מאמר שיטה

פרוטאז וחומצת קטליזאטור זרימות עבודת תיוג המעסיק

11.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/3891

⸱

20 בפברואר 2013

 , 
1Boston Biomedical Research Institute

במאמר זה

סיכום

זרימות עבודת תיוג איזוטופים יציבות המעסיקות 18 O מועשר במים (ליאו זרימות עבודה) הם כלים מגוונים ללימודי proteomics כמותיים ואיכותיים. בתהליכי עבודה בסיוע פרוטאז (Paleo), 18 O-אטומים הם הציגו על ידי מחשוף פרוטאוליטי ותגובות חליפי חמצן carboxyl מתווך על ידי פרוטאזות. בחומצת קטליזאטור זרימת העבודה (Aleo), 18 O-אטומים הם הציגו על ידי חילופי החמצן carboxyl ב-pH הנמוך.

תקציר

איזוטופים יציבים הם כלים חיוניים בספקטרומטריית מסה ביולוגית. מבחינה הסטורית, 18 איזוטופים יציבים O-נעשו שימוש הנרחב כדי ללמוד את המנגנונים קטליטי של אנזימים פרוטאוליטים 1-3. עם כניסתו של פרוטאומיקה המונית ספקטרומטריית מבוססת, התאגדות enzymatically-הקטליזאטור של 18 O-אטומים ממים יציבים מועשרים isotopically הפכה שיטה פופולרית כמותית להשוות את רמת ביטוי חלבון (נבדק על ידי Fenselau ויאו 4, מיאגי וRao 5 ו יה et al. 6). 18 O-התיוג מהווה חלופה פשוטה וזולה לחומרים כימיים (למשל iTRAQ, ICAT) ו( למשל SILAC) טכניקות תיוג מטבוליות 7. בהתאם לפרוטאז המנוצל, 18 O-תיוג יכול לגרום להתאגדות של עד שני 18 O-אטומים בקבוצת carboxyl C-המסוף של מוצר המחשוף 3 8. בPaleo (עמ rotease-דואר abeling l ssisted mploying 18 הו מים מועשרים) הסתגלות של O-תיוג האנזימטית 18, שנוצלו 50% 18 הו מים מועשרים להניב חתימות איזוטופ ייחודיות. בשילוב עם רזולוציה גבוהה מטריצה ​​בסיוע יינון desorption ליזר זמן של טיסת טנדם ספקטרומטריית מסה (MALDI-TOF/TOF MS / MS), את מעטפות איזוטופ אופייניות יכול לשמש כדי לזהות מוצרי ביקוע עם רמה גבוהה של פירוט. קודם לכן יש לנו להשתמש Paleo-המתודולוגיה כדי לזהות ולאפיין פרוטאזות אנדוגניים 9 ולנטר תגובות proteolytic 10-11. מאז Paleo מקודד את עצם מהותה של תגובת ביקוע פרוטאוליטי, ההתקנה הניסיונית היא enri פשוט וביוכימייםצעדי chment של מוצרי ביקוע ניתן לעקוף. Paleo-השיטה ניתן להרחיב בקלות ל( i) ניסויים כמובן הזמן שמפקחים על הדינמיקה של תגובות ביקוע proteolytic ו (ב) ניתוח של proteolysis בדגימות ביולוגיות מורכבות המייצגות את התנאים פיסיולוגיים. ניסויי Paleo-TimeCourse לעזור זיהוי צעדים מגבילי קצב עיבוד ביניים תגובה בתגובות מסלול proteolytic מורכבות. יתר על כן, Paleo-התגובה מאפשרת לנו לזהות אנזימים פרוטאוליטים כגון טריפסין פרוטאז סרין, כי הוא מסוגל ליחבוש את מוצרי הביקוע ולזרז את ההתאגדות של 18 2 O-Atom. "תיוג כפול" אנזימים כאלה יכולים לשמש לpostdigestion 18 O-תיוג, שבפפטידים מסומנים באופן בלעדי על ידי תגובת חילופי חמצן carboxyl. האסטרטגיה השלישית שלנו משתרעת תיוג מעסיק 18 הו מים מועשרים מעבר אנזימים ומשתמשת בתנאי pH חומצי להציג סימן איזוטופ יציב O-18atures לפפטידים.

פרוטוקול

את זרימות עבודת ליאו הוצגו מאפשרות תיוג היציב איזוטופ של חלבון מקוצר ופפטידים סינטטיים. ניסויים אלו כמובן זמן (איור 1) חלים על מחקרי proteomics השוואתיים וכמותית, כמו גם מחקר פרוטאז. כל עבודה מורכבת משני שלבים ניסיוניים (איור 2):) זמן הדגימה תיפתר של התגובה המתאימה 18 O-איזוטופ היציב בקידוד (מחשוף פרוטאז קטליזאטור פפטיד; תגובת חילופי קטליזאטור-פרוטאז carboxyl חמצן; חילופי חמצן carboxyl חומצת קטליזאטור תגובה) ו-B) ניתוח על ידי ספקטרומטריית מסה וייצוג גרפי של 18 קינטיקה O-התאגדות.

ניסויי TimeCourse א

I. Paleo-TimeCourse: תיוג פרוטאז-קטליזאטור של שסעי proteolytic

  1. (אופציונלי) אג"ח דיסולפיד של חלבונים (10 מיקרומטר) ופפטידים (250 מיקרומטר) מופחתים עם DTT (2.5 מ"מ ריכוז סופי)ב25 מ"מ NH 4 3 HCO (הן טריות) על ידי דגירה למשך 30 דקות ב 50 ° C.
  2. (אופציונלי) cysteines חינם הם alkylated עם iodoacetamide (ריכוז סופי 10 מ"מ) 25 מ"מ NH 3 4 HCO ידי דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
  3. בהתאם לפרוטאז של עניין, פתרוני חלבון / פפטיד צריכים להיות ניקה-מעלה כדי להסיר חיץ שייר וסוכן אלקילציה. השתמש PepClean C-18 עמודות ספין (Thermo) לניקוי ופפטיד Vivaspin ריכוז צנטריפוגלי (סארטוריוס) להחליף למאגרי דגימות חלבון.
  4. Redissolve / פפטידים להחליף / חלבונים בחיץ תגובת פרוטאז μl 20 (ECE-1: 50 מ"מ MES-KOH, 5.5 pH; טריפסין: 25 מ"מ NH 4 3 HCO, pH 8.0) המכיל 1:1 (v / v) הסופי H 2 18 O (95%, סיגמא Isotec).
  5. לסגת מדגם נקודת זמן אפס לפני התוספת של פרוטאז: המיקס 0.5 μl של תערובת התגובה ו0.5 אלפא μl cyano-4-hydroxycinnamicחומצת מטריצה ​​(10 מ"ג / מ"ל ​​באצטוניטריל 50%, 0.1% TFA). מדגם כתם על צלחת Opti-TOF 384 MALDI יעד (א.ב. SCIEX) ולהשאיר את טיפי ממס בטמפרטורת חדר עד יבש (כ 5 דקות).
  6. פיצול פתרון התגובה לשני aliquots. Aliquot יהיה הראשון מודגרות עם פרוטאז עניין (ECE-1: 75 ננומטר; טריפסין: 0.04 nM) בטמפרטורת חדר או הטמפרטורה המומלצת לאנזים מסוים. Aliquot השני יהיה דגר בלי פרוטאז וישמש כמדגם שליטה. Aliquot הראשון מייצג מדגם סטנדרטי לפרוטאז קטליזאטור 18 O-תיוג והוא יכול לשמש לפפטיד וזיהוי חלבונים, זיהוי של פעילות חלבונים וניטור של תגובות ביקוע proteolytic. Aliquot השני משמש להראות ש18 O-התאגדות הוא מושרה על ידי פרוטאז, ולכן, לא תיוג ולא המחשוף צפוי למדגם זה.
  7. עקוב תגובה על ידי הסרת aliquots תגובה והבחין בם כdescribed תחת שלב 5 במרווחי זמן כנראה לנכון. את תנאי התגובה שתוארו לעיל משמשים לניטור תגובת פרוטאוליטי לתקופה של עד ארבעה ימים (24 ​​נקודות בערך). התחל דגימה כל 5 דקות עד 30 דקות, ולאחר מכן לזהות את כל 30 דקות עד 2 שעות, ולאחר מכן כל שעה עד שעות 8 וכל 8 שעות עד 4 ימים. מוצרי ביקוע אמורים להופיע תוך 12 השעות הראשונות והמצע צריך להיות לגמרי הידרוליזה לאחר 24 שעות. זמני דגירת תגובה מורחבים מאפשרים להגדיר תוצרי תגובה יציבים שאינם דיסקרטיים מתגובת ביניים, אשר מעובדים עוד יותר. בהתאם לשאלת מחקר וזוגות הניתנים אנזימי מצע, זמנים ייכונו וטמפרטורת דגירה יש להיות מווסת על מנת להבטיח דגימת תגובה אופטימלית.
  8. לאחר שנקודת זמן התגובה הסופית הבחינה או במרווחים בין ייכונו מורחבים, צלחת יעד MALDI מוגשת לניתוח MALDI-TOF/TOF MS / MS כמפורט להלן (סעיף ב ').

השני. Paleo-TimeCourse: Postdigתיוג estion של termini proteolytic

  1. (אופציונלי) אג"ח דיסולפיד של חלבונים (10 מיקרומטר) ופפטידים (250 מיקרומטר) מופחתים עם DTT (2.5 מ"מ ריכוז סופי) ב25 מ"מ NH 4 3 HCO (הן מוכנות טריות) על ידי דגירה למשך 30 דקות ב 50 ° C.
  2. (אופציונלי) cysteines חינם הם alkylated עם iodoacetamide (ריכוז סופי 10 מ"מ) 25 מ"מ NH 3 4 HCO ידי דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
  3. בהתאם לפרוטאז של עניין, פתרוני חלבון / פפטיד צריכים להיות ניקה-מעלה כדי להסיר חיץ שייר וסוכן אלקילציה. השתמש PepClean עמודות C-18 ספין לניקוי הפפטיד וVivaspin ריכוז צנטריפוגלי לחילופי חיץ חלבון.
  4. Redissolve / להחליף את ניקה-up מוצרי פפטיד / חלבונים בחיץ תגובת פרוטאז μl 20 (לדוגמא טריפסין: 25 מ"מ NH 4 3 HCO, 8.0 pH) ולעכל עם פרוטאז עניין להשלמה (למשל טריפסין: 0.04 nM 3;7 מעלות צלזיוס; 12 שעות).
  5. מוצרי ביקוע ניקוי עם PepClean עמודות C-18 ספין. צעד זה יהיה לבטל פעילות הפרוטאז שיורית.
  6. Redissolve / להחליף את ניקה-up מוצרי פפטיד בחיץ תגובת פרוטאז μl 20 (טריפסין: 25 המ"מ NH 4 3 HCO, 8.0 pH) המכיל 1:1 (v / v) הסופי H 2 18 O.
  7. לסגת מדגם נקודת זמן אפס לפני התוספת של אנזים: 0.5 μl המיקס של תערובת התגובה ומטריצת 0.5 μl אלפא cyano-4-hydroxycinnamic חומצה (10 מ"ג / מ"ל ​​באצטוניטריל 50%, 0.1% TFA). ספוט מדגם על צלחת יעד MALDI ולהשאיר את טיפי ממס בטמפרטורת חדר עד יבש (כ 5 דקות).
  8. פיצול פתרון התגובה לשני aliquots. Aliquot יהיה הראשון מודגרות עם פרוטאז של עניין (למשל טריפסין: 0.04 nM) בטמפרטורת חדר או הטמפרטורה המומלצת לאנזים מסוים. Aliquot השני יהיה דגר בלי פרוטאז וישמש כבקרה. 1aliquot מייצג מדגם סטנדרטי לפרוטאז קטליזאטור תיוג 18 O-postdigestion ויכול לשמש לפפטיד וכימות חלבון. Aliquot השני משמש להראות ש18 O-התאגדות מזורזת על ידי פרוטאז ולפיכך לא תיוג צפוי למדגם זה.
  9. עקוב תגובה על ידי הסרת aliquots תגובה והבחין בם כאמור בשלב 7.) במרווחי זמן כנראה לנכון. לדוגמה, אנו הבחנו בתחילה כל 5 דקות עד 30 דקות וכל 15 דקות לאחר שלפקח תגובת חילופי חמצן carboxyl מזורזת על ידי טריפסין.
  10. לאחר שנקודת זמן התגובה הסופית הבחינה או במרווחים בין ייכונו מורחבים צלחת יעד MALDI מוגשת לניתוח MALDI-TOF/TOF MS / MS כמפורט להלן (סעיף ב ').

ג. Aleo-TimeCourse: תיוג חומצת קטליזאטור של קבוצות carboxyl

  1. דגירת פפטידים בודדים (50 ננומטר) עם 1:1 (v / v) 18 הו מים מועשרים בtהוא נוכחות או עדר (שליטה) של 0.1% (v / v) חומצת trifluoroacetic סופית (30 μl נפח כולל).
  2. לדוגמה את תוצרי התגובה היומית ל48 ימים על ידי שיתוף איתור aliquot μl 0.5 של התערובת עם 0.5μl של מטריצת cyano-4-hydroxycinnamic חומצת אלפא (10 מ"ג / מ"ל ​​באצטוניטריל 50%, 0.1% TFA) ישירות על יעד MALDI צלחת.
  3. בין מרווחים ייכונו ואחרי שהבחין בנקודת זמן התגובה הסופית להגיש צלחת יעד MALDI לניתוח MALDI-TOF/TOF MS / MS כמתואר להלן בסעיף ב '

ב MALDI-TOF/TOF רכישת MS / MS נתונים וניתוח

  1. ספקטרום המוני נרכשים על MALDI TOF / TOF Analyzer 4800 (א.ב. SCIEX).
  2. לפני הניתוח, המכשיר מכויל בתערובת של סטנדרטי פפטיד (ערכת תקנים המונית לכיול של AB SCIEX מכשירי TOF / TOF) עם סובלנות מרבית המוני מדידת שגיאה של ± 50 עמודים לדקה ומספר מינימאלי של שישה שיאים להתאים.
  3. MS הספקטרום (טווח המוני400 - 4000 מ '/ z) נרכשים בשלושה עותקים באמצעות מצב יון חיובי עם עצמה מתכווננת ליזר (3400 - 3800; גודל צעד 50) עם טווח מקובל בסיס שיא עוצמת 2000 - 45000. יריות בודדות נרכשות ל- ספקטרום משנה, עם 400 יריות / ספקטרום כלל, לעצור תנאים ייכנסו לתוקף לאחר 800 תת ספקטרומים נרכשים (תעבור או ייכשל) או 400 קריטריונים לקבלה עוקף תת תחזיות. במקרה של דגימות נמוכות בשפע או בנוכחות רקע ביולוגי מורכב לקצה התחתון של טווח גילוי הטרשת הנפוצה יש להעלות עד 800 מ '/ z. בנוסף, ייתכן שיהיה צורך להסיר מלח ותרכובות אחרות המפריעות בצעד ניקוי מדגם כפי שתואר קודם לכן או על ידי הפרדת LC.
  4. קבצי נתוני MS (קבצים. t2d) מיוצאים מתוכנת 4000 סדרת סייר נתוני רכישה ומיובאת למערכת שלנו בבית מעבדת המידע, שעושה שימוש בתוכנה זקקה קמע (מטריקס מדע) לעיבוד וזיהוי ספקטרלי שיא. מעטפות איזוטופיםהם deconvoluted ויחסים 18 O-התאגדות שנקבעו באופן אוטומטי באמצעות אלגוריתם דומה לזה שתואר על ידי מייסון ואח' 12. והותאם על ידי הקבוצה שלנו 9. לחלופין, כלי תוכנה כגון ZoomQuant 13 ו 14 צפע, כמו גם חבילות תוכנה מסחריות, כBioWorks Xpress (תרם הפישר סיינטיפיק) וקמע זקק quantitation ארגז כלים (מטריקס מדע) יכול deconvolute 18 נתונים מסוג O 15,16. יחסי O-18 התאגדות מבוטאים את התרומה היחסית של מיני איזוטופ פפטיד בודדים (כלומר, פפטידים המכילים 16 O, 1 O או 18 O 18 2) למעטפה האיזוטופי כולו.
  5. עבור כל ניסוי TimeCourse, המונים המולקולריים ([M + H] +) לכל מיני פפטיד שהתגלו נשלפים מהקבצים המשויכים MS הנתונים והערכים זרקו לפח ברוחב המוני ppm 100.
  6. t לפחות שלושה [M + H] + מוגדרים יידרש כדי לאכלס סל. במקרה של מצעים ידועים, רשימת הסל המסונן בהשוואה לרשימה של מוצרי ביקוע proteolytic חזתה מרצף פפטיד המצע באמצעות כלי ExPASy FindPept 17 (http://au.expasy.org/tools/findpept.html) ו 200 סובלנות קבלת שגיאה המונית עמודים לדקה.
  7. MS / MS הספקטרום נרכש לכל הערכים ההמוניים של מוצרי ביקוע החזויים על ידי כלי FindPept וערכים לסל שיש להם 18 O-Incorporations קשורים בם. נתוני MS / MS נרכשים על מנתח 4800 MALDI TOF / TOF במצב יון 1kV רפלקטור החיובי, בעצמה קבועה ליזר של 4200 ו-CID גז במצב כבוי. 50 יריות נרכשות בדפוס אקראי לכל ספקטרום משנה עד לסך של 40-ספקטרום משנה לנקודה (מניב כולל של 2000 / יריות ספוט).
  8. קבצי נתוני MS (קבצים. t2d) MS / מיוצאים מהסדרה 4000 Exploתוכנת rer נתוני רכישה ומיובא לתוך מערכת מידע המעבדה בבית שלנו, פסגות מזוהות ורשימות MS / MS שיא קשורות עם נתוני MS זרקו לפח המתאימים.
  9. לזיהוי הפפטיד, רשימות MS / MS שיא הם חפשו מול מסד נתוני SwissProt באמצעות מנוע חיפוש קמע עם פרמטרי החיפוש הבאים: אין הספציפיות אנזים, יון 150 עמודים לדקה מבשרת ו0.2 טולרנסים המוניים יון בר אבא.
  10. הזדהויות פפטיד בנוסף ניתן לאמת באמצעות נתוני Explorer התוכנה (א.ב. SCIEX) יאשר את 18 דפוסי O-התאגדות האופייניים ברחבי יוני בר y-סדרה כפי שתואר על ידי שבצ'נקו et al. 18.

הכנת ג זמן ספקטרלית ו18 מגרשים O-התאגדות

חלקות הזמן Spectral: קבצי נתוני MS (. קבצי t2d) לכל נקודת זמן תגובה מיוצאות מתוכנת סייר הנתונים כASCII-קבצים באמצעותמאקרו ויובא לניתוח נתונים ותוכנה גרפית (למשל מקור על ידי OriginLab) ומוצג כחלקות מפל (איור 3).

18 מגרשים O-התאגדות: לכל אחד ממוצרי ביקוע פפטיד זרק לפח, את התרומה היחסית של מיני איזוטופ פפטיד בודדים (16 O, 18 1 O או 18 O 2) מופקת על פני כל נקודתי זמן התגובה וזממה נגד זמן (איור 4).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אנחנו השתמשנו בעבודת Paleo-TimeCourse דינמי לפקח על ההתאגדות של 18 איזוטופים O-יציבים למוצרי ביקוע פפטיד שנוצרו על ידי אנזימי מפרקי חלבונים. הגישה שהוצגה היא כלי תכליתי יחסית ללמוד מסלולי עיבוד proteolytic למצע שונה ושילובי פרוטאז. באמצעות דגימת תגובות proteolytic שוב ושוב במהלך התגובה, ניסוי Paleo-TimeCourse מספק תצלומי הזמן נפתרו, של מצע ושכיחותם ופרטים על מוצרי עיבוד. שיתוף איתור דוגמאות עם פתרון מטריצת חומצי על צלחת היעד עוצר את הריאקציה אנזימטית והתגבשות מטריצה ​​נ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

על ידי שילוב של תיוג איזוטופ יציב וספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה באופן הזמן נפתר, שיטת Paleo-TimeCourse מאפשרת לניתוח דינמי של הדור של מוצרי פפטיד. הבדיקה יכולה לשמש ליצירת פפטידים שכותרת isotopically יציבים ללימודי proteomics כמותיים ואיכותיים ולהעריך את הקינטיקה של פפטידים שproteotypic נוצרים. יתר על כן, Paleo-TimeCourse נועד להעריך מסלולי proteolytic תחת vivo הספציפי, פיסיולוגי הרלוונטי תנאים לשעבר. חלבונים אנדוגניים, פפטידים ופרוטאזות כמו גם פפטידים סינטט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NIDCR גרנט 1R01DE019796.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם חומר חברה מספר קטלוגים
PepClean עמודות C-18 ספין Thermo 89870
צלחת יעד Opti-TOF 384 MALDI א.ב. SCIEX 1016629
4800 MALDI TOF / TOF א.ב. SCIEX

טבלת 1. חומרים

שם מגיב חברה מספר קטלוגים
חומצת אלפא-4-hydroxycinnamic cyano סיגמה אולדריץ 70990-1G-F
שור אלבומין (BSA) סיגמה אולדריץ A3294-10G
Dithiothreitol (DTT) Acros 16568-0050
Iodoacetamide (IAM) סיגמה אולדריץ 1149-5G
אנדותלין converting enzyme-1 (ECE-1) מו"פ מערכות 1784-ZN
טריפסין זהב Promega V5280
מי O-18, 97% אטום 18 O סיגמה אולדריץ 329878-1G
Trifluoroacetic חומצה (TFA) Thermo 28904
ערכת תקנים המונית לכיול של AB SCIEX מכשירי TOF / TOF א.ב. SCIEX 4333604

טבלת 2. ריאגנטים

מקורות

  1. Bender, M., Kemp, K. Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters. Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).
  2. Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).
  3. Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange. European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).
  4. Fenselau, C., Yao, X. 18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report. Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).
  5. Miyagi, M., Rao, K. C. S. Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics. Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).
  6. Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. 18O stable isotope labeling in MS-based proteomics. Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).
  7. Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).
  8. Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates. Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).
  9. Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples. Proteomics. 8, 435-445 (2008).
  10. Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling. The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).
  11. Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3. PLoS ONE. 4, e5156(2009).
  12. Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).
  13. Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant". J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).
  14. Qian, W. -J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics. Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).
  15. Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling. Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).
  16. Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).
  17. Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).
  18. Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).
  19. Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides. Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).
  20. Bender, M., Stone, R., Dewey, R. Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water. Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).
  21. Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

18PALeOMALDI TOF MS

מאמרים קשורים