הקרנית היא ייחודית בכך שהיא חסרה רקמות כלי הדם. עם זאת, כלי דם חזקים צמיחה והישרדות יכול להיגרם על הקרנית על ידי גורמים angiogenic עוצמה. לכן, הקרנית יכול לספק לנו עם כלי רב ערך עבור מחקרים angiogenic. פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע את המודל של העכבר assay הקרנית כיס וכיצד להעריך את אנגיוגנזה המושרית על ידי גורמים angiogenic באמצעות המודל הזה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
במודל עכבר של Assay את הקרנית Pocket לחקר אנגיוגנזה
במאמר זה
סיכום
תקציר
קרנית נורמלית ברורה של רקמות כלי הדם. עם זאת, כלי הדם יכול להיגרם לגדול לשרוד הקרנית כאשר גורמים angiogenic חזק מנוהלים 1. הייחוד הזה הפך את הכיס הקרנית assay אחד המודלים הנפוצים ביותר ללימודי אנגיוגנזה. קרנית מלחינה מספר שכבות של תאים. לפיכך, ניתן להטביע גלולה המכילה את גורם angiogenic עניין הקרנית לחקור השפעה angiogenic שלה 2,3. כאן, אנו מספקים צעד אחר צעד הפגנה של איך (אני) לייצר את גורם המכילים angiogenic גלולה (II) להטביע את הכדור לתוך הקרנית (III) לנתח את אנגיוגנזה הנגרמת על ידי גורם angiogenic של עניין. מאז פיברובלסטים בסיסי גורם הגדילה (bFGF) ידוע בתור אחד הגורמים החזקים ביותר angiogenic 4, הוא משמש כאן כדי לגרום אנגיוגנזה בתוך הקרנית.
פרוטוקול
כל ציוד ריאגנטים בהם נעשה שימוש הם עקרים. פרוטוקול שאושר על ידי טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה (ACUC) בשעה ניי / NIH (פרוטוקול המחקר בבעלי חיים ניי-553), וכן בוצע על פי הנחיות NIH והתקנות.
1. הפקת angiogenic גורם המכילים כדוריות
בחלק זה, כדורי המכיל את גורם angiogenic עניין מוכנים.
- הפוך את 10% (w / v) פתרון sucralfate עם PBS. חנות מתחת לטמפרטורת החדר.
- הפוך את 12% (w / v) poly-המה עם אתנול אבסולוטי. חנות מתחת לטמפרטורת החדר.
- ודא 1 מיקרוגרם / פתרון bFGF μl. חנות ב -80 ° C.
- כדי להפוך את 50 כדורי, לערבב 5 μl של poly-המה, 1μl של sucralfate ו 4 μl של פתרון מניות bFGF, מערבולת ביסודיות.
- מניחים פיסת parafilm נקי בצלחת פטרי, לחשוף אותו תחת אור UV במשך 15 דקות במנדף בתרבית רקמה. Drop 0.2 μl של התערובת פתרון parafilm אחת גלולה. לפיכך, 10 μl של התערובת צריך פתרון תשואה 50 כדורי. בואו כדורי יבש בטמפרטורת החדר למשך 1-2 שעות. כדורי יבשים ניתן לאחסן 4 מעלות במשך כמה ימים, או -80 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.
- לאחר השימוש, לחלץ ולאסוף את כדורי בקצות בזוג מלקחיים. היזהרו מאוד לא לשבור אותם או להפוך אותם באביב משם.
2. ביצוע הקרנית עכבר assay כיס
בחלק זה, נדגים כיצד להכין כיס בתוך הקרנית העכבר כיצד להוסיף גלולה לכיס. גורם angiogenic הכלול גלולה ישוחררו בהדרגה והסביבה של הקרנית (איור 1). בהפגנה זו, אנו משתמשים 8 שבועות הנקבה C57/Bl6 עכברים.
- העכבר הוא עמוק בהרדמה שיטתי בתערובת של קטמין (75 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (5mg/kg, הזרקת ip). זה ימשיך את העכבר תחת הרדמה מדינה דקות 30-60. הרדמה מקומית (0.5% proparacaine HCl) על הקרנית. לאחר 5 דקות, לתקן עין אחת תחת מיקרוסקופ לנתח.
- חתך עדין מאוד מורכב באמצע של 1.2 מ"מ -1.4 קרנית מן לימבוס הקרנית (כפי שמוצג באיור 1) עם סכין גרפה קטרקט פון. היזהרו מאוד לא לחתוך הקרנית.
- כיס עשוי מתחת לשכבת האפיתל של הקרנית על ידי החדרת אופקית את הסכין באמצע הקרנית ולהרחיב את הסכין לעבר בזהירות לימבוס (תמונה 1). גודלו של כיס צריך להיות גדול מספיק כדי להכיל גורם אחד המכיל angiogenic גלולה. היזהרו מאוד לא לנקב דרך הקרנית.
- הכנס גלולה עם זוג מלקחיים לכיס לאט. נסו להפוך את גלולה ישר ככל הניתן.
- לאחר ההשתלה של גלולה, משחה אנטיביוטית אקטואלי עיניים מוחל על העין. מכשירים הם ניגב עם רפידות אלכוהול 70% בין בעלי חיים.
- הזז את העכבר לאזור חם ויבש ולנטר אותו, עד שהוא מסוגל לשמור על יציבה זקופה, ואז להחזיר אותו בכלוב בבית שלה. משככי כאבים מערכתית (למשל, עצירות, 2 מ"ג / ק"ג, הזרקת IP) משחה אנטיביוטית מקומית (למשל גנטמיצין) ניתנות פעמיים ביום למשך 2 ימים לאחר הניתוח והעכבר הוא פיקוח הדוק במשך 3 ימים. ריפוי צפויה להשלים בתוך 48 השעות הראשונות שלאחר הניתוח. העין עם הכיס תיבחן תחת בהיקף biomicro מנורת סדק בין 4-10 ימים לאחר ההשתלה גלולה.
3. נציג תוצאות
- שבעה ימים לאחר ההשתלה גלולה, העכבר הוא הרדים מערכתית ו topically כמתואר 2.1.
- שים לב כלי דם בקרנית הנגרמת על ידי גורם angiogenic תחת מיקרוסקופ לנתח. ב הקרנית שטופלו רכב, צמיחה אין כלי דם ניתן לראות (איור 2A, רכב שטופלו הקרנית). ב הקרנית שטופלו bFGF, אנגיוגנזה חזקים ניתן לראות (איור 2 ב). צמיחת כלי הדם ניתן להעריך באמצעות האורך המרבי של כלי הדם (מכלי limbal נורמלי העליון של כלי דם חדשים), וכן כלי דם באזורים הכולל (איור 2B, שמסומן עם קו מקווקו אדום bFGF שטופלו הקרנית). שיטות כימות אחרים יש גם תיאר 2,5.
באיור 1. הקרנית. רגיל עם H & E מכתים. אין כלי דם קיים קרנית רגילה. B. הפוך כיס מתחת לשכבת האפיתל של הקרנית. ג. הטבעת גלולה לכיס. ד. גורם angiogenic הוא שוחרר מן גלולה, ואת כלי דם חדשים לגדול מ כלי limbal נורמלי.
איור 2. התוצאה נציג חמישה ימים לאחר imמטע של גלולה.. קרנית עם גלולה המכילה רק את הרכב. ללא היווצרות כלי דם חדשים בתוך הקרנית. רק קיימים כלי limbal נורמלי גלויים. B. קרנית עם bFGF גלולה המכילה. חסון כלי דם חדשים (dot מצופה) גדל מ קיימים כלי limbal נורמלי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
קרנית העכבר כיס מודל assay תוארה לראשונה על ידי Muthukkaruppan VR ו R אורבך 6 בשנת 1979. פרוטוקולים מפורטים פורסמו על ידי מעבדות שונות 2,3,7,8. במעבדה שלנו יש שינוי בשימוש בשיטה זו במחקרים שלנו במשך שנים רבות 4. קרנית עכבר assay בכיס הוא מודל פשוט יחסית עם שחזור נהדר. יתרון נוסף של מודל זה היא כי מאז הקרנית בדרך כלל חסר כלי דם, יש כמות מינימלית של רקע assay זה. לכן, מודל זה הוא הנפוץ ידי השדה כדי לחקור את ההשפעה של גורמים angiogenic מולקולות שונות....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
המחקר שלנו הוא נתמך על ידי תוכנית המחקר עירונית של, NIH National Eye Institute.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ציוד | חברה | מספר קטלוגי | |
| הביתור מיקרוסקופ | העולם מכשירי דיוק | PZMIV-BS | |
| פון גרפה קטרקט סכין (להב 1.5x25mm, שטוחה) | אמבלר כירורגי | 3401E | |
| דומון # 5 מלקחיים | המדע כלים פיין | 11252-50 | |
| מנורת סדק | Zeiss | 30 SL-M |
טבלה 1. ציוד
| מגיב | חברה | קטלוג # | תגובות |
|---|---|---|---|
| bFGF (גורם בסיסי הצמיחה פיברובלסטים) | PEPROTECH בע"מ | 100-18 ב | |
| Sucralfate (octasulfate אלומיניום מורכבים סוכרוז) | סיגמא | S0652 | 10% PBS |
| poly-המה (פולי (2-hydroxyethyl methacrylate)) | סיגמא | P3932 | 12% אתנול |
טבלה 2. ריאגנטים וחומרים
מקורות
- Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor. The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nature. 2, 2545-2550 (2007).
- Poche, R. A., Saik, J. E., West, J. L., Dickinson, M. E. The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs. Cold Spring Harbor protocols. , 5416-54 (2010).
- Zhang, F. VEGF-B is dispensable for blood vessel growth but critical for their survival, and VEGF-B targeting inhibits pathological angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 106-6152 (2009).
- Tong, S., Yuan, F. Dose response of angiogenesis to basic fibroblast growth factor in rat corneal pocket assay: I. Experimental characterizations. Microvascular research. 75, 10-15 (2008).
- Muthukkaruppan, V., Auerbach, R. Angiogenesis in the mouse cornea. Science. 205, 1416-1418 (1979).
- Ziche, M. Corneal assay for angiogenesis. Methods in molecular medicine. 46, 131-142 (2001).
- Ziche, M., Morbidelli, L. The corneal pocket assay. Methods in molecular biology. 467, 319-329 (2009).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
