הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיטה מעשית ורומן לחלץ הדנ"א הגנומי מערכות דם אוסף לשימור חלבון פלזמה

42.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/4241

⸱

18 במאי 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine and Children's Health Care of Atlanta, 2Division of Rheumatology, Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine and Children's Health Care of Atlanta

במאמר זה

סיכום

אנחנו מתארים שיטה חדשה של בידוד הדנ"א הגנומי מכל הדם שנאסף לפלזמה / סרולוגיה. לאחר איסוף פלזמה, הדם הדחוס בדרך כלל מושלך. השיטה החדשה שלנו מהווה שיפור משמעותי על פני שיטות קיימות והופכת את ה-DNA ופלזמה זמינה מאוסף אחד, מבלי לבקש דם נוסף.

תקציר

ניתן לעשות בדיקות מעבדה במנות הסלולריות או נוזל של הדם. השימוש בצינורות איסוף דם שונים קובע את החלק של הדם שיכול להיות מנותח (כולו דם, פלזמה או סרום). מעבדות העוסקות בחקר הבסיס הגנטי של הפרעות אדם מסתמכות על הדם שנאסף בכל anticoagulated vacutainer המכיל EDTA כמקור של ה-DNA לצורך הניתוח גנטי / הגנומי. כי רוב המעבדות הקליניות לבצע בדיקה ביוכימית, סרולוגית ויראלית כצעד ראשון בחקירת תוצאת פנוטיפי, דם anticoagulated נאסף גם בצינור המכיל הפרין (צינור פלזמה). לכן, כאשר ה-DNA והפלזמה נדרשים לניתוחים בו זמנית ומקבילים של נתונים והן הגנומי proteomic, נהוג לאסוף את הדם בשני צינורות EDTA והפרין. אם דם יכול להיות שנאסף בצינור יחיד וישמש כמקור לפלזמה וגם ה-DNA, שיטה שתיחשב לקידום ספיד קייםods. השימוש בדם הדחוס לאחר מיצוי פלזמה מייצג מקור חלופי להדנ"א הגנומי, וכך לצמצם את כמות דגימות דם מעובדים וצמצום מספר הדגימות הנדרשות מכל מטופל. זה הייתי סופו של דבר לחסוך זמן ומשאבים.

מערכת איסוף דם P100 BD לשימור חלבון פלזמה נוצרו כשיטת משופרת על פני פלזמה קודמת או אוסף סרום 1 צינורות, כדי לייצב את תכולת החלבון של דם, מה שמאפשר גילוי טוב יותר חלבון סמן ביולוגי וניסויים פרוטאומיקה מהדם אנושי. את צינורות BD P100 מכילים 15.8 מ"ל של K2EDTA מיובש ריסוס וקוקטייל lyophilized קניינית ספקטרום רחב של מעכבי פרוטאז כדי למנוע קרישה ולייצב את חלבוני הפלזמה. הם כוללים גם מפריד מכאני, המספק מכשול פיזי בין פלזמה וכדורי תא לאחר צנטריפוגה. שיטות כמה כבר המציאו כדי לחלץ דנ"א מהדם קרוש samples נאסף בצינורות פלזמה ישנים 2-4. אתגרים מהשיטות הללו היו קשורים בעיקר עם הסוג של מפריד בתוך הצינורות (מפריד ג'ל) וכללו קושי במתאושש דם קרוש, את אי הנוחות של פיצול או פיזור הקריש, וחסימה של החילוץ על ידי קריש ג'ל ההפרדה.

אנו מציגים את השיטה הראשונה שמחלצת ומטהרת את הדנ"א הגנומי מהדם נמשך בצינורות P100 BD החדשים. אנו משווים את איכות דגימת DNA מP100 צינורות שמצינורות EDTA. הגישה שלנו היא פשוט ויעיל. היא כוללת ארבעה שלבים עיקריים כדלקמן: 1) השימוש בפלזמת BD P100 (BD אבחון, ניצוצות, MD, ארצות הברית) צינור עם מפריד מכאני לאיסוף דם, 2) הסרת המפריד מכאני באמצעות שילוב של סוכרוז ו וו סטרילי מהדק מתכתי, 3) ההפרדה של שכבת מעיל באפי המכילות את התאים לבנים ו -4) הבידוד של הדנ"א הגנומי ממעיל באפי באמצעות ערכה מסחרית רגילה DNA מיצוי או פרוטוקול סטנדרטי דומה.

פרוטוקול

1. אוסף דוגמאות

  1. לאסוף דגימות דם מאנשים עם הסכמה מדעת ראויה. עבור כל אדם, לצייר 4 עד 5 מ"ל של דם לתוך צינור P100 (BD אבחון, פרנקלין לייק, ניו יורק, ארה"ב). לצורך השוואה, בו זמנית לאסוף דם בצינור EDTA.
  2. את צינורות BD P100 מכילים K2EDTA מיובש תרסיס מ"ל 15.8 וקוקטייל lyophilized קניינית ספקטרום רחב של מעכבי פרוטאז כדי למנוע קרישה ולייצב את חלבוני הפלזמה. הם גם מכילים מפריד מכאני. לאחר איסוף הדם כולו, לשמור על שני הצינורות בטמפרטורת חדר למשך 60 דקות ללילה עד שעיבוד מתרחש.
  3. צנטריפוגה P100 צינורות BD ב 2500 גרם במשך חמישה עשר דקות בטמפרטורת חדר. העבר את הפלזמה שנאסף מעל למפריד מכאני לצינורות צנטריפוגה מיקרו.
  4. אחסן את צינורות P100, המכיל הדם נדחס מתחת למפריד, ב -80 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנים להתחיל שלוחה DNAraction.

2.1 מ דם של P100 צינור (P100_DNA)

  1. את צינורות P100 מאוחסנים ב -80 ° C לאחר מיצוי פלזמה. בתוך 3 עד 4 חודשים, לשלוף את צינור P100 המכיל דם הדחוס מהמקפיא ולהפשיר על 37 מעלות באמבט מים במשך 5 דקות (איור 1 א). הסר את כל פלזמה שיורית שיושבת מעל המפריד. הוסף 2 מ"ל של תמיסת סוכרוז 17% (שיפוע פתרון נבדק בבית - נתונים שלא פורסמו) בצינורות P100 מעל המפריד (איור 1). צנטריפוגה צינורות בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות ב 2500 G; תהליך זה דוחף את המפריד מכאני לחלק העליון של הצינור ומניב שלוש שכבות של פתרון כולל מעיל באפי (איור 1 ג). באופן ידני לחלץ את המפריד באמצעות מהדק מתכת מעוקל steriled (1D איור).
  2. לאחר אחזור המפריד מכאני מכל צינור (איור 1D), להסיר וdiscarד שכבת סוכרוז העליון. העבר את השכבה האמצעית, המייצגת את שכבת מעיל באפי (BC), לתוך צינור סטרילי 15 מיליליטר חרוטי. הוסף פוספט חיץ מלוח (PBS) להגדיל את ההיקף מעיל באפי ל3 מ"ל. לחלץ את ה-DNA מהמעייל באפי באמצעות ריאגנטים מקיט דם Puregene Qiagen לפי המלצת היצרן, למעט מהירות צנטריפוגה של 2,500 גר '(במקום 2,000 גר').
  3. לlyse ולהסיר את תאי הדם האדומים (RBC), להוסיף 9 מ"ל של RBC לתמוגה 3 מ"ל של מעיל באפי. הפוך כל צינור מספר פעמים ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות עם פה והיפוך במהלך דגירה. ספין למטה בכל תערובת 2,500 גרם במשך 5 דקות וזורקים supernatant. פנק את הכדור שנותר בצינור אחד עם 3 מ"ל של תמיסת תמוגה תא ומערבולת במשך 15 שניות. פנק lysate עם 1 מ"ל של פתרון משקעים חלבון ו מערבולת במשך 15 שניות.
  4. צנטריפוגה ב 2500 גרם במשך 5 דקות ולהעביר את supernatant לתוך צינור 15 מיליליטר חרוטי המכילים טרי3 מ"ל של 100% isopropanol. להפוך את הצינורות החדשים 10 פעמים ו צנטריפוגות ב 2500 גרם במשך 3 דקות. בטל supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של 70% אתנול. הפוך את צינורות החרוטים כמה פעמים כדי לעקור ולשטוף את כדור ה-DNA. צנטריפוגה ב 2500 גרם דקות 1. אפשר לגלולה לייבוש למשך 3 דקות (במקום הצינור הפוך) בטמפרטורת חדר ולאחר מכן להשעות את ה-DNA עם 250 מ"ל של תמיסת התייבשות על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות והעברה לmicrotube שכותרתו מראש 1.7 מ"ל. אחסן את הצינורות ב -80 ° C עד שימוש.

2.2 מהדם של EDTA Ttube (EDTA_DNA)

  1. כל הדם לבדיקה שגרתית immunohematology נאסף בצינורות פלסטיק vaccutainer תרסיס מצופה 10.8 מ"ג של K 2 EDTA ומאוחסן ב -80 ° C. מאחר שהצינורות לא מכילים מפריד מכאני, מיצוי DNA אינו כולל את הפעולות הקשורות להפרדה מכאנית (2.1.1 ו2.1.2).
  2. בתוך 3 עד 4 חודשים של אחסון דם, DNמופק באמצעות Flex לדג (תרמו פישר סיינטיפיק, Waltham, מסצ'וסטס, ארה"ב). זוהי מערכת מיצוי DNA אוטומציה המבוססת על טכנולוגיית חלקיקים מגנטית והוא מורכב ממספר שלבים, סלולרי תמוגה / ה-DNA מחייבים כביסה וelution ה-DNA.
  3. ערכת שימוש במיצוי DNA היא Kingfisher להגמיש 24 דנ"א דם הערכה (Qiagen, גרמניה).

3. כמות הדנ"א והערכת איכות

הכמות, האיכות והיושרה של הדנ"א הגנומי הוערכו על ידי שילוב של שיטה הכולל picogreen, ספקטרוסקופיה ואלקטרופורזה.

  1. הריכוז של הדנ"א הגנומי נקבע על ידי כימות Nanodrop וpicogreen.
  2. טוהר נקבע ממדידת 260/280 היחס בספקטרופוטומטר Nanodrop.
  3. המדגם (500 ng) נטען גם על 1% agarose ג'ל כדי להעריך את השלמות (השפלה) של ה-DNA.

4. Genotypinמבחני גרם ובקרת איכות

  1. חמש P100_DNA ודגימות EDTA_DNA המקבילות שלהם נבחרו באופן אקראי לניתוח נוסף באמצעות Immunochip המותאם אישית (החיסוני דנ"א ניתוח BeadChip). Immunochip הוא שבב המכיל 196,524 genotyping Infinium פולימורפיזם והוא נועד לimmunogenetic לימודים 5.
  2. עבור כל מדגם, 200 ng של DNA מוגבר, מקוטע, וזרז resuspended במאגר ההכלאה המתאים.
  3. הדגימות מפוגלים הם הכלאה על Immunochips ב 48 מעלות צלזיוס למשך התקופה מינימאלית של 16 שעות.
  4. לאחר הכלאה, את Immunochips מעובדים לתגובות מאריכים יחידה בסיס ומוכתם.
  5. את immunochips לאחר מכן צילמו באמצעות קורא Illumina Hiscan חרוז מערך ואת הנתונים בעוצמה חרוז המנורמלים הוא נטען לתוך תוכנת GenomeStudio Illumina והוסבו לגנוטיפים. גנוטיפים נקראים באמצעות אלגוריתם autocalling של GenomeStudio. בקרת האיכות בvolves הרחקה של פולימורפיזמים נוקלאוטיד בודדים (SNPs) עם שיעור שיחה <95%.
  6. שיחת שיעור SNP משמש כמדד ליעילות assay immunochip. הוא מחושב כאחוז מהמספר הכולל של מבחני על השבב (196,524 SNPs מקודד על שבב אחד) שישיג עוצמת אות מספקת ואיכות לקבל הקצאת גנוטיפ אוטומטית. ה-DNA באיכות גבוהה (260/280 היחס של 1.8 ומעלה, והעדרו של השפלה) צפויה להשיג לפחות את שיחת שיעור זהה לדנ"א שליטת HapMap נכלל בassay immunochip. בקרת איכות כרוכה בהרחקה של SNPs עם שיעור שיחה <95% בכל קבוצת נתונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הערכת איכות ה-DNA ומדידת ריכוז

התשואות של P100_DNAs היו נמוכות באופן משמעותי מאלה של EDTA_DNAs (לוחות 1 ו -2). טוהר ה-DNA מיוצג על ידי ערך 260/280 היחס שלה הוא דומה בשני P100_DNA וקבוצת מדגם EDTA_DNA (לוחות 1 ו -2). האיכות של ה-DNA היא אחידה למדי בכל קבוצה של מדגם למרות שחלק השפלה נתפסת בדגימות EDTA_DNA, כפי שצוין על ידי מריחת אור (איור 2).<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

יש מחלות אנושיות רבות גורמים גנטיים ולחקור את הבסיס הגנטי של מחלות אנושית דורשת ה-DNA באיכות גבוהה הולך וגדל. המקור הנפוץ ביותר של ה-DNA משמש במחקרים גנטיים הוא anticoagulated דם כולו. כי רוב המעבדות הקליניות לבצע בדיקה ביוכימית, סרולוגית, ויראלית כצעד ראשון בחקירת תוצאת פנוטיפי, הדם לעתים קרובות נאסף בצינור פלזמה. אחרי האוסף של הפלזמה, הדם הדחוס נמחקת לעתים קרובות. לכן, כאשר יש צורך לבצע מחקרי DNA גנטיים או בדיקה, נדרש להקיז דם נוסף מאותו החולה. הדם הדחוס מושלך מייצג מקור פוטנציא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מבחנות BD P100BD Diagnostics366448
מבחנות EDTABD Diagnostics367863
סוכרוזסיגמאS9378
מהדף ניירותמוצר משרדי
מבחנה של 15 מ"לCorning430052
תאי דם אדומים (RBC)Qiagen158389 (ערכה)
מלח פוספט רב-ערכי (PBS)Thermo Scientificניתן להוסיף רכיבי תגובה לרחובות (well) של לוח ה-96, כאשר משתמשים בפיפטה בעלת קצה רב-ערוץ כדי להבטיח עקביות. הוסף 100 מיקרוליטר (µL) של תמיסת עבודה של נוגדן ראשוני לכל באר. לאחר מכן, הדבק את לוח ה-96 למשטח יציב והשאר אותו במקרר למשך לילה שלמה (16-18 שעות) כדי לאפשר קשירה חזקה של הנוגדן לאנטיגן.
ערכת BioSprint 96 לבידוד DNA מדם (48) Qiagen940054
מיקרוטובים בנפח 1.7 מ"לAxygenMCT-175-C
ערכה לניתוח DNA של מערכת החיסון האנושית באמצעות BeadChipIlluminaWG-352-1001
קורא מערכי חרו지를Illuminaלא ניתן
תוכנת GenomeStudioIlluminaלא רלוונטי

מקורות

  1. Yi, J., Kim, C., Gelfand, C. A. Inhibition of intrinsic proteolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma. Journal of Proteome Research. 6, 1768-1781 (2007).
  2. Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clinical Chemistry. 42, 647-648 (1996).
  3. Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clinical Chemistry. 44, 1748-1750 (1998).
  4. Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Molecular Biotechnology. 46, 258-264 (2010).
  5. Cortes, A., Brown, M. A. Promise and pitfalls of the Immunochip. Arthritis Research & Therapy. 13, 101(2011).
  6. Basuni, A. A., Butterworth, L. A., Cooksley, G., Locarnini, S., Carman, W. F. An efficient extraction method from blood clots for studies requiring both host and viral DNA. Journal of Viral Hepatitis. 7, 241-243 (2000).
  7. Kanai, N., Fujii, T., Saito, K., Tokoyama, T. Rapid and simple method for preparation of genomic DNA from easily obtainable clotted blood. Journal of Clinical Pathology. 47, 1043-1044 (1994).
  8. Adkins, K. K., Strom, D. A., Jacobson, T. E., Seemann, C. R., O'Brien, D. P., Heath, E. M. Utilizing genomic DNA purified from clotted blood samples for single nucleotide polymorphism genotyping. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 126, 266-270 (2002).
  9. Siafakas, N., Burnett, L., Bennetts, B., Proos, A. Nonenzymatic extraction of DNA from blood collected into serum separator tubes. Clinical Chemistry. 41, 1045-1046 (1995).
  10. Everson, R. B., Mass, M. J., Gallagher, J. E., Musser, C., Dalzell, J. Extraction of DNA from cryopreserved clotted human blood. BioTechniques. 15, 18-20 (1993).
  11. Se Fum Wong, S., Kuei, J. J., Prasad, N., Agonafer, E., Mendoza, G. A., Pemberton, T. J., Patel, P. I. A simple method for DNA isolation from clotted blood extricated rapidly from serum separator tubes. Clin. Chem. 53, 522-524 (2007).
  12. Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clin. Chem. 42, 647-648 (1996).
  13. Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clin. Chem. 44, 1748-1750 (1998).
  14. Matheson, L. A., Duong, T. T., Rosenberg, A. M., Yeung, R. S. Assessment of sample collection and storage methods for multicenter immunologic research in children. Journal of Immunological Methods. 339, 82-89 (2008).
  15. Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Mol. Biotechnol. 46, 258-264 (2010).
  16. Polychronakos, C. Fine points in mapping autoimmunity. Nature. 43, 1173-1174 (2011).
  17. Cooper, J. D., Simmonds, M. J., Walker, N. M., Burren, O., Brand, O. J., Guo, H., Wallace, C., Stevens, H., Coleman, G., Franklyn, J. A., Todd, J. A., Gough, S. C. Seven newly identified loci for autoimmune thyroid disease. Human Molecular Genetics. , (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DNABD P100Buffy CoatDNANanoDrop
שיטה מעשית ורומן לחלץ הדנ"א הגנומי מערכות דם אוסף לשימור חלבון פלזמה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.