תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

סיכום

הליך זה מתאר שיטה לבידוד והתרבות של האיבר של קורטי Murine עם או בלי לימבוס ספירלה ספירלה נוירונים גנגליון. אנחנו גם להדגים שיטה הביטוי של הגן כתב אקסוגניים האיבר של קורטי explant ידי electroporation.

תקציר

ב כל היונקים, אפיתל סנסורי לאודישן ממוקם לאורך האיבר של קורטי מתפתלת השוכן בתוך שבלול בצורת קונכייה של האוזן הפנימית (איור 1). תאים שיער של שבלול פיתוח, שהם תאים mechanosensory של מערכת השמיעה, מיושרים בשורה אחת של תאים שיער הפנימי שלושה (בבסיס לאמצע פונה) עד ארבעה (בתורו apical) שורות של תאים השיער החיצונית כי תוחלת אורך האיבר של קורטי. תאים שיער transduce קול-Induced תנודות מכניות של הממברנה basilar לאימפולסים עצביים שהמוח יכול לפרש. רוב המקרים של אובדן שמיעה sensorineural נגרמים מוות או תפקוד לקוי של תאים שיער שבלול.

כלי חיוני יותר ויותר מחקרים שמיעתי הוא בידוד בתרבות במבחנה של explant האיבר ^1,2,9. מבודדים פעם, explants עלול להיות מנוצל במספר דרכים על מנת לספק מידע בנוגע נורמטיבית, חריג, או הפיזיולוגיה טיפולית. התבטאות גנים, תנועתיות stereocilia, התא ביולוגיה מולקולרית, וכן גישות הביולוגי התחדשות התאים השיער הם דוגמאות של יישומים ניסיוני של איבר explants קורטי.

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד והתרבות של האיבר של קורטי מעכברים הילוד. הווידאו הנלווה כולל כיוונים בשלבים עבור בידוד של העצם הטמפורלית מן הגורים העכבר, ובידוד הבאות של שבלול, רצועה ספירלית, ועל איבר קורטי. מבודדים פעם, האפיתל חושית יכול להיות מצופה תרבותי במבחנה בשלמותו, או כמו גזור נוספת מיקרו לבודד כי חסרה את הספירלה לימבוס ונוירונים ספירלה גנגליון. באמצעות שיטה זו, explants העיקרי יכול להישמר במשך 7-10 ימים. כדוגמה השירות של הליך זה, האיבר של קורטי explants יהיה electroporated עם הגן כתב אקסוגניים DsRed. שיטה זו מספקת שיפור פני שיטות אחרות שפורסמו משום שהוא מספק כיוונים לשחזור, חד משמעי, ועל בשלבים עבור הבידוד, microdissection, התרבות העיקרית של האיבר של קורטי.

פרוטוקול

ביום 1. עיקור וציפוי של coverslips זכוכית.

1. יבש לעקר מיקרוסקופ coverslips זכוכית החיטוי.
2. מניחים את coverslips מעוקרים לשתי בארות של מנה טרום מעוקרים ארבע היטב תרבית תאים.
3. המעיל coverslips עם 01:01 poly-L-ornithine ו laminin בתוספת סרום 20% שור עוברית (FBS) לילה ב 4 ° C.
   1. 400 μL poly-L-ornithine (פתרון 0.01% המאוחסן ב 4 ° C)
   2. 400 laminin μL (50 מיקרוגרם / מ"ל ​​מניות פתרון מאוחסנים aliquots ב -20 ° C)
   3. 200 FBS μL (מאוחסן aliquots ב -20 ° C)
4. חום לעקר את הכלים לנתיחה לילה 150 ° C חממה.
5. בצע בינוני תרבות סרום המכיל 10% ו 10 מ"ג / מ"ל ​​אמפיצילין.
   1. 90 מ"ל של Dulbecco השתנה הנשר בינוני
   2. 5 מ"ל FBS (מאוחסן aliquots ב -20 ° C)
   3. 5 מ"ל סוס בסרום (מאוחסן aliquots ב -20 ° C)
   4. 10 אמפיצילין μL (10 מ"ג / מ"ל פתרון מניות מאוחסנים 4 ° C)

יום 2. בידוד של האיבר של קורטי.

1. לעקר את מכסה המנוע לנתיחה תזרים חיובי.
   1. להדליק את האור UV במשך 20 דקות
   2. לרסס את כל המשטחים עם 70% אתנול ו לחכות 5 דקות לפני השימוש.
2. לערוף עכבר גור (P4) בבסיס מגנום foramen באמצעות מספריים ההפעלה.
3. בקצרה לשטוף את הראש בצלחת 10 ס"מ המכיל 70% אתנול.
4. הסר את האפידרמיס בעזרת להב סכין המנתחים.
5. פתח את הגולגולת לאורך תפר sagittal באמצעות להב סכין המנתחים ואז לחצות forebrain. לשמור על forebrain הזנב לניתוח נוסף.
6. הסר את, forebrain המוח הקטן ואת גזע המוח באמצעות דיסקציה קהה.
7. מוציאים את העצמות הטמפורלית (תאנה 2A), לטבול אותם בקצרה אתנול 70%, ולהעבירם צלחת 3 מ"מ המכיל HBSS סטרילית.
8. בעזרת מלקחיים, להסיר את הבולה ואת הרקמה שמסביב מפרשת petrous של העצם הטמפורלית.
9. אתר את שבלול בצורת קונכייה (תאנה 2B) ולהפריד אותו מן המערכת הוסטיבולרית באמצעות מלקחיים.
10. בשלב זה של פיתוח, מבוך גרמי לא מסויד לחלוטין והוא גזור בקלות באמצעות מלקחיים. הסר את המבוך הגרמי של שבלול על ידי הפרדה זהירה החל בסוף הבסיס ומרגש apically באמצעות מלקחיים.
11. רצועה הספירלה ואת איבר צמוד של קורטי הוא מפותל לאורך הספירלה של כישור (איור 2C). הסר בזהירות את האיבר של קורטי על ידי הבטחת רצועה ספירלה בשעה האזור וו הבסיס באמצעות מלקחיים ההתרה זה כאשר אתה מזיז apically.
12. החל בבסיס, להסיר את הרצועה ספירלה מן האיבר של קורטי באמצעות מלקחיים # 55 דק (איור 2 ד).
    Micro-הבידוד של האיבר של האפיתל קורטי חושית (אופציונאלי).
13. הסר את האיבר האזור וו קורטי הבסיס באמצעות שני מזרקים אינסולין ½ סמ"ק עם U-100 28G מצורף לצמיתות ½ מחטים כמו מלקחיים.
14. החל בפסגת, להסיר את הספירלה לימבוס משורה של תאים שיער הפנימי והמשך basally (תאנה 2E-F).
    ציפוי האיבר של קורטי explant
15. הסר את הפתרון poly-L-ornithine/laminin/FBS מבארות תרבות ולהוסיף 130 μl של המדיום לתרבות.
16. העברת האיבר של קורטי גזור כדי coverslip הזכוכית מצופה בתרבות היטב המזרח explant כך cilia של תאים שיער מכוונים למעלה.
17. הסר את המדיום בתרבות גם באמצעות פיפטה 200 μL. ודא כי קרום basilar יוצר מגע עם מוצק coverslip הזכוכית מצופה.
18. בזהירות להוסיף 130 μL של המדיום תרבות לאיבר של קורטי בעזרת פיפטה 200 מ"ל. החלת שתי טיפות על פני השטח של האיבר של קורטי ואז לאט לאט להוסיף את נפח הנותרים לצד coverslip. ודא כי האיבר של קורטי לא לצוף בתקשורת תרבות, אבל עדיין מודבקת coverslip.
19. דגירה לילה בשעה 37 ° C בנוכחות CO 5% _2.

יום 3. Electroporation של הגן כתב לתוך איבר תרבותי של קורטי.

1. הסר את המדיום תרבות מאיבר של התרבות קורטי.
2. הוספת 130 μL H ₂ O דקות 1 ולאחר מכן להסיר בעזרת פיפטה 200 μL.
3. הוסף 30 μL של הכתב DsRed פלסמיד (2mg / מ"ל H ₂ O המאוחסן ב -20 ° C).
4. מראש את האלקטרודות של electroporator באמצעות micromanipulator כך האנודהקטודה nd הם משני צדי התרבות.
5. צור דופק (27V, 30 מילישניות משך, 10 רכבות הדופק) כדי electroporate הגן כתב לתוך איבר התרבות explant קורטי.
   1. אופציונלי: להפוך את הקוטביות של הדופק כדי להבטיח electroporation של transgene על modiolar וגם רצועה ספירלית צידי explant.
6. המתן 5 דקות.
7. הוספת 130 μL של Fugene 6: פתרון ה-DNA (3 חלקים Fugene ל-DNA חלקי 2). פתרון זה אמור להיות מוכן לפני תחילת ההליך electroporation (שלב 20) באמצעות 3 התחתונה מ"ל עגול פוליסטירן המבחנה במנדף זרימה למינרית. כדי להפוך את הפתרון הזה:
   1. הוסף 2.4 μL של Opti-ממ (המאוחסן ב 4 ° C) על המבחנה.
   2. הוסף 0.6 μL של מגיב 6 Fugene (המאוחסן ב 4 ° C) על המבחנה. הקפד להוסיף את Fugene ישירות Opti-ממ ולהימנע ממגע ישיר עם צדדים של המבחנה.
   3. וורטקס לרגע 1.
   4. דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   5. הוסף 2.0 μL כתב DsRed פלסמיד DNA גדילי כפול (המאוחסן ב -20 ° C ב-DNA 100 מיקרוגרם / מ"ל H ₂ aliquots O).
   6. וורטקס לרגע 1.
   7. דגירה 15 דקות בטמפרטורת החדר.
   8. הוספת 200 μL של המדיום לתרבות.
   9. וורטקס לרגע 1.
8. דגירה לילה בשעה 37 ° C ב 5% CO _2.
9. הוסף 2 מ"ל בינוני תרבות לתרבות היטב דגירה של 37 מעלות צלזיוס למשך עד 10 ימים.

נציג תוצאות

אנו מציגים שיטה הבידוד של האיבר של קורטי מ - עכבר הלידה. ההליך יכול לשמש עכברים צעיר כמו יום עובריים 16 עד יום הלידה על 6, ובנקודה המבוך הגרמי הופך מסויד מספיק כדי להבהיר לנתיחה מסורבלת. לאחר האיבר של קורטי הוא גזור, זה עשוי להיות מצופה תרבותי או בשלמותה (איור 3) או אפיתל מיקרו מבודד חושית (איור 4). הצגנו עוד טכניקה כדי להביע את הגנים אקסוגניים באיבר תרבותי של קורטי. תרבות organotypic שימושית עבור סוגים רבים אחרים של מחקר, כגון ניתוח של איבר קורטי של ביטוי גנים באמצעות RT-PCR או הכלאה באתרו, איבר קורטי שיתוף התרבות תאים עם הגנגליון ספירלה או בתאי גזע ממקור חיצוני באמצעות מיקרו לבודד ^3, או בניתוח חוץ גופית מוות שיער תא והתחדשות.

באיור 1. הצלב סעיף של האיבר P4 Murine של קורטי. (א) חתך מ להפוך את הבסיס של שבלול cryosectioned המתקבל עכבר P4 ממחיש את מבנה כללי של שבלול Murine המתואר בפרוטוקול זה. התקשורת scala גובל רצועה הלולייניות stria vascularis רוחבית, הממברנה של Reissner superiorly, לימבוס ספירלה מדיאלית, ואת קרום basilar inferiorly. תיבת הצביע על האזור התרחב ב (ב) איבר קורטי ממוקם בצד מעולה של קרום basilar וכולל שורה אחת של תאים השיער הפנימיים, שלוש שורות של תאים השיער החיצונית, והתאים שלהם התומכים. קו מקווקו 1 מציין את מיקומו לאורך הממברנה basilar כי יוסר במהלך איבר זה של דיסקציה קורטי. קו מקווקו 2 מציין את מיקומו לאורך הממברנה basilar כי יוסר במהלך ההליך מיקרו הבידוד. גרין מציין תיוג immunohistochemical של calbindin, אשר תוויות תאים interdental של לימבוס ספירלה, תאים שיער שבלול, הגנגליון נוירונים ספירלה, כמו גם תאים של הרצועה ספירלה stria vascularis ^7. תיוג DAPI של גרעיני הוא בכחול.

איור 2. איברים של דיסקציה קורטי. תמונות מתוך וידאו המלווה של האיבר של קורטי להדגיש דיסקציה) של מערכת שיווי המשקל ואת השבלול הממוקם בתוך העצם הטמפורלית מבודדים (אדום), ב ') את המבוך הגרמי של שבלול, ג) את הרצועה ספירלה מצורף האיבר של קורטי לאחר הסרת המבוך הגרמי, ד) הסרת רצועה הלולייניות stria vascularis (אדום) של האיבר של קורטי, E) מיקרו הבידוד של האפיתל חושית מן לימבוס ספירלה (אדום), ו-F) מבודדים ספירלה לימבוס (משמאל) אפיתל סנסורי (מימין).

איור 3. איבר תרבותי של קורטי explant. DIC התמונה מראה את איברקורטי של עכבר-P4 Atoh1 nGFP כי היה מבודד, מצופה, ותרבותי במשך חמישה ימים, כמתואר. עכבר זה כבר מהונדסים גנטית כך התאים המבטאים את הגן הפרו שיער תא homolog אטונלי 1 (aka Atoh1 Math1) התערוכה חלבון פלואורסצנטי ירוק כי הוא מקומי לגרעין ^8. האיברים של קורטי מעכברים אלה תערוכה תווית ה-GFP גרעיני גרעיני כל תא שיער ולכן מאפשרים ראיה קל של האפיתל חושית באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent. הספירלה לימבוס גדול יחסית ניתן לראות לרוחב האפיתל חושית. תאים mesenchymal אשר מקורם האיבר של קורטי היגרו מן explant. התווית גרעיני כחול הוא DAPI.

איור 4. Micro-מבודדים אפיתל תחושתי. תמונה Epifluorescent המתקבל האפיתל חושית כי כבר מבודד איבר P4 Murine של קורטי כמתואר ותרבותיים בין לילה. מיקרו לבודד נקבע אז paraformaldehyde 4% ומעובד immunolabeling 7 א שרירן אשר תוויות בתאי השיער בשבלול. הערה העדר הספירלה לימבוס יחסית גדול מן הדמות 3. התווית גרעיני כחול הוא DAPI.

איור 5. Electroporation של הגן כתב DsRed לתוך איבר תרבותי של קורטי. איברים שלמים של קורטי מן הגורים P4 Atoh1-nGFP עכבר בודדו, מצופה, ו electroporated אז עם הגן כתב DsRed כמתואר ואחר כך מתחת למיקרוסקופ epifluorescent. תאים של האיבר של קורטי explant כי הביע את חלבון מהונדס כתב DsRed התערוכה תאים פלואורסצנטי אנדוגני אדום התערוכה אפיתל סנסורי פלואורסצנטי ירוק גרעיני. התאים הטרנסגניים ניתן לראות ברחבי לימבוס ספירלה אפיתל תחושתי.

דיון

ישנם כמה פרטים כי הם קריטיים להצלחת הליך זה. ככל שהזמן מהבידוד העצם הטמפורלית לאיבר של קורטי הדגירה, כך גובר הסיכוי כי האיברים יצרף coverslip והתוצאה בתרבויות איבר קיימא. לכן, חשוב להגביל את כמות הזמן בין לנתיחה ומיקום האיברים בחממה. הבחירה של אנטיביוטיקה היא קריטית גם, שכן אנטיביוטיקה aminoglycoside רבים ototoxic תגרום מוות של תאים שיער. אמנם עדיף לוותר על השימוש באנטיביוטיקה לגמרי, זה משאיר פתוחה את האפשרות של זיהום. לכן, אנו ממליצים על שימוש 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​אמפיצילין ככלל להתגבר על בעיות זיהום פוטנציאליים.

ההיבט המטריד ביותר של זה, הליכים אחרים לתרבות העיקרי של האיבר של קורטי, הוא הנטייה של איברים כדי לצוף מעל צלחות במהלך הדגירה. למרות תרבויות איבר צף יכול להישאר קיימא עבור 5-7 ימים, יש חסרונות של איברים culturing צף. למשל, בתרבויות איבר צף להתקפל לעתים קרובות על עצמם לאחר 4-5 ימים טיוח מיקרוסקופיה בעייתי. לאחר מכן, שלמות מבנית של איבר יכול להיות בסכנה בהשוואה לאיברים כי כבר מודבקת coverslip. מצאנו כי בטכניקות הבאות לעזור להבטיח כי האיבר של קורטי לא לצוף בתקשורת תרבות, אבל עדיין מודבקת coverslip. ראשית, זכוכית מעיל coverslips ב 01:01 polyornithine / laminin בתוספת 20% FBS כמתואר. הדגירה לילה קרא בפרוטוקול זה הזמן המינימלי כי הצלחת צריך להיות מצופה. במעבדה שלנו, אנחנו לעתים קרובות מעיל את כל הצלחות שאנו זקוקים למשך שבוע ולשמור אותם על 4 מעלות צלזיוס עד יום לפני השימוש, כאשר אנו להעביר אותם בחממה במשך הדגירה לילה. שנית, לאחר האיברים מועברים coverslips מצופה, המזרח explant כך cilia של תאים שיער הפנים כלפי מעלה. אוריינטציה זו תקל על דבקות של קרום basilar לצלחת התרבות. שלישית, להסיר את התקשורת בתוך הבאר לצרף explant אל צלחת מצופה. פעולה זו תבטיח קשר בין המנה תרבות הממברנה basilar ולשפר את היכולת של explants לדבוק הזכוכית. זה יהיה גם לסייע בשמירה על שלמות מבנית של שורות תאים שיער. לבסוף, בזהירות לטפטף 2 טיפות בינוני תרבות על פני השטח של האיבר של קורטי בעזרת פיפטה 200 קיבולת μL ואז לאט לאט למלא היטב על ידי טפטוף נפח הנותרים (של μL 130 סה"כ) בצד של coverslip. חשוב לעבוד במהירות כדי להבטיח את הקובץ המצורף של האיבר של קורטי אל coverslip המצופה. מ חניכה של לנתיחה כדי הדגירה של explants, זה בדרך כלל לוקח 10 דקות עבור המפעיל מיומנת כדי להשלים את האיבר של ההליך בידוד קורטי.

בפרוטוקול זה, אנו גם מציגים שיטה לבידוד מיקרו של האפיתל חושית מן לימבוס ספירלה של האיבר של קורטי. בהליך זה, לימבוס הספירלה הוא גזור מן האפיתל חושית באמצעות 28G ½ מחטים אינסולין ככלים לנתיחה. כתוצאה מכך מיקרו לבודד מורכב שורות של תאים השיער ואת התאים המתאימים תמיכה (איור 3). אפיתל סנסורי מבודד אז יכול להיות מתורבת, כמתואר בפרוטוקול זה. הליך זה מיקרו הבידוד צריך להיות לעומת ההפרדה האנזימטית של epithelia החושי מן הרקמה הסובבת ^4. אצל יונקים, כמו גם מינים שאינם יונקים כגון תרנגולות, עיכול thermolysin שיווי המשקל של האיברים תוצאות מבודדים בבידוד של epithelia חושית מתאי מרתף mesenchymal ^4. ב עכברוש שבלול, התוצאות thermolysin העיכול בהפרדה הרכס אפיתל יותר, רכס אפיתל פחותים epithelia חושית מלווה מן הקרום המרתף ^5. עם זאת, לא ברור אם אפיתל סנסורי שבלול יכול לצרף את הצלחות בלי מצופים בתאים mesenchymal הנלווים. בעוד הן את שיטת בידוד מכני מיקרו עיכול אנזימטי שיטה לגרום להפרדת epithelia החושי מן לימבוס ספירלה, היתרונות של דיסקציה מיקרו לבודד את פני העיכול thermolysin לכלול בפרוטוקול קצר יחסית, ריאגנטים זול, מתח פוטנציאלי פחות explant בשל ההשפעות האנזימטית של העיכול. בנוסף, קרום המרתף נותר ללא שינוי בגישה זו, אשר עשוי לשפר את הקשר של האפיתל חושית הצלחת תרבות. החסרונות של שיטה זו כוללים את הצורך לפתח את הכישורים לנתיחה זה עדין נזק מכני פוטנציאל האפיתל חושית הנובע דיסקציה מיקרו.

כדוגמה השירות של הליך זה, אנו גם מציגים דוגמה אחת לשימוש של איבר שלקורטי תרבויות; electroporation של גנים ממקור חיצוני לתוך התרבות explant. ההליך electroporation שתוארו לעיל מבוסס על שיטות קודמות של איבר electroporation קורטי. יש לציין, נג ו גאו (2000) לתאר את electroporation של איברים עכברוש מבודד של קורטי שבו explants מוחזקים מקום electroporation ידי חריץ יצוק של agarose ו מצופה מכן על קולגן שקופיות מצופה 8-LabTek היטב במדיום סרום ללא ^2. היתרון של הגישה שלהם היא כי האיברים מכוונים כך משטחים העליון של explants פני הקתודה, אשר אמור תיאורטית לגרום הפצה גם של תאים electroporated ברחבי explant. בידיים שלנו לעומת זאת, השיטה שאנחנו מתארים שיפור על הליך זה, כי האיבר של קורטי נשאר מודבקת coverslip לאורך ההליך ובכך להפחית את המניפולציה של explant לאחר electroporation. בנוסף, אחוז גבוה יותר של איברים של קורטי נשאר קשור coverslips בשיטה זו המוצגים. השיטה שלנו נלקח ג'ונס, et al. (2006) אשר משתמשת תוספת של מגיב 6 Fugene כדי להגביר את היעילות של ביטוי גנים לאחר electroporation. בפרוטוקול Jones et al. (2006), איברים הם electroporated, מודגרות במשך 5 דקות עם 100 μL של מגיב 6 transfection Fugene, ו ⁶ מצופה. השיטה שלנו שונה בשימוש יחס 3:02 של מגיב 6 Fugene ל-DNA פלסמיד, אשר מצאנו אמפירית לתת ביטוי מהונדס אופטימלי עם רעילות איבר מינימלי. אנחנו לא משתמשים חי Fugene מגיב 6, אשר עלולה לגרום לרעילות של תרבויות. תצורת אלקטרודה בפרוטוקול שלנו, כמו גם ג'ונס et al. (2006), התוצאה היא ביטוי גנים העיקרי או הספירלה או לימבוס אפיתל סנסורי תלוי בעמדה של הקתודה. אמנם ישנם תאים חיובי DsRed בצד הרחוק של התרבות לקתודה, יש ריכוז גבוה של תאים מהונדס קרוב הקתודה. כדי להבטיח ביטוי מלא של transgene בשני צידי האיבר של קורטי explant, הזרם יכול להיות הפוך לרכבת הדופק השני על ידי היפוך פשוט מוביל. פרוטוקול התוצאות המוצגות ביטוי חזק של transgene לאורך האיבר של קורטי (איור 5).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כיסויות זכוכית למיקרוסקופ	DYNALAB Corporation	2010	קוטר 10mm, מעגל #1, עובי 1mm, אונקיה אחת
צלחת תרבית תאים עם 4 טבעות	Greiner Bio-One	627170	צלחת תרבית תאים סטרילית 35 X 10 mm עם 4 טבעות פנימיות
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957	תמיסה 0.01%
Laminin	BD Biosciences	354232	מיוצר בעכבר
סרום עגל עוברי (Fetal Bovine Serum)	Invitrogen	26140-095	מאושר (Qualified)
מספריים לניתוח	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-6806	ישרים, חד-קהה, אורך 5"
להב סקאלפל #11	BD Biosciences	372611
פינצטה Dumoxel #4	Fine Science Tools	11241-30
פינצטה עדינה Dumostar #55	Fine Science Tools	11295-51
מדיום Eagle משופר של Dulbecco’s (DMEM)	Invitrogen	10564-011	גלוקוז גבוה
סרום סוס	Invitrogen	2605088	מושבת בחום
מלח נתרק של Ampicillin	Invitrogen	11593-027	מקרין
מזרק אינסולין במינון נמוך ½ cc	BD Biosciences	329465	U-100 28G½
ריאגנט טרנספקציה Fugene 6	Roche Group	11-815-091-001
מבחנה פוליסטירן	Fisher Scientific	14-956-5A
מCב זרימה למינרית	The Baker Company (Stanford, ME)	Model SG603a	SterileGARD III Advanced Class II ארון בטיחות ביולוגית
מדיום Opti-MEM I עם סרום מופחת	Invitrogen	31985
פלסמיד רפורטר	Clontech Laboratories	632539	pCMV DsRed-Express 2
אלקטרופורטור	Bio-Rad	165–2662	BioRad Gene Pulser Xcell