פענוח מסלולים axonal של קבוצות מוגדרות גנטית של נוירונים התחתית צ'יק עצבית ניצול ב אובו Electroporation

Summary

וידאו זה מדגים כיצד לדמיין מסלולי axonal של קבוצות מוגדרות גנטית של נוירונים בחוט השדרה ניצול חומוס עובריים ב אובו Electroporation של גנים כתב תחת שליטתה של אלמנטים ספציפיים משפר.

Abstract

התעסוקה של אלמנטים משפר לנהוג הביטוי של גנים כתב בנוירונים הוא פרדיגמה בשימוש נרחב עבור מעקב הקרנת axonal. למעקב הקרנת axonal של interneurons השדרה חוליות, קו במיקוד נבט גנים כתב תשואה תיוג סימטרי בילטרלי. לכן, קשה להבחין בין ipsi ו קונטרה-רוחבית אקסונים מקרין. Electroporation חד צדדית לתוך הצינור העצבי חומוס מספק אמצעי שימושי להגביל את הביטוי של הגן כתב בצד אחד של מערכת העצבים המרכזית, ולעקוב אחר התחזית axonal משני הצדדים

Protocol

I. electroporation

ביצה טיפול

1. מניחים את הביצים באינקובטור להגדיר humidified ל 37-38 מעלות צלזיוס, עדיף באינקובטור עם מגשי נדנדה.
2. עובריים הם electroporated לאחר כ 66 שעות של דגירה, כשהם הגיעו המבורגר & המילטון (HH) שלב 18-20. בשלב זה הראש נמצא בזווית ישרה המטען (מצב הנקרא צוואר הרחם כפף) ומערכת המכריע של חוץ עובריים כלי דם, כגון קדמית, אחורית, ורידים על ימין ועל שמאל vitelline יש לראות. זהו השלב האופטימלי עבור הביטוי משפר תלויי ספציפי ^1,3,4. חשוב לפקח על הטמפרטורה והלחות של החממה, על מנת לקבל עוברים קיימא מסונכרן.
3. לאחר 66 שעות של דגירה, להסיר את הביצים מן החממה. מניחים את הביצים בצורה אופקית. חכה 5-10 דקות. העובר כרגע נמצא בקוטב העליון של הביצה.

ההכנות

1. הכן את הפתרון של האנק עם סטרפטומיצין / פניצילין (P / S) (1:100 דילול).
2. משוך זכוכית נימי (בקוטר 0.5 מ"מ) כדי microcapillary.
3. הנח את האלקטרודות (טונגסטן) לתוך micromanipulator ולהתחבר אלקטרודות מחולל את הדופק (ECM 830).
4. כוון את מחולל הדופק עם הפרמטרים הבאים: מתח 30V, מספר פולסים - 3, באורך של 50 מילישניות הדופק.
5. הכן פיפטה בפה, מחט מזרק קלטת.
6. הכינו תערובת של דנ"א הרצוי (2-5μg/μl) ולהוסיף צבע ירוק מהיר.

Windowing ו electroporation

1. באמצעות מזרק, להסיר 5-6 מ"ל של אלבומין מהביצה כל אחד.
2. עם מספריים קטנים לפתוח חלון סגלגל בצד העליון של הביצה.
3. העובר לחים עם 0.5-1ml פתרון + P / S של האנק.
4. השתמש פיפטה בפה, כדי לטעון את הכוס microcapillary בתערובת DNA.
5. מניחים את העובר עם הזנב כלפיך. בשלב זה, חוט השדרה של העובר נראה בבירור. לפיכך, טכניקות לא מנוגדים נדרשים. חוט השדרה הוא חתום בשני הקצוות, את הראש ואת הזנב, אבל אם microcapillary שלך הוא דק מספיק, תוכל לנקב חור קטן בצינור העצבי לחדור בזווית רדוד. Microcapillary בקוטר הנכון צריך להיות טעון בקלות עם ה-DNA, לחדור את הצינור ללא פגיעה בו ולשחרר את ה-DNA עם הנשיפה קבוע.
6. הזרק את ה-DNA בעזרת פיפטה בפה. צבע ירוק צריך להפיץ מקצה הזנב עד שלפוחית ​​של המוח המתפתח.
7. הנח את האלקטרודות במקביל הצינור העצבי, קרוב ככל שאתה יכול, בלי לגעת הצינור עצמו ואת הדופק. בזמן הדופק, אלקטרודות חייב להיות מכוסה נוזלי ומאפשר מוליכות חשמלית. בדרך כלל, סכום של יחזקאל הוסיף על מתחננים מספיק. אם לא להוסיף טיפה אחת של לפני רק של האנק הדופק.
8. בזהירות להסיר את האלקטרודות ולאטום את החלון עם קלטת. חשוב לאטום את הביצה לגמרי כדי למנוע התייבשות של העובר במהלך תקופת הדגירה הבאה.
9. מניחים את הביצים בחזרה בחממה.

השנייה. הכנת חוט השדרה פתוח הספר

ניתוק של חוט השדרה של העובר

1. הסר את העובר eletroporated, ב E6, מן הביצה ומניחים בצלחת פטרי מצופים סיליקון המכיל PBS.
2. חותכים ממנו את הקרומים ולמתוח את העובר בצד הגחון שלו באמצעות סיכות כדי להחזיק אותו.
3. שימוש טונגסטן חדה microcapillary לעשות חתך אורכי לאורך צלחת על הגג, מן למוח האחורי עד הזנב.
4. תן שני חתכים נוספים האורך משני צדי עמוד השדרה, ניתוק הגרעינים השורש הגבי (DRGs) במרחק חוט השדרה.
5. נתק את הצלחת הרצפה מרקמת החל הזנב עד למוח האחורי, משאיר את חוט השדרה שלם.
6. חותכים את חוט השדרה בקטע רוחבי ב למוח האחורי באמצעות מספריים בסדר להפריד אותו מהגוף.

קיבוע

1. מורחים את חוט השדרה מבודד בצלחת פטרי חדש מצופה סיליקון המכיל PBS, באמצעות סיכות כדי להחזיק אותו, מן למוח האחורי כדי לייצר זנב הכנה שטוח הר.
2. יוצקים את PBS מן המנה ולהחליפה paraformaldehyde 4% פוספט שנאגרו מלוחים.
3. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.

אימונוהיסטוכימיה

1. מעבירים את חוט השדרה קבוע לתוך בקבוקון המכיל נוגדנים העיקרי PBS.
2. דגירה עם בהסתה עדין מעל בלילה 4 ° C.
3. שוטפים את הנוגדנים X5 פעמים עם PBS, לשטוף כל שעה 1 עם בהסתה עדין.
4. הוספת נוגדנים משני דגירה עם בהסתה עדין מעל בלילה 4 ° C.
5. שוטפים את הנוגדנים X5 פעמים עם PBS, כל אחדלשטוף שעה 1 עם בהסתה עדין.

ספר פתוח הרכבה הדמיה

1. למרוח שמן או סיליקון בצורת מלבן בשקופית ו לטפטף בתוך PBS.
2. מניחים את חוט השדרה נמתח באמצע המלבן באמצעות פינצטה ולהסיק את נוזל מסביב עם פיפטה פסטר.
3. מקום 1-2 טיפות של התקשורת גובר על חוט השדרה ומכסים להחליק לכסות. סקווש זה כדי למנוע בועות אוויר.
4. שמור את שקופיות כהה 4 ° C.
5. בדוק את חוט השדרה באמצעות מיקרוסקופיה confocal.

Discussion

Electroporation של DNA פלסמיד לתוך העובר מתפתח אפרוח כטכניקה עוצמה בביטוי חוץ רחמי vivo. השילוב של משפרי ספציפי, electroporation חומוס מספק כלי מהיר ויעיל עבור פענוח מסלולים axonal של קבוצה מוגדרת גנטית של נוירונים ^1,3,5. ניצול Cre / LoxP ומערכות הגברה Gal4/UAS יכולים להגדיל את רמות ומשך הביטוי. התמונה המצטיירת היא של הבדלי מורכבת של אותות axonal הנובעת subpopulations interneuron, שהוגדר על ידי לכיוון תחזיות axonal שלהם. בנוסף, סימולטני תיוג מוגבלת מולקולרית המרחבי של ש...