$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. שיבוט שיקולים
- Oligonucleotides מוכן מסחרית המייצגת את TMD עניין מוקף NheI ואתרי BamHI הגבלה 5'-פוספורילציה ניתן ligated לתוך pTox7 (שונה במעבדה שלנו על ידי החדרה של זוג אחד בבסיס ישירות אחרי האתר מגבלה BamHI 14) (איור 3) מתעכל ברצף עם BamHI ו NheI. Oligonucleotide דוגמה מוצג להלן:
5'ctagcTMDSEQUENCEg3 "
3 "gTMDSEQUENCEcctag5"
רצף TMD צריך להיות 12-24 שאריות (רצפים קצרים יותר יהיה כנראה להיות מוארך על ידי וקטור שאריות מקודדים הידרופובי). על מנת לחקור את הממשק, ארבע גרסאות של עיצוב TMD יש ליצור שם הוספות שאריות רציפים שאריות מחיקות במקביל לגרום סיבוב של קרוב ל TMD ToxR. 15,16 לבסוף, ריכוז arabinose צריך להיות נע בין 0.001 ו - 0.01% (w / v) כדי לזהות את הריכוז המרבי שבו ההבדלים β-galactosidase אותות בין רצפים שונים TMD הם נצפו; בדיקת רמות ביטוי שונות מומלץ לזהות את התנאים בהם זיקות שונות ניתן להבחין בין הטוב ביותר. בנוסף arabinose ואנטיביוטיקה, 0.4 mM IPTG יכול לשמש כדי לשפר את ההבדלים של זיקות בין TMDS שונים. המדידה ToxR יש לבצע לפחות ארבע פעמים. ההליך כולו יש לחזור לפחות שלוש פעמים עם הפלסמיד טרנספורמציות שונות.
2. צמיחה של תרבויות חיידקית
- בעדינות להפשיר FHK12 תאים המוסמכת (200 μl) על הקרח ולהעביר לתוך צינור תרבות 15 מ"ל. הוסף ה-DNA פלסמיד (200 ng) ו דגירה התאים על קרח למשך 30 דקות.
- חום הלם תאים על ידי הדגירה של 90 על 42 מעלות צלזיוס, ואחריו הדגירה על קרח דק '2.
- הוסף SOC התקשורת (800 μl) ו דגירה דגימות ב 37 ° C עם רועד (300 סל"ד) אחד ח
- לחסן 5 LB התקשורת מ"ל עם chloramphenicol (30 מיקרוגרם / מ"ל) ו arabinose (0.0025% w / v) עם 50 μl של התערובת שינוי ב 15 תרבות צינורות מ"ל בשלושה עותקים. דגירה דגימות ב 37 ° C עם רועד (300 סל"ד) למשך 20 ח (לחלופין 5 μl של התרבות ניתן לחסן 100 μl של המדיום בצלחת 96-היטב. שיטה זו יעילה כאשר מדובר במספרים גדולים של דגימות, למרות שגיאות יהיה מעט גבוה יותר. על מנת למנוע אידוי, אשר יוביל טעות, למלא את בארות החיצונית עם התקשורת, אבל לא להשתמש בהם דגימות. לבסוף, פעמיים לעטוף את משותף בין המכסה את הצלחת עם parafilm).
3. מדידה של פעילות β-galactosidase
- מחממים את צלחת הקורא 28 ° C.
- העברת ה-Z כליקול לתוך מאגר עם טיפ גדול פיפטה, מקפיד לקחת רק את השכבה העליונה (מימית). העברת 100 μl של Z-buffer/chloroform מוכן טרי על בארות צלחת 96-היטב. העברת 5 μl של כל תרבות לתוך בארות הצלחת ארבע פעמים. השמט את התרבות מארבע הבארות אשר תשמש את החסר.
- מדוד את OD 595 הצלחת לקבוע צפיפות התאים.
- הוסף 50 μl של Z-buffer/SDS לכל הבארות של הצלחת. לנער את הצלחת לקורא הצלחת עבור 10 דקות עד lyze התאים. ודא השעיות תא ברורים לאחר תמוגה וחזור על צעד רועד אם נדרש. תמוגה הושלמה מציע את Z-buffer/chloroform לא היה מוכן טרי.
- הוסף 50 μl מוכן טרי Z-buffer/ONPG לכל הבארות ולהחזיר את צלחת לקורא את הצלחת למדוד OD של 405 כל 30 דקות 20.
- חישוב β-galactosidase הפעילות באמצעות המשוואה הבאה (לזכור להפחית את ריק). יחס של 405 OD / min צריך להיות מחושב באמצעות כל נקודות הנתונים בטווח OD 405 0.0-1.0 באמצעות מודל ליניארי מתאים.
יחידות מילר שונים לפעמים כאשר רשמה בימים שונים. לכן, לבנות התייחסות כמו GPA צריך להימדד כל בדיקה. הערכים שלו יכול לשמש לנורמליזציה של ערכי ToxR.
4. הבקרה של ביטוי חלבון
- בצע המערבי סופג כדי לוודא אפילו ביטוי חלבון בין המבנים. שלב 50 μl של התרבויות בשלושה עותקים ו צנטריפוגה (2000 סל"ד, 4 דקות) ב microcentrifuge. הסר את supernatant ידי pipetting ו resuspend גלולה שיורית 2 חיץ טעינת x המדגם.
- טען 7.5 μl על ג'ל 8% סטנדרטי ולבצע electrophoreses ב V 125 דקות, 1 שעה 5. לאחר ההעברה, דגירה עם נוגדן HRP-מצומדות אנטי MBP ולדמיין; חלבון כימרי הוא ציין בכ 70 kDa עם כמה מוצרים השפלה לראות לפעמים סביב 48 kDa. MBP אנדוגני הוא ציין גם 45 kDa (ראה איור 5).
5. הבקרה של הכנסת ממברנה פרופר
קו תא חסר חלבון מחייב מלטוז משמש כדי להעריך את ההכנסה קרום תקין של לבנות את TMD chimeric. כאשר גדל על התקשורת מינימלי עם מלטוז כמקור פחמן יחיד, רק תאים להביע קרום בלתי נפרד מוצר ביטוי עם חלבון מלטוז מחייב ממוקם כראוי periplasm מסוגלים לגדול.
- המרה PD28 תאים (כפי שתואר עבור FHK12 תאים) ו לחסן 2 מ"ל של מדיום LB. לגדל את התאים ב 37 ° C עם רועד (300 סל"ד) למשך הלילה.
- גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 3500 סל"ד, 10 דק ', 4 ° C ולשטוף ידי resuspension ב PBS (2 מ"ל) על ידי pipetting עדין עם טיפ גדול או vortexing עדין. גלולה התאים (לעיל), לשטוף עם PBS בפעם השנייה, גלולה ו resuspend לבסוף PBS (1 מ"ל).
- השתמש 25 μl של תאים resuspended לחסן 5 התקשורת מינימלי מ"ל בשלושה עותקים לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רועד (300 סל"ד). קח OD 595 קריאות בין 15-25 שעות, בערך כל 2 שעות על ידי העברת 200 μl של כל דגימה לתוך צלחת 96-היטב וקריאה באמצעות צלחת הקורא.
6. נציג תוצאות:
דוגמה לשימוש assay כתב ToxR תעתיק לנתח את הנטייה oligomerization של תחומים הטרנסממברני ב שמוצג באיור 4. בעבר אנחנו בחנו את oligomerization של תחומים הטרנסממברני מן multispanning קרום בלתי נפרד סמויה קרום חלבון חלבון-1 (LMP-1) על ידי טכניקות שונות, לרבות ToxR 14 תחום הטרנסממברני חמישה (TM5) הוצגה התערוכה נטייה חזקה oligomerize. זו באה לידי ביטוי גבוהה יחידות מילר, להשוות שליטה חיובית, GPA, רצף ומבוססת dimerizing. מוטציה מזיקה ב TM5, D150A, מפחית את היכולת של הרצף כדי oligomerize. LMP-1 TM1 לא oligomerize משמעותית ותערוכות אות נמוך מאוד מילר היחידה, בדיוק מעל האות עבור ריק, לא שינו FHK12 תאים.
קריקטורה איור 1. המתארת את assay כתב ToxR. תחום הטרנסממברני (TMD) מונע תוצאות oligomerization ב dimerization של ToxR והפעלה של שעתוק LacZ. מוצר הגן של LacZ, β-galactosidase ניתן לכמת כמדד הנטייה של TMD כדי oligomerize.
איור 2. מחשוף hydrolytic של ONPG ידי β-galactosidase תוצאות בייצור של המינים קליטת אור O-nitrophenolate (ONP).
איור 3. המפה פלסמיד של pToxR7.
איור 4. Assay נציג ToxR כתב תעתיק ניתוח הנטייה oligomerization של קרום סמוי חלבון-1 תחומים הטרנסממברני. תחום הטרנסממברני 5 (TM5) oligomerizes בתוקף, בעוד תחום הטרנסממברני 1 (TM1) מוצגים רק האינטראקציה החלשה. D150A מוטציה TM5 מפחית באופן משמעותי את יכולתה oligomerize. GPA נכלל כרצף בקרה חיובית dimerization חזק. ריק מייצג untransformed FHK12 תאים.
איור 5. כתם המערבי לביטוי חלבונים.
איור 6. PD28 assay השלמה לשלוט על הכניסה קרום הנכונה periplasm. בקרה שלילית מייצגת לבנות חסר חלבון מחייב מלטוז.