הליך יעיל להעריך את הנטייה oligomerization יחיד לעבור תחומים הטרנסממברני (TMDS) מתואר. חלבונים כימרי המורכב TMD התמזגו ToxR באים לידי ביטוי למתח כתב החיידק. TMD-Induced oligomerization גורם dimerization של ToxR, הפעלת שעתוק וייצור חלבונים הכתב,-galactosidase.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
דומיין הטרנסממברני Oligomerization הנטייה נקבע על ידי Assay ToxR
במאמר זה
סיכום
תקציר
התצוגה פשטני של תחומים הטרנסממברני חלבון רק עוגנים bilayers פוספוליפידים מכבר מופרכת. במקרים רבים קרום פורש חלבונים התפתחו מנגנונים מתוחכמים ביותר של פעולה. 1-3 דרך אחת שבה חלבונים בממברנה יכולים לווסת את המבנים שלהם פונקציות היא על ידי מגע ישיר וספציפי של סלילים הידרופובי, להרכיב oligomers הטרנסממברני מובנים. 4,5 האחרונות הרבה העבודה התמקדה הפצה של חומצות אמינו נמצאו מועדף בהשוואה בתמיסה מימית לבין כוחות מולקולאריים שונים חלבון כונן העמותה. 6,7 עם זאת, מחקרים של הכרה מולקולרית בבית תחום הטרנסממברני של חלבונים עדיין מפגרת אלה בסביבת קרום מסיס במים אזורים. המכשול העיקרי שנותר: למרות הספציפיות מדהים זיקה כי oligomerization הטרנסממברני יכולים להשיג, 8 מדידה ישירה של הקשר שלהם הוא מאתגר. מתודולוגיות מסורתית להחיל ללמוד את תפקוד הממברנה נפרד חלבון יכול להיות הקשו על ידי שבחוסר הטבועה של רצפים תחת בחינה. תובנות Biophysical זכה ללמוד פפטידים סינתטיים המייצגים תחומים הטרנסממברני יכול לספק תובנה מבניים שימושי. עם זאת, הרלוונטיות הביולוגית של micellar את חומר הניקוי או מערכות liposome שימוש במחקרים אלה לחקות ממברנות הסלולר מוטלת בספק לעתים קרובות, לעשות פפטידים לאמץ מבנה יליד דמוי בתנאים אלה ועושה התנהגות פונקציונלי שלהם באמת משקפים את מצב הפעולה בתוך קרום יליד ? כדי ללמוד את יחסי הגומלין של רצפי הטרנסממברני ב bilayers פוספוליפידים טבעיים, פיתחה את מבחני המעבדה Langosch ToxR כתב תעתיק. 9 תחום הטרנסממברני עניין מבוטא חלבון כימרי עם חלבון מחייב מלטוז עבור מיקום periplasm ו ToxR לספק דו"ח רמת oligomerization (איור 1).
בעשור האחרון, קבוצות אחרות (למשל אנגלמן, דגראדו, שי) אופטימיזציה נוספת ויישומי assay זה כתב ToxR. 10-13 מבחני ToxR שונים הפכו להיות תקן הזהב לבחון חלבונים אינטראקציות קרום התא. אנחנו כאן להדגים פעולה ניסיוני טיפוסי שנערך במעבדה שלנו בעיקר כדלקמן פרוטוקולים שפותחו על ידי Langosch. שיטה זו החלה בדרך כלל שימושי ניתוח של תחום העמותה עצמית הטרנסממברני ב E. coli, שבו β-galactosidase ייצור משמש כדי להעריך את הנטייה oligomerization TMD. עם dimerization TMD-Induced, ToxR נקשר האמרגן ctx גרימת עד ויסות של הגן LacZ עבור galactosidase-β. Readout colorimetric מתקבל על ידי תוספת של ONPG לתאי lyzed. מחשוף hydrolytic של ONPG ידי β-galactosidase תוצאות בייצור של המינים קליטת אור O-nitrophenolate (ONP) (איור 2).
פרוטוקול
1. שיבוט שיקולים
- Oligonucleotides מוכן מסחרית המייצגת את TMD עניין מוקף NheI ואתרי BamHI הגבלה 5'-פוספורילציה ניתן ligated לתוך pTox7 (שונה במעבדה שלנו על ידי החדרה של זוג אחד בבסיס ישירות אחרי האתר מגבלה BamHI 14) (איור 3) מתעכל ברצף עם BamHI ו NheI. Oligonucleotide דוגמה מוצג להלן:
5'ctagcTMDSEQUENCEg3 "
3 "gTMDSEQUENCEcctag5"
רצף TMD צריך להיות 12-24 שאריות (רצפים קצרים יותר יהיה כנראה להיות מוארך על ידי וקטור שאריות מקודדים הידרופובי). על מ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Assay כתב תעתיק ToxR היא דרך קליל לזהות רצפי הטרנסממברני עם פוטנציאל oligomerize. מאז האינטראקציות מתרחשות בתוך הקרום הפנימי חיידקי, assay זה עוקף את הנושאים הקשורים תוקפו של מערכות הלומדים קרום כוזב סביבות. בהתחשב בכך שיבוט של TMDS מרובים לתוך פלסמיד אחד יכול בקלות להתבצע במקביל assay כולו יכול להתבצע במתכונת-96 גם צלחת, assay זה יכול לשמש עבור ניתוח תפוקה גבוהה של מספר גדול של רצפי חלבונים. 17 לאחר האינטראקציה זוהה, שאריות התפקודית מפתח יכול להיות נחקר על ידי ניתוח מו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
אנו מודים המכונים הלאומיים לבריאות (1R21CA138373 ואת לעמוד סרטן (SU2C) עבור תומך הכספיים של עבודה זו. ח.י. היא אסירת תודה על פרס 2009 עליון מן האגודה האמריקאית לחקר הסרטן, פרס המלומד קימל מן סידני קימל קרן לחקר הסרטן (SKF-08-101), ואת הקרן הלאומית למדע הקריירה המוקדמת הפקולטה פרס (NSF0954819).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | הערות (אופציונלי) |
| BamHI אנזים הגבלה | Invitrogen | 15201023 | אנזימים Invitrogen נמצאו להיות יעיל יותר ספקים חלופיים |
| NheI אנזים הגבלה | Invitrogen | 15444011 | אנזימים Invitrogen נמצאו להיות יעיל יותר ספקים חלופיים |
| 15 תרבות צינורות מ"ל | פישר סיינטיפיק | 14-956-1J | |
| SOC התקשורת | Teknova | S0225 | Made עד נפח המתאים מעוקרים ידי מעוקר. |
| LB התקשורת | סיגמא אולדריץ | L7275 | Made עד נפח המתאים מעוקרים ידי מעוקר. |
| Chloramphenicol | סיגמא אולדריץ | CO 3 78 | פתרון במלאי של 30 מ"ג / מ"ל באתנול מאוחסן במקפיא |
| Arabinose | Fluka | 10839 | פתרון במלאי של 2.5% (w / v) במים לאחסן במקפיא |
| Na 2 HPO 4 | סיגמא אולדריץ | S9390 | |
| לאא 2 PO 4 | סיגמא אולדריץ | S9638 | |
| KCl | Mallinckrodt כימיקלים | 6858-06 | |
| MgSO 4 0.7 H 2 O | סיגמא אולדריץ | 63138 | |
| נתרן dodecylsulfate (SDS) | סיגמא אולדריץ | L6026 | |
| 2-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside (ONPG) | סיגמא אולדריץ | 73660 | |
| Z-כליקול | 16.1 גרם Na 2 HPO 4 5.5g לאא 2 PO 4 0.75g KCl 0.246g MgSO 4 בצע עד 1 ליטר, 7.0 pH | ||
| Z-buffer/chloroform | 200 מ"ל β-mercaptoethanol, 2 מ"ל כלורופורם, להפוך עד 20 מ"ל עם Z-כליקול. וורטקס עבור צנטריפוגות 1 דקות, 1 דקות ב 800 סל"ד. בצע טרי כל צלחת. | ||
| Z-buffer/SDS | 160 מ"ג SDS מומס 10 מ"ל Z-כליקול | ||
| Z-buffer/ONPG | 40 מ"ג ONPG ב 10 מ"ל Z-כליקול. בצע טרי כל צלחת | ||
| β-mercaptoethanol | Calbiochem | 444203 | |
| Anti-MBP נוגדנים חד שבטיים (HRP מצומדות) | חוד | E8038S | |
| התקשורת מינימלי עם מלטוז | 1 x M9 מלחים, מלטוז 0.4%, 1 מ"ג / מ"ל תיאמין, 2 מ"מ MgSO 4 | ||
| 96-היטב לתחתית צלחת שטוחה | Sarstedt | 83.1835.300 | |
| פלייט קורא | Beckman Coulter | DTX880 Multimode גלאי | |
| המים באמבטיה | VWRI | 89032-204 | |
| טלטול חממה | FormaScientific |
מקורות
- Parker, M. S. Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices. Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).
- Mo, W., Zhang, J. T.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
