שוטף למשך 2 דקות בתוך צנצנת כל coplin (70%, 90% ו 100% אתנול). תנו את השקופית להתייבש בטמפרטורת החדר.
    הערה: חשיפת יתר DTT תביא לפיזור אותות FISH בסוף ההליך, ואילו חשיפה קצר מדי יגרום לחוסר אותות מסוימים.

ג. הכלאה

  1. לפגל את ה-DNA של הזרע דוגרים השקופית בצנצנת coplin עם פתרון לפוראמיד (70% Formamide/2xSSC) בשעה 73 ° C במשך 5 דקות.
  2. העברת השקופית באמצעות פתרונות אתנול דקה 1 לכל coplin קנקן (להתחיל עם אתנול 70%, 85% ולסיים עם 100%). השאירו את השקופית להתייבש בטמפרטורת החדר.
  3. הוסף ישיר l של 5 המקביל מוכן לשימוש תערובת בדיקה לחמוק כיסוי 15x15 (Assay AneuVysion Multi-Probe צבע פאנל: CEP 18/X/Y או LSI 13/21).
  4. כפי שזה מוצג הוידאו, בזהירות במקום להחליק על פתק את המכסה כדי להרכיב את אזור היעד את התערובת בדיקה. חותם זה במלט גומי.
  5. מניחים את השקופית לתוך טרום חימם 37 ° C קאמרית הכלאה (HYBrite ™) ו דגירה אותו 37 מעלות צלזיוס למשך 6-24 שעות.
    הערה: בעוד denaturation המדגם הזרע היא חובה, את הצורך denaturing בדיקות נקבע על ידי היצרן. תערובות בדיקה השתמשו בפרוטוקול הזה מוכנים לשימוש, במקרה זה, denaturation בדיקה אינה נדרשת.
    נפח התערובת בדיקה ישתנה בהתאם לגודל האזור הכלאה.

IV. רוחצתלאחר הכלאה

  1. קח את השקופית מהאולם הכלאה.
  2. הסר את המלט גומי בזהירות לשלוף את הפתק מכסה מחליק בעדינות הצידה.
  3. כדי למנוע את האותות הכלאה נוקבים במקום להחליק במשך 2 דקות בתוך צנצנת עם coplin% 0.4xSSC/0.3 NP-40 מראש התחמם ב 73 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  4. העברת שקופיות פתרון NP-40 לשטוף 2xSSC/0.1% בטמפרטורת החדר למשך דקה 1. תנו את השקופית להתייבש בטמפרטורת החדר.
  5. הוסף מוצר counterstaining לאזור היעד (8 l עבור להחליק לכסות 18x18). המוצר הנפוץ ביותר הוא 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Vysis Inc).
  6. כפי שזה מוצג הוידאו, לכסות את אזור הכלאה עם תלוש כיסוי (כדי לשמר את ההכלאה להחליק לכסות יכול להיות חתום עם לכה מסמר).
  7. חנות שקופיות הכלאה ב -20 ° C בחושך עד ניתוח הסיכוי שלהם. בתנאים אלה השקופיות ניתן לאחסן עד 12 חודשים ללא משמעותי לאיבוד עוצמת האות פלואורסצנטי.
    הערה: הטמפרטורה גבוהה או זמן לשטוף מופרז עלול לגרום לחיסול של אותות מסוימים, ואילו השני לא היה לשטוף את הכלאות בדיקה נוקבים.
    היקף המוצר counterstaining הוסיף ישתנה בהתאם לגודל האזור הכלאה לכסות.

V. ויזואליזציה

ההכנות ניתן להעריך תחת מיקרוסקופ epifluorescence מצויד במסנן הלהקה משולשת עבור DAPI / טקסס אדום / FITC ו יחיד הלהקה מסננים עבור אקווה, FITC וטקסס האדום. קריטריונים להערכה סטנדרטית חייב להיות במעקב במשך הערכה נכונה של גרעיני זרע 1.

הכנת הכלאה עם בדיקות של כרומוזומי X, Y ו 18 צריכים להציג אותות עבור שלושת הכרומוזומים. כל זרע נורמלית חייב להראות איתות כחול (המקביל ל כרומוזום 18), ואת אות ירוק (X נושאות זרע) או איתות אדום (Y נושאות זרע).

בהכנת הכלאה עם בדיקות של כרומוזומים 13 ו - 21, אות ירוק כרומוזום 13 ו סימן אדום על כרומוזום 21 יש להבחין בכל זרע נורמלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר כיצד תהליך דגימות זרע אנושי להשגת FISH ההכנות הזרע. באמצעות פרוטוקול זה ניתן לנתח פגמים בכרומוזומים של גמטות זכריות. ההקרנה זרע aneuploidy יש יישומים גם בהקשר של מחקר בסיסי בייעוץ הרבייה שניתנה זכרים עקרים. למרות האבחנה הקלינית הכרומוזומים ביותר למד נרחב הן X, Y, 13, 18 ו 21, בדיקות מסחריים אחרים עבור מגוון רחב של הכרומוזומים לוקוסים זמינים יכול לשמש גם בניסויים אלו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי Generalitat דה קטלוניה (2005-SGR00437). המחברים מודים ל י פ ו בלאנקו וידאל לפיקוח שלהם עידוד, ג'לוקאס לקבלת סיוע טכני שלו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1,4-דיתיותריטול (DTT)חומריםקבוצת Roche10197777001
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediolחומריםקבוצת Roche10708976001
חומצה אצטיתחומריםMerck & Co., Inc.100.063
AneuVysion® ערכה של גששים רב-צבעיים ל-DNA
  • 20x Saline-Sodium Citrate
  • 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI II)
  • גשש DNA מסוג CEP 18/X/Y
  • NP-40
  • גשש DNA מסוג LSI 13/21
חומריםVysis Inc.32-161075
  • 30-805850
  • 30-804941
  • 30-171077
  • 30-804820
  • 30-171078
צנטריפוגה 5804RכליEppendorf
מבחנה לצנטריפוגהחומריםNalge Nunc international347856
צנצנת קופלין (זכוכית)חומריםBarloworld ScientificHellendahl (ZCT278)
צנצנת קופלין (פלסטיק)חומריםDeltalab191087
זכוכיות כיסוי (15x15)חומריםKnittel Glaser4600115
כיסויות (18x18)חומריםKnittel Glaser4600118
עיפרון יהלוםחומריםהאמאכר (Hammacher)335117010
אתנולחומריםMerck & Co., Inc.100.983
פורממידחומריםקבוצת Roche11814320001
מקפיאכליזנוסי
כפפותחומריםSanyo101/3300
HYBrite™כליVysis Inc.
שמן אימרסיהחומריםOlympus Corporation35505
אינקובטורכליHeraeus Instruments
מתנולחומריםMerck & Co., Inc.106.009
מיקרופיפטהחומריםLabsystemsFinnpipette (4500000)
טיפ להחלפה למיקרופיפטהחומריםDaslab16-2001
לק לציפורנייםחומריםQuo-cosmetics
מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנציה Olympus BX60כליOlympus Corporationמאובזר בפילטר רב-פסים (triple-band) עבור DAPI/Texas Red/FITC ובפילטרים של פס בודד (single-band) עבור Aqua, FITC ו-Texas Red.
פיפטת פסטורחומריםRubilabor211.0230
מיקרוסקופ בניגודיות פאזהכליNikon Instruments
פיפטה מפלסטיק (3 מ"ל)חומריםDeltalab200007
אשלגן כלוריד (KCl)חומריםFluka60128
דבק גומיחומריםבדיקה מיטבית
זכוכיותחומריםKnittel Glaser4520022
קופסאות לשימור שליידוניםחומריםDeltalab19276.1
מכל סטריליחומריםDeltalab409726
מזרקחומריםPentaFerte002022300
מדחוםחומריםComark Instruments, IncKM12
מים מזוקקים שלוש פעמיםחומרים
Triton X-100חומריםSigma-Aldrich9002-93-1
פינצטהחומריםB. Braun MedicalAesculap (BD224R)
זרימה למינרית אנכית מבת זרימה למינאריתכליבורדינולהOR-ST 1500
מערבל וורטקס (Vortex mixer)כליFisher ScientificFB15012
מקלחת מיםכלירייפה®

מקורות

  1. Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים