אנחנו מתארים שיטה חדשה של בידוד הדנ"א הגנומי מכל הדם שנאסף לפלזמה / סרולוגיה. לאחר איסוף פלזמה, הדם הדחוס בדרך כלל מושלך. השיטה החדשה שלנו מהווה שיפור משמעותי על פני שיטות קיימות והופכת את ה-DNA ופלזמה זמינה מאוסף אחד, מבלי לבקש דם נוסף.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטה מעשית ורומן לחלץ הדנ"א הגנומי מערכות דם אוסף לשימור חלבון פלזמה
במאמר זה
סיכום
תקציר
ניתן לעשות בדיקות מעבדה במנות הסלולריות או נוזל של הדם. השימוש בצינורות איסוף דם שונים קובע את החלק של הדם שיכול להיות מנותח (כולו דם, פלזמה או סרום). מעבדות העוסקות בחקר הבסיס הגנטי של הפרעות אדם מסתמכות על הדם שנאסף בכל anticoagulated vacutainer המכיל EDTA כמקור של ה-DNA לצורך הניתוח גנטי / הגנומי. כי רוב המעבדות הקליניות לבצע בדיקה ביוכימית, סרולוגית ויראלית כצעד ראשון בחקירת תוצאת פנוטיפי, דם anticoagulated נאסף גם בצינור המכיל הפרין (צינור פלזמה). לכן, כאשר ה-DNA והפלזמה נדרשים לניתוחים בו זמנית ומקבילים של נתונים והן הגנומי proteomic, נהוג לאסוף את הדם בשני צינורות EDTA והפרין. אם דם יכול להיות שנאסף בצינור יחיד וישמש כמקור לפלזמה וגם ה-DNA, שיטה שתיחשב לקידום ספיד קייםods. השימוש בדם הדחוס לאחר מיצוי פלזמה מייצג מקור חלופי להדנ"א הגנומי, וכך לצמצם את כמות דגימות דם מעובדים וצמצום מספר הדגימות הנדרשות מכל מטופל. זה הייתי סופו של דבר לחסוך זמן ומשאבים.
מערכת איסוף דם P100 BD לשימור חלבון פלזמה נוצרו כשיטת משופרת על פני פלזמה קודמת או אוסף סרום 1 צינורות, כדי לייצב את תכולת החלבון של דם, מה שמאפשר גילוי טוב יותר חלבון סמן ביולוגי וניסויים פרוטאומיקה מהדם אנושי. את צינורות BD P100 מכילים 15.8 מ"ל של K2EDTA מיובש ריסוס וקוקטייל lyophilized קניינית ספקטרום רחב של מעכבי פרוטאז כדי למנוע קרישה ולייצב את חלבוני הפלזמה. הם כוללים גם מפריד מכאני, המספק מכשול פיזי בין פלזמה וכדורי תא לאחר צנטריפוגה. שיטות כמה כבר המציאו כדי לחלץ דנ"א מהדם קרוש samples נאסף בצינורות פלזמה ישנים 2-4. אתגרים מהשיטות הללו היו קשורים בעיקר עם הסוג של מפריד בתוך הצינורות (מפריד ג'ל) וכללו קושי במתאושש דם קרוש, את אי הנוחות של פיצול או פיזור הקריש, וחסימה של החילוץ על ידי קריש ג'ל ההפרדה.
אנו מציגים את השיטה הראשונה שמחלצת ומטהרת את הדנ"א הגנומי מהדם נמשך בצינורות P100 BD החדשים. אנו משווים את איכות דגימת DNA מP100 צינורות שמצינורות EDTA. הגישה שלנו היא פשוט ויעיל. היא כוללת ארבעה שלבים עיקריים כדלקמן: 1) השימוש בפלזמת BD P100 (BD אבחון, ניצוצות, MD, ארצות הברית) צינור עם מפריד מכאני לאיסוף דם, 2) הסרת המפריד מכאני באמצעות שילוב של סוכרוז ו וו סטרילי מהדק מתכתי, 3) ההפרדה של שכבת מעיל באפי המכילות את התאים לבנים ו -4) הבידוד של הדנ"א הגנומי ממעיל באפי באמצעות ערכה מסחרית רגילה DNA מיצוי או פרוטוקול סטנדרטי דומה.
פרוטוקול
1. אוסף דוגמאות
- לאסוף דגימות דם מאנשים עם הסכמה מדעת ראויה. עבור כל אדם, לצייר 4 עד 5 מ"ל של דם לתוך צינור P100 (BD אבחון, פרנקלין לייק, ניו יורק, ארה"ב). לצורך השוואה, בו זמנית לאסוף דם בצינור EDTA.
- את צינורות BD P100 מכילים K2EDTA מיובש תרסיס מ"ל 15.8 וקוקטייל lyophilized קניינית ספקטרום רחב של מעכבי פרוטאז כדי למנוע קרישה ולייצב את חלבוני הפלזמה. הם גם מכילים מפריד מכאני. לאחר איסוף הדם כולו, לשמור על שני הצינורות בטמפרטורת חדר למשך 60 דקות ללילה עד שעיבוד מתרחש.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הערכת איכות ה-DNA ומדידת ריכוז
התשואות של P100_DNAs היו נמוכות באופן משמעותי מאלה של EDTA_DNAs (לוחות 1 ו -2). טוהר ה-DNA מיוצג על ידי ערך 260/280 היחס שלה הוא דומה בשני P100_DNA וקבוצת מדגם EDTA_DNA (לוחות 1 ו -2). האיכות של ה-DNA היא אחידה למדי בכל קבוצה של מדגם למרות שחלק השפלה נתפסת בדגימות EDTA_DNA, כפי שצוין על ידי מריחת אור (איור 2).<.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
יש מחלות אנושיות רבות גורמים גנטיים ולחקור את הבסיס הגנטי של מחלות אנושית דורשת ה-DNA באיכות גבוהה הולך וגדל. המקור הנפוץ ביותר של ה-DNA משמש במחקרים גנטיים הוא anticoagulated דם כולו. כי רוב המעבדות הקליניות לבצע בדיקה ביוכימית, סרולוגית, ויראלית כצעד ראשון בחקירת תוצאת פנוטיפי, הדם לעתים קרובות נאסף בצינור פלזמה. אחרי האוסף של הפלזמה, הדם הדחוס נמחקת לעתים קרובות. לכן, כאשר יש צורך לבצע מחקרי DNA גנטיים או בדיקה, נדרש להקיז דם נוסף מאותו החולה. הדם הדחוס מושלך מייצג מקור פוטנציא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מבחנות BD P100 | BD Diagnostics | 366448 | |
| מבחנות EDTA | BD Diagnostics | 367863 | |
| סוכרוז | סיגמא | S9378 | |
| מהדף ניירות | מוצר משרדי | ||
| מבחנה של 15 מ"ל | Corning | 430052 | |
| תאי דם אדומים (RBC) | Qiagen | 158389 (ערכה) | |
| מלח פוספט רב-ערכי (PBS) | Thermo Scientific | ניתן להוסיף רכיבי תגובה לרחובות (well) של לוח ה-96, כאשר משתמשים בפיפטה בעלת קצה רב-ערוץ כדי להבטיח עקביות. הוסף 100 מיקרוליטר (µL) של תמיסת עבודה של נוגדן ראשוני לכל באר. לאחר מכן, הדבק את לוח ה-96 למשטח יציב והשאר אותו במקרר למשך לילה שלמה (16-18 שעות) כדי לאפשר קשירה חזקה של הנוגדן לאנטיגן. | |
| ערכת BioSprint 96 לבידוד DNA מדם (48) | Qiagen | 940054 | |
| מיקרוטובים בנפח 1.7 מ"ל | Axygen | MCT-175-C | |
| ערכה לניתוח DNA של מערכת החיסון האנושית באמצעות BeadChip | Illumina | WG-352-1001 | |
| קורא מערכי חרו지를 | Illumina | לא ניתן | |
| תוכנת GenomeStudio | Illumina | לא רלוונטי |
מקורות
- Yi, J., Kim, C., Gelfand, C. A. Inhibition of intrinsic proteolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma. Journal of Proteome Research. 6, 1768-1781 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
