Method Article

עיבוד של רקמת גידול במוח העיקרית למבחנים בתאי גזע וזרימת מיון

DOI:

10.3791/4111

⸱

September 25th, 2012

 ,  ,  ,  , 
1Stem Cell and Cancer Research Institute, McMaster University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי של תאי מוח סרטני ייזום (BTICs), תאים הנדירים בטווח של תכונות הטרוגניות גידול בעלי תאי גזע, מספק תובנה חדשות על היווצרות גידול במוח האנושית. יש לנו מעודנים תנאי התרבות ספציפיים להעשרה לBTICs, ואנו משתמשים באופן שגרתי cytometry זרימה להעשיר אוכלוסיות אלה עוד יותר. מבחנים עצמי חידוש וניתוח תמליל של התא הבודד RT-PCR לאחר מכן ניתן לבצע בתאים מבודדים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גידולים במוח בדרך כלל מורכבים של תאים מורפולוגית מגוונים שמבטאים מגוון של סמני שושלת עצביות. רק חלק קטן יחסית של תאים בגידול עם מאפיינים של תאי גזע, תאים המכונים מוח סרטני ייזום (BTICs), להחזיק יכולת להבחין לאורך שושלות מרובות, עצמי לחדש, ליזום וגידולים בגוף חי. אנחנו מוחלים תנאי התרבות שמשו במקור לתאים נורמלים עצביים גזע (NSCs) למגוון רחב של גידולים במוח אדם ומצאו ששיטת התרבות זו בוחרת במיוחד עבור אוכלוסיות גזע דמויים. מדיום סרום ללא (המל"ל) מאפשר לתחזוקה של מדינת תאי גזע מובחנת, והתוספת של bFGF וEGF מאפשרת ריבוי, חידוש עצמי רבת ​​עצמה, וtumorspheres להרחבה.

כדי להמשיך לאפיין אוכלוסיית BTIC של כל גידול, אנו מעריכים סמנים בתא שטח על ידי cytometry זרימה. אנו עשויים גם למיין אוכלוסיות של עניין לcharacteriz ספציפי יותרation. מבחנים עצמי חידוש מבוצעים על BTICs הבודד ממוינת ל96 גם צלחות; ° C היווצרות tumorspheres לאחר דגירה ב 37 מעידה על קיומו של גזע או תאי אב. מספרים סלולריים מרובים של אוכלוסייה מסוימת גם ניתן למיין בבארות שונות להגבלת ניתוח דילול, כדי לנתח את יכולת התחדשות עצמית. אנחנו יכולים גם ללמוד ביטוי גני ההפרש בתוך אוכלוסיית תאים מסוימות על ידי שימוש בתא בודד RT-PCR.

הפרוטוקולים הבאים מתארים את התהליכים שלנו לניתוק וculturing של דגימות אנושיות ראשוניות להעשרה לאוכלוסיות BTIC, כמו גם הניתוק של tumorspheres. כמו כן, נכללו פרוטוקולים להכתמה לניתוח תזרים cytometry או מיון, מבחני התחדשות עצמית, ותא בודד RT-PCR.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גידולים במוח הם בין סוגי הסרטן האגרסיביים והטרוגנית ביותר הידועים בבני אדם. למרות הגילוי והאבחון המוקדם שלהם כבר בנחייתם של הטכנולוגיה המודרנית נוירו הדמיה, אנחנו עדיין חסרים טיפולים מרפאים עבור גידולים במוח רבים, במיוחד עבור אלה מפוזרים, חודרניים או אלה נמצאים עמוקים במוח.

גידולים במוח מייצגים את הגורם המוביל לתמותה מהסרטן בילדים, בשל האופי האגרסיבי מאוד ולעתים בלתי ניתן לריפוי שלהם. גליובלסטומה (GBM), גידול במוח הראשוני הנפוץ ביותר אצל מבוגרים, היא אחד מסוגי הסרטן האגרסיבי ביותר, האדם חרד לסיכויי ההחלמה אחידה הקטלניים 1. גידול זה ממאיר ביותר astro....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבות של רקמות סרטן המוח

  1. הוסף Liberase 200 μl מופשר (רוש מדע יישומים) עד 15 מ"ל של CSF המלאכותי (aCSF-ראה טבלה 1) ומקום ל37 ° C אמבט מים. Liberase TM הוא תערובת של אנזימי מפרקי חלבונים המשמשים ללנתק דגימות רקמות עיקריות, כמו גם tumorspheres תרבית. שלא כמו טריפסין-EDTA, שיטת Liberase משמרת CD133 אנטיגן פני השטח. לדגימת רקמות של כ -0.5 סנטימטר 3, אנו משתמשים 200 μl של Liberase. אם הרקמה היא קטנה יותר, אנו משתמשים 100 ul.
  2. תביא פתרון אמוניום כלוריד (טכנולוגיות תא....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השערת סרטן תאי גזע 10, המבוססת על עבודה בשנת 21 לוקמיה, סרטן השד והסרטן 11 סרטן המוח 4,5, מצביעה על כך שרק חלק קטן יחסית של תאים בגידול, תאי גזע סרטני המכונים, יש יכולת הנרחבת להתרבות ועצמי חידוש. רוב התאים הסרטניים מאבדים את היכולת להתרבות ולחדש את עצמו כפי שהם להתמיין לתאים שהופכים לחתימה הפנוטיפי של הגידול. מציאת התאים המרכזיים באוכלוסיית הגידול במוח שהם מסוגלים לשמור על הגידול תיתן תובנה לגבי המנגנון של tumorigenesis המוח ויאפשר לנו .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי אונטריו המכון לחקר הסרטן (OICR), הטריה פוקס הקרן והאגודה האמריקנית לניתוחים נוירולוגיים.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
שם המגיב חברה מספר קטלוגים
01:01 DMEM: F12 Invitrogen 11320-082
תוסף N2 Invitrogen 17502-048
HEPES 1M Wisent 330-050-EL
גלוקוז Invitrogen 15023-021
N-acetylcysteine סיגמה אולדריץ A9165-25 גרם
הישרדות עצבית גורם -1 (NSF-1) Lonza Clonetics CC-4323
גורם גדילה באפידרמיס (EGF) סיגמה אולדריץ E9644
גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) Invitrogen PHG0261
גורם מעכב לוקמיה (LIF) Millipore LIF1010
אנטיביוטיקה / פטרתי Wisent 450-115-EL
Liberase TM רוש 05 401 119 001
פתרון אמוניום כלוריד טכנולוגיות תאי גזע 07850

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ohgaki, H., Kleihues, P. Epidemiology and etiology of gliomas. Acta Neuropathol. 109, 93(2005).
  2. Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma. 10, 319(2010).
  3. Wechsler-Reya, R., Scott, M. P.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Brain Tumor TissueStem Cell AssaysFlow SortingBrain Tumor Initiating CellsTumorsphere FormationSingle Cell RT PCRFlow Cytometry AnalysisLimiting Dilution AnalysisSerum Free MediumCell Surface Markers

Related Articles