הערכת התפלגות מרחבית של γH2AX הבאים בקרינה מייננת

Summary

ניתוח מיקרוסקופי של γH2AX מוקדים, אשר הטופס הבא זירחון של H2AX ב Ser-139 בתגובה פעמיים גדיל הדנ"א נשבר, הפך להיות כלי רב ערך בביולוגיה קרינה. כאן השתמשנו נוגדנים מונו מפוגל היסטון H3 ב ליזין 4 כסמן epigenetic של euchromatin פעיל לתעתוק, כדי להעריך את הפריסה המרחבית של היווצרות γH2AX קרינה הנגרמת בתוך הגרעין.

Abstract

תגובה מולקולרית מוקדם הדנ"א הכפול גדיל הפסקות (DSBs) הוא זירחון של שאריות סר 139-מוטיב בתוך הטרמינל SQEY של ^1,2 H2AX היסטון. זירחון זה של H2AX מתווכת על ידי phosphatidyl inosito-3-kinase (PI3K) משפחה של חלבונים, אטקסיה telangiectasia מוטציה (ATM), ה-DNA למקטע החלבון קינאז קטליטי ATM ו RAD3 הקשורות (ATR) ^3. צורת פוספורילציה של H2AX, המכונה γH2AX, מתפשט לאזורים סמוכים של הכרומטין מהאתר של DSB, ויוצרים מוקדים נפרדים, שהם דמיינו בקלות באמצעות מיקרוסקופ immunofluorecence ^3. ניתוח quantitation של γH2AX מוקדים כבר בשימוש נרחב על מנת להעריך היווצרות DSB ותיקון, בעיקר בתגובה לקרינה מייננת ו להערכת היעילות של קרינה שונים שינוי תרכובות תרכובות ציטוטוקסיות ^4.

לאור רגישות וספציפיות מעולה של סמן זה דה נובו של DSBs, זה סיפק תובנות חדשות על תהליכים של נזק לדנ"א ותיקון בהקשר של הכרומטין. לדוגמה, ביולוגיה קרינה הפרדיגמה המרכזית היא כי ה-DNA גרעיני היא מטרה קריטית לגבי רגישות לקרינה. ואכן, הסכמה כללית בתחום כבר במידה רבה כדי להציג הכרומטין כתבנית הומוגנית עבור נזק לדנ"א ותיקון. אולם, עם השימוש γH2AX כסמן המולקולרי של DSBs, פער γ-קרינה-Induced היווצרות מוקדים γH2AX ב euchromatin ו heterochromatin נצפתה ^5-7. לאחרונה, השתמשנו פאנל של נוגדנים או מונו, די או תלת מפוגל היסטון H3 ב ליזין 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) אשר טביעות epigenetic של heterochromatin המכונן ועל ההשתקה תעתיק וליזין 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 ), אשר מתואמים היטב פעיל לתעתוק euchromatic האזורים, כדי לחקור את הפריסה המרחבית של γH2AX בעקבות קרינה מייננת ^8. בהתאם לרעיונות הרווחת לגבי ביולוגיה הכרומטין, הממצאים שלנו מצביעים על קשר הדוק בין היווצרות γH2AX ו שעתוק פעיל ^9. כאן אנו להדגים שיטה immunofluorescence שלנו עבור איתור quantitation של γH2AX מוקדים שאינם חסיד תאים, עם דגש מיוחד על שיתוף לוקליזציה עם סמנים epigenetic אחרים, ניתוח תמונה-3D דוגמנות.

Protocol

תא הכנה

1. האדם erythroleukemic K562 התאים גדלים בינוני 1640 RPMI בתוספת 10% (v / v) בסרום שור עוברית 20 מ"ג / מ"ל גנטמיצין בסביבה humidified 5% CO ₂ ב 37 ° C.
2. כ 18 שעות לפני מכתים לשטוף התאים גדל באופן אקספוננציאלי (אופטימלי בבית 5 x 10 ⁵ תאים / מ"ל) עם פוספט בופר סליין (PBS), resuspend בתקשורת צח ולחזור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
3. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS על ידי צנטריפוגה בסל"ד כ 1500 למשך 5 דקות resuspend ....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מכון רוזוול פארק ממוריאל -1640 (RPMI-1640)	מדיום גידול	Invitrogen	22400071	RPMI-1640, מדיום pH 7.4 בתוספת 10% (v/v) בקר עוברי, 2 מ"מ L-גלוטמין, 20μ גרם/מ"ל גנטמיצין, 20 מ"מ (HEPES) N-2-הידרוקסיאתיל פיפרזין-N'-2-חומצה אתנסולפונית
סרום בקר עוברי (FBS)		Sigma-Aldrich	F2442
סרום בקר אלבומין (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) משמש לחסימת כל קשירת נוגדנים לא ספציפית. נוגדנים ראשוניים ומשניים מדוללים ב-BSA.
PBS (ללא Ca2+ ו-Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
Trypan blue		Sigma-Aldrich	T6146	משמש להבחנה בין תאים חיים ומתים.
טריטון X-100	ריאגנט	סיגמא-אולדריץ'	T8787	טריטון X-100 (0.1%) משמש לחדירת תאים.
ריאגנט	פרפורמלדהיד	סיגמא-אולדריץ'	158127	פרפורמלדהיד (4%) המשמש לקיבוע תאים.
נוגדן חד שבטי נגד פוספו היסטון-H2AX של עכבר	נוגדן ראשוני	EMD Millipore	16193	דילול של נוגדן ראשוני (1:500), ב-1% BSA.
HistoneH3 (מונו-מתיל K4)	נוגדן ראשוני		Abcam AB8895
Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר IgG (H+L)	נוגדן משני	Invitrogen	11029	דילול של נוגדן משני (1:500), ב-1% BSA.
Alexa Fluor 546 עז אנטי-ארנב IgG (H+L)	נוגדן משני	Invitrogen	11035
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen	T3605	TOPRO3 הוא צבע DNA עם ABS/Em של 642/661 ננומטר. ניתן להשתמש ב-DAPI אם המיקרוסקופ הקונפוקלי מצויד בלייזר 405 ננומטר.
ProLong Gold	תמיסה נגד דהייה	Invitrogen	P36930	יש להשתמש במדיום הרכבה מבוסס גליצרול זה עם עדשה על בסיס שמן התואמת את מקדם השבירה שלה.
שקופיות		מנזל-גלייזר
כיסויים (22x50 מ"מ)	כיסויים	מנזל-גלזר	CS2250100
בקבוק תרבית	כובע מאוורר	BD Biosciences	353112
שנדון ציטוספין 4		תרמו פישר סיינטיפיק, בע"
משפכי ציטו	שנדון, בע"
כרטיסי		שנדון, בע"מ
צנצנת קופלין, זכוכית		Grale Scientific P/L	1771-OG
שוקת		Grale Scientific P/L	V1991.99
PAP Pen		Zymed Laboratories, Inc.
גמאסל 1000 עלית Irradiator	גמא אירדיאטור נורדיון	אינטרנשיונל בע"מ
Zeiss LSM 510 מיקרוסקופ			קונפוקלי מטא קונפוקלי	מצויד ב-3 לייזרים: 488 ננומטר, 543 ננומטר ו-633 ננומטר.
תוכנת Metamorph	לניתוח הדמיה			מולקולריים