השרוול הצרת המוצגים במאמר זה נועד לגרום לטרשת עורקים בעורק התרדמה Murine משותף. בשל בצורת חרוט של לומן הפנימי שלה את האזיק מושתל יוצרת אזורים מוגדרים היטב של מתח נמוך, גזירה גבוהה oscillatory מפעילה את התפתחות טרשת עורקים של פנוטיפים דלקתיות שונות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
השרשה של קאף הראש מפעילה שאר מתח טרשת עורקים המושרה עכברים
במאמר זה
סיכום
תקציר
מקובל כי שינויים גזירה הלחץ בכלי הדם לעורר את הביטוי של גנים דלקתיים בתאי האנדותל ובכך לגרום לטרשת עורקים (הנסקרת ב 1 ו -2). תפקידה של מתח גזירה נחקרה בהרחבה במבחנה חוקרת את ההשפעה של זרימה על הדינמיקה לתאי אנדותל בתרבית 1,3,4 ו - in vivo בבעלי חיים גדולים ובני אדם 1,5,6,7,8. עם זאת, לשעתקו מאוד במודלים של בעלי חיים קטנים המאפשר חקירה שיטתית של השפעת הלחץ גזירה על התפתחות פלאק הם נדירים. לאחרונה, הציג נאם et al. 9 במודל עכבר שבה קשירת הענפים של עורק הצוואר יוצר אזור של זרם נמוך oscillatory. אף על פי מודל זה גורם תפקוד האנדותל היווצרות מהירה של טרשת עורקים בעכברים hyperlipidemic, לא ניתן לשלול כי התגובה הדלקתית הוא ציין, לפחות בחלקה, תוצאה of אנדותל ו / או נזק לכלי בשל קשירת.
כדי למנוע מגבלות כאלה, חפתים מתח גזירה שינוי פותחה על סמך דינמיקה של נוזלים מחושב, אשר חרוט לומן הפנימי בצורת נבחרה כדי ליצור אזורים מוגדרים של מתח נמוך, גזירה גבוהה oscillatory בתוך עורק התרדמה המשותף 10. על ידי יישום מודל זה אפוליפופרוטאין E (ApoE) נוקאאוט בעכברים שקיבלו כולסטרול גבוה המערבי דיאטה סוג, לפתח נגעים של כלי הדם במורד הזרם מן השרוול. הפנוטיפ שלהם היא בקורלציה עם הדינמיקה האזורית תזרים 11 כפי שאושרו על ידי הדמיה vivo תהודה מגנטית (MRI) 12: הלחץ גזירה נמוכה למינרית במעלה הזרם של השרוול גורם להיווצרות פלאק נרחב של פנוטיפ פגיע יותר, ואילו oscillatory מתח הזרם גזירה של השרוול גורם טרשת עורקים יציבה 11. באותם אזורים של מתח גזירה גבוהה וזרימה למינרית גבוה בתוך השרוול,בדרך כלל אין פלאק טרשת עורקים הם נצפו.
לסיכום, נוהל גזירה מתח שינוי השרוול היא גישה כירורגית אמין לייצר טרשת עורקים שונים phenotypically ב-ApoE לקוי בעכברים.
פרוטוקול
1. הכנת מתקן מתח גזירה (השרוול)
- מתקן מתח גזירה מורכב משני חצאים האורך של גליל עם לומן בצורת חרוט. פגזים המחצית עשויים polyetherketone תרמופלסטיים המיוצרים על ידי הליך הליהוק פלסטיק. גורמים משתתפים נשלחות בזמן עדיין מחובר הרץ. לפיכך, חצאים צריך להיות מנותקים לפני השימוש. הטיל מכיל קליפות חצי בגדלים שונים הנעים בין 150 מיקרומטר - 300 מיקרומטר (קוטר פנימי הנמוך ביותר בסוף במורד הזרם).
- הכנה השרוול צריכה להתבצע תחת מיקרוסקופ כירורגי.
- החזק את החצי שרוול פגז עם מלקחיים בוטה בעדינות לחתוך אותו מן השחקנים באמצעות אזמל חד. הליך זה יוביל לחצי מבשרי פגז אשר צריך להיות מעובד יותר.
- מניחים את הף מבשר על הצלחת אפילו לא חלקלק; לתקן את זה עם מלקחיים בוטה לחתוך אותו בדיוק לאורך החתך preformed כדי remove סוף סגור. זו תניב חצי שרוול פגז מוכן לשימוש.
- הפיקוח על חצאים מתחת למיקרוסקופ בעדינות להסיר כל קצוות חדים הנותרים. לומן הפנימי חרוטי חיונית גרימת איכויות שונות של לחץ בתוך גזירה, במעלה או במורד השרוול של המושתל. חריץ על פני השטח החיצוני של חצאים פועל בניצב לומן הפנימי משמש מנחה עבור חוט אשר בסופו של דבר המקלות חצאים יחד כדי ליצור את השרוול תפקודית.
- חנות חצאים השרוול, מסווגים לפי גודל, באתנול 70%.
2. להשתיל את השרוול סביב עורק הצוואר הימני
- עכברים ApoE נוקאאוט צריך להיות סביב 10 שבועות של גיל במשקל של לפחות 20 גרם. אם התפתחות פלאק יש לחקור תחת דיאטה כולסטרול גבוה, החל כגון דיאטה סוג המערבי 4 שבועות לפני ההשתלה השרוול מומלץ.
- הליך כירורגי כל צריךלהתבצע תחת לפחות חצי סטרילי תנאים: לבשי חלוק הניתוחים, מסכה, כובע וכפפות סטריליות. לחטא את המכשירים עבור 30 שניות מעקר מכשיר חרוז ומניחים אותם על גיליון אטום סטרילית. היזהרו! מכשירים צריך להתקרר לפני השימוש!
- מקמו את העכבר בתא הרדמה אינדוקציה מלא 3% isoflurane עד שהוא מורדם לחלוטין. בדיקת עומק של הרדמה עם תגובה לצבוט הבוהן. לחלופין, ניתן לבצע הרדמה עם זריקה (IP) intraperitoneal של קטמין (80 מ"ג / ק"ג) ו Xylazine (10 מ"ג / ק"ג) או הרדמה חלופי שאושר על ידי IACUC. עבור הזרקה ip, להחזיק את העכבר במצב פרקדן ולהזריק ההרדמה ברבע התחתון השמאלי של הבטן.
- הנח את העכבר על צלחת מחוממת כירורגית, במצב שכיבה. על מנת למנוע את עיני פועל יבש להרטיב אותם עם משחה העין (למשל Bepanthen קרם העיניים והאף). מורחים את הקדמי ואת הכפות האחוריות, קלטת אותם לצלחת. אם ביצוע הרדמה isoflurane, את זרימת הגז נרקוטיים (2% isoflurane) חייב להיות מסופק באמצעות מסכה מכרסם קטן.
- הסרת שיער בין הלסת התחתונה ואת עצם החזה על ידי סוכן או מקריח יישום (למשל Pilca מד) או באמצעות קנס מכונת גילוח חשמלית (למשל Wella Contura). גילוח חייב להתבצע בזהירות כדי למנוע עור מעצבן. אם באמצעות סוכן מקריח, לתת לו 1-2 דקות בשביל לחדור את השיער, לאחר מכן, לשפשף בעדינות עד שכל השיער סוכן מקריח מוסר.
- האם מוכן מוכן בעבר half השרוול פגזים בגדלים שונים (שניים בכל גודל) ו 2.5 ס"מ באורך פיסת תפר 6-0 משי מקשרות את הפגזים וחצי באתר של חסימת עורק התרדמה.
- לחטא את השדה הפעלה עם כמות ליברלית של בבטאדין. השתמש במספריים חדים קטן כדי לפתוח את העור ואת fascia הבסיסית של הצוואר על ידי חתך 4-5mm המדיאלי החל מהחלק העליון של עצם החזה (manubrium).
- הרחב את הפתיחה שלhift בלוטת הפרוטיד ימין הצידה להוסיף מפזר כירורגית. אז בבוטות לנתח לתוך עמוק, עזב רק של קנה הנשימה (מתצוגת מנתחים), שבו השריר sternomastoideus זכות חוצה את השריר omohyoid הנכון, עד שתוכלו לזהות את הראש הפועם המשותף הנכון.
- באמצעות מלקחיים או בזווית מעוגלת יפה מאוד (למשל דומון # 5 / 45), לנתח את עורק התרדמה המשותף הימני בעדינות על ידי הסרת רקמת החיבור שמסביב. הפרד את הראש מן העצב התועה - אובייקט לבן, סיבי פועל ישירות לאורך התרדמה - צעד זה הכרחי לחלוטין לחשוף את כלי השיט. היזהר לא לפגוע העצב התועה ולא סניף של וריד הצוואר השמאלי הפנימי, שהוא גם בקשר קרוב הראש.
- על מנת לבחור את גודל השרוול הימני, להשוות את הקוטר של הראש החשוף בקוטר הפנימי של השרוול חצאים: רוחבו הגדול ביותר של לומן האזיקים צריך לפגוש את הקוטר החיצוני של הראש. כעת, בזהירות את קצה מלקחיים תחת הראש, לפתוח את מלקחיים, חוט פיסת תפר 6-0 משי תחת הראש ואת צורת לולאה. בין לולאה לבין מקום התרדמה one השרוול פגז וחצי מתחת הראש. הצד של היצרות הגדול חייב להיות במורד הזרם.
- מניחים את מעטפת המחצית השנייה השרוול בתוך הלולאה על גבי הראש.
- להדק בעדינות את הלולאה תפר באמצעות מלקחיים תפירת ואת הצומת חוט. בכך גזירה משנה את התפקוד הלחץ נוצר. למדידה מדויקת של החפת זה הכרחי כי תפר פועל בדיוק בתוך החריץ preformed על פני השטח החיצוני של השרוול.
- הזז את בלוטת הפרוטיד זכות חזרה למיקום המקורי שלה, המקורב ולסגור את העור או באמצעות כמות קטנה של תפר 6-0 prolene או, לחילופין, ניתן להשתמש קליפים הפצע.
- הזרק מנה בודדת של Carprofen 5 מ"ג / ק"ג (למשל Rimadyl) מתחת לעור על מנת לספק טיפול מניעתי ואת מקום הכאבהעכבר בתא ההתחממות עד משחזרת. בדרך כלל זה לוקח 30-60 דקות כאשר בהרדמה קטמין / Xylazine. בעת שימוש isoflurane משאיפת הרדמה תקופת התאוששות קצרה יותר באופן משמעותי (10-20 דקות).
- מניסיוננו, חיות להחזיר פעילות unstressed נורמלי בתוך 24 השעות הראשונות לאחר ההשתלה השרוול עם התערבות מתבצע על ידי מנתח מנוסה. עם זאת, אם בעל החיים נראה במצוקה אפילו יום אחד לאחר הניתוח, לחזור על הטיפול משכך כאבים ולהתייעץ עם צוות וטרינרי.
3. Explanting השרוול ואת עורקי הראש
- לניתוח היסטולוגית עורקי הראש צריך להיות שנקטפו בסוף תקופת התצפית. לפני שמתחילים explantation, החיה צריך להיהרג בהתאם להנחיות IACUC.
- אם את החצי פגזים השרוול נועדו לשימוש חוזר, להסיר בזהירות את כל שברי רקמות חיבור תפר מאלמנטים פלסטיק, דיסsecting של עורקי הראש, לשטוף ולאחסן את הפגזים חצי פתרון אלכוהול 70%. ראוי לזכור כי השרוול מוטבע הידבקויות רקמת החיבור לאחר מספר שבועות של ההשתלה כי יש לנתח את השרוול בזהירות כדי לא לפגוע בקירות כלי שיט.
- לחלופין, השרוול יכול להיות explanted ומוטבעים יחד עם עורק הצוואר. חומר פלסטי של השרוול הוא עמיד פתרונות קיבעון ממיסים נורמלי משמש להטבעת פרפין. כמו כן, דגימות המוטבע ניתן לחתוך באמצעות microtome נורמלי מצויד להבים רגילים.
4. נציג תוצאות
השרוול צריך להיות ממוקם תמיד סביב אחד משני עורקי הראש המשותף של בעל חיים (איור 1A, 1B) - הצד הנגדי משמש כביקורת. על התמונה מציגה את שני פגזים חצי שרוול (איור 1B) צורה חרוטית של לומן הפנימי גלוי. זו צורה חרוטית חיונית establishing שלושת האזורים עם זרימת הדינמיקה ברורה. טיפוסי דפוסי מתח גזירה הנגרמת על ידי השחקנים מחושב ממדידות דופלר 11 ואת מהירויות זרימת המקביל מבוסס על שלב לעומת מהירות MR הדמיה 12 מקבלים באיור 2.
כאשר השרוול הוא מושתל עכברים בנוקאאוט ApoE תזונה סוג המערבי הזרימה משתנה הדינמיקה גזירה הנגרמת לעורר מתח בתצהיר פלאק טרשת עורקים (איור 3): Upstream של מתח חרוטי נמוך התכווצות למינרית גזירה מוביל להתפתחות מסיבית של פלאק טרשת עורקים של יותר פנוטיפ פגיע, המאופיינת ליבות השומנים קרוב לומן המרכזי מכוסה רק על ידי כובע סיביים דקים (איור 3A1). לומן הפנימי חרוטי של השרוול שמוביל לעלייה מהירות הזרימה. כמעט אין בתצהיר פלאק הוא ציין בתחום זה. במורד הזרם ישירות באתר של צוואר הבקבוק מיידית הרחבת התוצאות עורק באזור של מערבולות ו פלו oscillatoryw פרמטרים, מה שגורם להתפתחות פלאק המורחבת של פנוטיפ פחות יציבה יותר (כלומר, ליבות פחות שומנים אשר מקומי קרוב יותר לאמצעי התקשורת).
איור 1 צירוף מתח גזירה - הרכבה מיקום (א) ציור סכמטי של האזיק מושתל:.. השרוול ממוקם סביב עורק התרדמה המשותף הימני (RCCA) - הצד הנגדי (LCCA = שמאל העורק הראשי משותף) משמש בקרה . (ב) vivo MRI אנגיוגרפיה בעכבר: ב הקרנת העוצמה המקסימלית של שלושה ממדי הזמן של הטיסה MR אנגיוגרפיה התכווצות חרוטי המושרה על ידי השחקנים (חץ לבן) נראה (לפרטים ראו 12). (H = ראש, F = מטר, R = ימין, L = שמאל). בפינה הימנית העליונה להציג מקרוסקופית על לומן הפנימי ואת המשטח החיצוני של חצאים השרוול הוא נתון. כאשר התאספו, שני חצאים יוצרים גליל חרוטי, אשר משנה הזרימה הדינמיקה בתוך כלי השיט בצורה מוגדרת. כדי להבטיח את ההתאמה הנכונה, חריץ על פני השטח החיצוני של השרוול (חץ צהוב) משמש מנחה עבור תפר המקשר.
באיור 2. אזורים שונים של דינמיקה זרימת מתח גזירה. השרשה של השרוול הדינמיקה תזרים משנה ומתח גזירה לאחר מכן בעורק הראש מכווץ באופן מוגדר. באיור הסכמטי העליון המאפיינים את זרימת שונים מצוינים ואת הערכים משוער המקומית מתח גזירה מקבלים (מבוסס על מדידות דופלר 11). להלן, מהירויות זרימת המקביל חיה אחת נמדד על ידי בדיקת MRI במעלה הזרם של השרוול מושתל מוצגים תמונה-MRI T1-משוקלל חתך של הצוואר (שלב בניגוד הדמיה מהירות, לפרטים ראה 12).
> 
באיור 3. הלחץ שאר המושרה התפתחות פלאק בעכברים בנוקאאוט ApoE. בפינה השמאלית העליונה מראה את התצוגה מקרוסקופית על הצוואר נפתחה חשוף עורקי הראש של העכבר בנוקאאוט ApoE תחת דיאטה גבוה (סוג המערבי) שומן 8 שבועות לאחר ההשתלה של מתח גזירה משנה סביב עורק התרדמה המשותף הימני (RCCA). אזור לבן אטום של כלי השיט (*) במעלה הזרם של השרוול מתאים לאתר של בתצהיר נרחב פלאק טרשת עורקים. החץ הצהוב מציין את חוט המשלבת את שני חצאי השרוול. לעומת זאת, אין סימנים של בתצהיר פלאק העורק הכלילי השמאלי משותף (LCCA).
(א) - (ג) נציג HE מוכתם חתכי רוחב של עורק התרדמה המשותף הימני של העכבר בנוקאאוט ApoE תחת דיאטה סוג המערבי 8 שבועות לאחר ההשתלה של השרוול. האיור הסכמטי נותן המטוסים המקביל (קווים מקווקווים) wherדואר הסעיפים אותרו. (א) Upstream של טרשת עורקים השרוול שמוביל בתצהיר פלאק מסיבי. ליבות השומנים גדול (חצים אדומים), אשר בחלק ממוקמים בקרבת מרכזי לומן (פרט A1) לאפיין את אופי הפגיעה של השלטים האלה. (ב) מטוס של צוואר הבקבוק השרוול כמעט שום התפתחות פלאק ברור, בעוד הזרם ישירות של השרוול (ג) תזרים oscillatory מוביל מתונה התפתחות פלאק מסוג יציב יותר (כלומר פחות שומנים ליבות או לא). (C1, C2 = פגזים מחצית השרוול, P = הפלאק, כוכבית = כלי לומן)
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כדי למזער וריאציה ניסיוני מומלץ לעבוד עם בעלי חיים גיל כמעט זהה עם ההיסטוריה תזונה זהה. תחקיר שפורסם לאחרונה מוכיח כי מתקן מתח להחיל גזירה בעכברים wildtype יכול להיות מודל טוב חקירת תפקוד האנדותל תגובות דלקתיות מוקדם המושרה על ידי זרם שונה דינמיקת 13. עם זאת, חקירה של התפתחות טרשת עורקים פלאק hyperlipidemic מודלים עכבר מהונדס (למשל העכבר בנוקאאוט ApoE) נדרשים. התקדמות וההיקף של בתצהיר פלאק כל דגם העכבר תלויים בסוג של דיאטה בשימוש. באופן כללי, תוכן כולסטרול גבוה / שומן ש...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG), GZ פרויקט PI 771/1-1; SFB 656 "מולקולרית והדמיה לב וכלי דם", מינסטר, גרמניה (פרויקטים C6, Z2, B3, ו PM3); האיחוד האירופי נואי "אבחון הדמיה מולקולרית, דימי "(WP 11.1 ו -11.2). המחקר מומן גם על ידי קרן הלב הבריטית, בריטניה בחלקו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם | חברה | תגובות | |
| הלחץ משנה גזירה (polyetherketone) | Promolding BV http://promolding.nl | מטיל נשלחות בזמן עדיין מחובר הרץ. לפיכך, אחד האלמנטים חייבים להיות מנותקים לפני השימוש. |
מקורות
- Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Lab. Invest. 85, 9-23 (2005).
- Ali, F., Zakkar, M., Karu, K., Lidington, E. A., Hamdulay, S. S., Boyle, J. J., Zloh, M., Bauer, A., Haskard, D. O., Evans, P. C., Mason, J. C. Induction of the cytoprotective enzyme heme oxygenase-1 by statins is enhanced in vascular endothelium exposed to laminar shear stress and impaired by disturbed flow. J. Biol. Chem. 284, 18882-18892 (2009).
- Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 293, C1824-C1833 (2007).
- Zheng, J., Abendschein, D. R., Okamoto, R. J., Yang, D., McCommis, K. S., Misselwitz, B., Gropler, R. J., Tang, D. MRI-based biomechanical imaging: initial study on early plaque progression and vessel remodeling. Magn. Reson. Imaging. 27, 1309-1318 (2009).
- Stone, P. H., Coskun, A. U., Kinlay, S., Clark, M. E., Sonka, M., Wahle, A., Ilegbusi, O. J., Yeghiazarians, Y., Popma, J. J., Orav, J., Kuntz, R. E., Feldman, C. L. Effect of endothelial shear stress on the progression of coronary artery disease, vascular remodeling, and in-stent restenosis in humans: in vivo 6-month follow-up study. Circulation. 108, 438-444 (2003).
- Pedersen, E. M., Oyre, S., Agerbaek, M., Kristensen, I. B., Ringgaard, S., Boesiger, P., Paaske, W. P. Distribution of early atherosclerotic lesions in the human abdominal aorta correlates with wall shear stresses measured in vivo. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 18, 328-333 (1999).
- Buchanan, J. R., Kleinstreuer, C., Truskey, G. A., Lei, M. Relation between non-uniform hemodynamics and sites of altered permeability and lesion growth at the rabbit aorto-celiac junction. Atherosclerosis. 143, 27-40 (1999).
- Nam, D., Ni, C. W., Rezvan, A., Suo, J., Budzyn, K., Llanos, A., Harrison, D., Giddens, D., Jo, H. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, 1535-1543 (2009).
- Cheng, C., van Haperen, R., de Waard, M., van Damme, L. C., Tempel, D., Hanemaaijer, L., van Cappellen, G. W., Bos, J., Slager, C. J., Duncker, D. J., van der Steen, A. F., de Crom, R., Krams, R. Shear stress affects the intracellular distribution of eNOS: direct demonstration by a novel in vivo technique. Blood. 106, 3691-3698 (2005).
- Cheng, C., Tempel, D., van Haperen, R., van der Baan, A., Grosveld, F., Daemen, M. J., Krams, R., de Crom, R. Atherosclerotic lesion size and vulnerability are determined by patterns of fluid shear stress. Circulation. 113, 2744-2753 (2006).
- van Bochove, G. S., Straathof, R., Krams, R., Nicolay, K., Strijkers, G. J. MRI-determined carotid artery flow velocities and wall shear stress in a mouse model of vulnerable and stable atherosclerotic plaque. MAGMA. 23, 77-84 (2010).
- Cuhlmann, S., Van der Heiden, K., Saliba, D., Tremoleda, J. L., Khalil, M., Zakkar, M., Chaudhury, H., Luong, L. A., Mason, J. C., Udalova, I., Gsell, W., Jones, H., Haskard, D. O., Krams, R., Evans, P. C. Disturbed Blood Flow Induces RelA Expression via c-Jun N-Terminal Kinase 1: A Novel Mode of NF-{kappa}B Regulation That Promotes Arterial Inflammation. Circ. Res. 108, Forthcoming (2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
