מאמר שיטה

הזרקת subretinal של וקטורי ריפוי גנטי ותאי גזע לעיניים המאוסות

DOI:

10.3791/4286

⸱

25 בנובמבר 2012

 ,  ,  ,  , 
1Bernard and Shirlee Brown Glaucoma Laboratory, Department of Ophthalmology, Columbia University , 2Institute of Human Nutrition, College of Physicians & Surgeons, Columbia University , 3Omics Laboratory, University of Iowa , 4Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקה ניתוחית זו ממחישה את הזריקה של וקטורים בריפוי גנטי ותאי גזע לתוך חלל subretinal של עין העכבר.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אובדן הראייה משפיע על כ -3.4 מיליון בני אדם בארצות הברית והוא צפוי לגדול בשנים הקרובות. 1 לאחרונה, ריפוי גנטי והשתלות תאי גזע הפכו לכולים טיפוליים מרכזיים לטיפול בעיוורון כתוצאה ממחל ניווניות של רשתית. ישנם מספר סוגים של השתלה עצמית לניוון מקולרי גיל (AMD), כגון השתלת תאי אפיתל קשתית פיגמנט, יצרו תוצאות מעודדות, וניסויים בבני אדם החלו לצורות אחרות של טיפולים בתאי גזע וגנים. 2 אלה כוללים החלפת הגן RPE65 הטיפול בחולים עם amaurosis המולד של Leber והשתלת תאי רשתית באמצעות תאי גזע עוברי אנושיים (ES) במחלת Stargardt. 3-4 עכשיו שקיימים נתיבי ריפוי גנטיים ותאי גזע זמינים לטיפול בחולים עם מחלות רשתית, חשוב לוודא הטיפולים הפוטנציאליים הללו במודלים של בעלי חיים לפני שיחולוing במחקרים בבני אדם. העכבר הפך מודל מדעי חשוב לבדיקת היעילות הטיפולית של וקטורי גן טיפוליים והשתלת תאי גזע בעין. 5-8 במאמר זה וידאו, אנו מציגים טכניקה להזריק וקטורי ריפוי גנטיים או תאי גזע לתוך החלל של subretinal עין העכבר תוך מזעור ניזק לרקמות שמסביב.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. להרכיב מכשירים להזרקת subretinal

  1. לרכוש או לבצע מחט קוטר 100 מיקרומטר מצינור נימי זכוכית. ניתן לעשות זאת באופן ידני באמצעות חולץ סאטר P-97 pipet או ציוד דומה אחר. קצה צינורית הנימים יהיה מחומם ומשך עד שהוא מגיע לקוטר הרצוי (100 מיקרומטר). מחט קוטר קטנה יותר יכולה לשמש לוקטורים בריפוי גנטי, אך זה הוא הקוטר המומלץ להזרקת תאים ללא פגיעה בתאים או בעיניים. בהשוואה למחטי פלדה, מחט נימי הזכוכית יש קצה דק מאוד, אבל בוטה, כדי לאפשר הדמיה של נוזל ההזרקה וגישה למרחב subretinal מבלי לגרום לשבירה של רשתית. נקה המחטים נשלפו האלה במידת הצורך באמצעות אתנול 70%, ולאחסן במכל סטרילי. צלחת 15 סנטימטר סטרילי רקמת תרבות עם קלטת להחזיק את המחטים במקום היא דרך אחת שבי לשמור את מחטי הזרקה ומכוסות בסביבת סטרילית. בשלב זה, Complete ההגדרה בתוך חדר הניתוח שבו ההליך יתקיים. זה קל ביותר לשמור על כל הציוד בחדר הניתוח בכל העת על מנת שזה יישאר סטרילי, במיוחד אם הליך זה נעשה בתוך מתקן מכשול.
  2. לשאוב סיליקון לתוך המזרק ולהוציא סיליקון לעזוב ציפוי לאורך הקירות הפנימיים של המחט. ציפוי סיליקון מגדיל את המעבר של תאים ווירוסים דרך קדח המחט, שאחרת להיצמד לקירות נימי הזכוכית הפנימיים.
  3. השג כ 8 סנטימטר אורך צינור פלסטיק סטרילית על ידי חיתוך 25 איסוף דם ¾ מד להגדיר עם נעילת luer בנקודה ישירות לאחר המחט (מוציא את המחט מהצינור).
  4. מלא 1 26 מיליליטר מזרק תת ש 5/8-gauge להחליק עצה עם תמיסת מלח סטרילית ולהוציא את המחט מהמזרק.
  5. צרף מחט הזריקה לסוף הקיצוץ של צינורות הפלסטיק ולצרף את המזרק לluer הנעילה בקצה השניהסוף.
  6. לשאוב סליין סטרילית, כדי למלא את השטח המת במחט הצינורות ונימים, ולהוציא קצת מלחים דרך המחט על מנת להבטיח שהוא מחובר כראוי ללא כל דליפה. בשלב הבא, לשאוב קטן כ 1 סכום, μl של אוויר, בקצה מחט הזריקה. זה יהיה להפריד מליח מנוזל ההזרקה ולספק רמז חזותי יציין את סוף נוזל ההזרקה בהליך כירורגי. מנגנון ההזרקה יש לשמור על משטח נקי ונגב אותה עם 70% אתנול בהליך כירורגי. בנוסף, כל הציוד המשמש במהלך ההליך כירורגי יש לנקות לפני ואחרי עם אתנול 70%, לחריג של מחטי הזרקה שכבר יש להקפיד לקיים סטרילית ומוכן לשימוש. מחטים אלו צריכות להיות מסולקות לאחר ניתוח, ולא שימוש חוזר.
  7. לבסוף, לשאוב פתרון זריקה המכיל את הווקטור הרצוי הארוז הריפוי הגנטי הנגיפי או תאי גזע. ניתן לעשות זאת על ידילוקח את הזריקה לפתרון קצה pipet סטרילי, אז pipetting הפתרון על פני השטח של צלחת תרבות תא סטרילי. הפתרון עכשיו עלול להישאף בקלות לתוך מחט הזריקה באמצעות המזרק. הסכום הדרוש משתנה בהתאם לגילו של העכבר. למטרות שלנו אנו משתמשים 5 עכברי יום שלאחר לידה, שיהיה ניתן להזריק עם 0.5-0.8 μl של נוזל הזרקה. כמויות קטנות יותר, 0.5 μl או פחות, ניתן להשתמש בם לעכברים צעירים וסכומים גדולים יותר, כמו μl 1, יכולות לשמש לעכברים בוגרים. כייל הנגיף או מספר תאים צריך להיות נקבע על בסיס הווירוס / תאים שהוזרקו ורקמות היעד הרצוי שלהם, כמו גם רבים חלקיקים נגיפיים או תאים בנפח קטן יכולים להוביל לרעילות לתאי הרשתית. בסרטון, למטרות המחשה, יש לנו להשתמש 1.5 μl, כמות גדולה יותר של צבע מהצורך להזריק לתוך העין.

2. גישת חלל subretinal

  1. בתוך חדר ניתוח סטרילי,לייצב או להרדים את העכבר על פי הפרוטוקול שאושר באופן מקומי חית הטיפול, המשתנה בהתאם לגילו של העכבר. הרדמה משותפת לעכברים בוגרים כוללת שימוש בגז isoflurane או הזרקה תוך הצפק ממשקל גוף של 0.1 ml/10g קטמין (100 מ"ג / מ"ל) וxylazine (20 מ"ג / מ"ל) בסליין סטרילי. לעכברים סביב לידה, טכניקות הרדמה נפוצות כוללות שימוש בגז isoflurane או cryoanesthesia (היפותרמיה). כל טכניקות ההרדמה חייבות להיות מאושרות על ידי הוועדה המקומית IACUC לפני השימוש. אנו משתמשים בדרך כלל ביום שלאחר הלידה (P) 5 עכברים, למרות שניתן ליישם טכניקות דומות לעכברים צעירים כמו P0 או לעכברים בוגרים. ההליך כירורגי לא יכול להתחיל עד שהעכבר הפסיק להזיז את הגפיים וכבר לא מגיב לכף רגל וצביטות. לעכברים סביב לידה, הם יהפכו לקלים יותר במידה ניכרת מאז צבע זרימת הדם תהיה להאט, מפתח נוסף לידיעה כי הם תחת הרדמה מלאה.
  2. בעכברים סביב לידה, השתמש Vannas מספריים ישרים למ 'AKE חתך משוער 1.5 מ"מ לאורך סדק המכסה הסגור. היזהר לחתוך בכניסה, שבו העין באופן טבעי לפתוח בעתיד. הדבר מבטיח שהעפעפיים יהיו לרפא ולפתוח כראוי במהלך ההתפתחות של העכבר. להב כירורגים יכול לשמש למטרה זו, למרות שאנחנו מעדיפים מספרי Vannas שכן הם מפחיתים את הסיכון לניקוב העין במהלך הליך זה. בסרטון, את המספריים שמשו ישירות לנקב וחתך לאורך שולי העפעף. כאשר לומדים את הטכניקה הזו, יש להשתמש במלקחיים כדי להרים את העפעף לפני החיתוך ולהפחית את הסיכון לפגיעה בעין.
  3. לפרק את העפעפיים עם מלקחי הלבשה מעוקלים לproptose את העין וצובט את העפעפיים מעט מתחת לעין כדי להחזיק אותו proptosed להזרקה. אם חתך המכסה בצע בשלב 2 הוא גדול מדי, העיניים תגלושנה שוב אל מתחת לעפעפיים ולמנוע חשיפה נאותה במהלך הליך ההזרקה. לעכברים בוגרים, תוך הפעלת לחץ קל מסביב לעין עם ד"רessing מלקחיים יכול להחזיק את עיני proptosed להזרקה.
  4. לעשות חתך קטן או בscleral אחורי לקו המשווה של כדור הארץ על ידי מגרד את פני השטח עם להב microsurgery 15-מעלות. חתך זה צריך להיות גדול מספיק כדי לעבור רק את קצה מחט הזריקה, אבל לא יותר מזה. אם העדיף, מחט קטנה, חד כגון מחט דיקור יכולה לשמש כדי להפוך את החתך הזה לתוך חלל subretinal במקום להב microsurgery. בבעלי חי פיגמנט כהה, חום כהה רקמה-פיגמנט (אפיתל הפיגמנט ברשתית דמה-) תהפוך לגלויה בנקודת החיתוך. בעכברי פיגמנט או לבקן מצית, עט סימון כירורגית יכול להיות מיושם על קצה להב microsurgery להשאיר כתם דיו מציין אתר החתך. אם (זגוגית) refluxes נוזל השקוף מתוך אתר החתך, הלהב הוצב עמוק מדי ונכנס לחלל הזגוגית ווירוס או תאים הטיפוליים יכול להיכנס למקום הזגוגית במהלך זריקה. לvisualizatiעל מטרות, עשו חתך לנקודה זו בוידאו. זה עדיין אפשרי כדי להשלים זריקת subretinal במקרה זה, לעומת זאת היפרדות הרשתית נגרמת על ידי הנוכחות של נוזל הזריקה עלולה לא להחלים באופן מלא בעכבר הזה. לכן, יש להקפיד לחתוך רק את פני השטח החיצוניים של העין ולא דרך הרשתית לפני ההזרקה.
  5. בזהירות להכניס את מחט הזריקה לאתר החתך ולקדם אותה במקביל לקיר העין החיצוני להיכנס למקום subretinal. קידום קרוב מדי לקיר החיצוני או עמוק מדי בתוך העין תביים את ההזרקה למיקום הלא הנכון. השיטה הטובה ביותר להבין אם המחט היא במיקום הנכון היא לתרגל את הטכניקה. תרגול בעכברים בקלילות פיגמנט או לבקן יכול לעזור לעשות זריקות מדויקות ומדויקות לתוך חלל subretinal. הסיבה לכך היא נוזל המחט והזרקה הוא גלוי בתוך העיניים האלה.
  6. החל לחץ קל לבוכנת המזרק ולהיותהזרקת ג'ין של הנוזל הרצוי. אם המחט ממוקמת כראוי בתוך מרחב subretinal, backpressure המתון יורגש. אם המחט היא בזגוגית, יהיה משמעותי פחות backpressure ופוטנציאל כלשהו ריפלוקס נוזלים במהלך הזריקה. אם יש backpressure המשמעותי, החזק את המחט במקום ללפחות 15 שניות נוספות לפני הסרת המחט באיטיות. זה יאפשר לחץ התוך העיני הגבוה לשיווי במקום refluxing וירוס או התאים מוזרק בחזרה את אתר החתך. חלק מהאוויר והמלוח ניתן להזריק לתוך חלל subretinal בשל הלחץ המוגבר הנדרשים במהלך הליך ההזרקה. יש להקפיד שלא לבצע להזריק אוויר או תמיסת מלח, שכן הוא יכול לשטוף את הווירוס או תאים המוזרקים מהעין. אפשר גם לגרום להיפרדות רשתית קבועה מהנוכחות של יותר מדי נוזלים שהוחדרו לתוך חלל subretinal. לצורך ההמחשה, צבע והאוויר עודף הוזרק into מרחב subretinal בוידאו. ניתן לראות בבירור כיצד חלק של הצבע יהיה סמוק בחזרה מתוך חלל subretinal אם יותר מדי מוזרק, אלא גם כיצד בועת האוויר נשארת בתוך מרחב subretinal ולא להיעלם לתוך הזגוגית. זה שמש כדי להדגיש כי הזריקות האלה היו במסגרת את המיקום הנכון של העין, כך שאפשר לדמיין איך המחט צריכה להיכנס לאתר החתך. כל הזריקות לתוך חלל subretinal לגרום היפרדות רשתית זמנית בשל הנוכחות של נוזל ההזרקה. אם הליך ההזרקה הושלם כראוי, היפרדות רשתית זמנית זה תהיה לרפא בתוך 24 שעות ועכברים יכולים לשמש לכל ניסויים נוספים. העין עשויה להישאר רכה למשך כשבוע בשל ההליך כירורגי, ולכן הזרקה שנייה יש להימנע בתקופה זו של זמן.
  7. לעכברים ילודים, להשתמש במלקחי ההלבשה המעוקלים בעדינות לדחוף את העין מאחורי המכסים ולמסלול. זה עשוי להיות שימושילהמתין לרגע כדי לאפשר לווירוס להתיישב בתוך מרחב subretinal ולא לגרום לו להיות סמוק מתוך אתר החתך כאשר דחף בעדינות את העין חזרה למסלולו. לאחר ניתוח, ירידה של 0.5% bupivacaine אחד (marcaine) דוללה ל -0.25% בסליין סטרילי ממחט 25-מד יכול להיות ממוקמת באזור ההזרקה. עכברים לא מראים סימנים גלויים של מצוקה לאחר ניתוח subretinal והשימוש בbupivacaine כמשכך כאבים מקומי ארוך טווח היה מספיק לשלוש השנים הקודמות. עכברים תמיד צריכים להיות במעקב אחרי ההליך כירורגי כדי לחפש סימנים של מצוקה; כגון זיהום, נפיחות או ירידה בפעילות היומית הרגילה של העכבר. אם אלה מתרחשים, הווטרינר יש להודיע ​​ותרופות לשיכוך כאבים נוספות כגון עצירות (0.05 מ"ג / ק"ג) יכולות להינתן כזריקת intraperitoneal.
  8. להעיר את העכבר מהרדמה על פי פרוטוקול טיפול בעלי חיים אושר באופן מקומי. העכבר צריך להיות כל זמן בעמ חימוםמודעה כדי לשמור על טמפרטורת גוף תקינה כפי שהוא מתעורר מההרדמה. הניתוח צריך לקחת פחות מחמש דקות עד לסיום, לא סופר את הזמן לעכבר כדי לעבור הרדמה. לכן, כרית חימום אין צורך בהליך בפועל, אך ייתכן שיהיה צורך בעוד אחד לומד טכניקה כמו ההליך יכול לקחת משך הזמן ארוך יותר. העכבר לא צריך להיות ממוקם בחזרה לכלוב נקי עד שהחל לנוע בכוחות עצמו. לילודים, צובט בוהן עדין יעזור להם להתאושש מן ההרדמה, והם צריכים להחזיר את הצבע ותנועתם הוורודים לפני שיוצב בחזרה עם האם. עכברים צריכים להיות במעקב לאורך זמן עבור כל סימנים של מצוקה, כמפורט לעיל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ציור של עין העכבר מוצג עם מבנים הגדולים שכותרתו לעיון, עם חצים המציגים את המיקומים לפעולות כירורגיות הזרקה הן זגוגית וsubretinal (ראשי חץ, איור 1). וקטורי גן טיפולי, כגון lacZ lentiviral וקטור (איור 2), ניתן להזריק באמצעות מקומות אלה. בנוסף, תאי גזע, כגון תאי עכבר גזע עוברי (איור 3), יכולים גם להיות מושתלים באתרים אלה בעין העכבר.

μl 1 מתוך וקטור lentivir...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקת וידאו זה מספקת הוראות השלמת ההליך כירורגי הזרקת subretinal בהצלחה, ולהבטיח שוקטור הריפוי הגנטי או תאי גזע ממוקם במיקום הנחוץ יעילות לטיפול במחלה העינים. טכניקה זו מאפשרת למיקוד של תאי רשתית כגון רשתית או קולטני אור, שכן הוא מציב את וקטורי הריפוי הגנטיים או רקמות של תאי גזע שמקורם באזור של תאים אלה. שיטות קודמות מעורבות זריקות זגוגית, שבו הנוזל המוצבות בתוך חלל הזגוגית וחייבות לעבור דרך הרשתית כדי להתמקד באזורים ספציפיים אלה. הזרקת זגוגית מפחיתה את התמרה של וקטורים בריפוי גנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר כדי למנוע עיוורון; סיוע ניסויי מטקיוקי נגסאקי; מחקר זה תואם את הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר חזותי. KJW נתמך על ידי מענקי NIH 5T32EY013933 ו5T32DK007647-20. VBM נתמך על ידי מענק NIH K08EY020530.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם חברה קטלוג תגובות
0.8-1.10 Tube x 100 מ"מ נימים (זכוכית) קימבל זכוכית, Inc 34502 99
Flaming / בראון micropipette פולר מכשיר סאטר P-97 Narishige microforge יכול לשמש במקום. קטלוג # MF-900
Sigmacote סיגמה אולדריץ SL2-25ML סיליקון
פוספט של Dubecco נאגר מלוח עם סידן כלוריד ומגנזיום כלוריד Gibco-Invitrogen 14040-133
בטיחות-Lok 25 3/4G x 12 "; סט דם אוסף BD Vacutainer 367298
1 המ"ל Sub-Q 26מזרק 5/8G מתלבש טיפ קיטון דיקינסון- 309597
0.5-10 Pipetter Finnpipette השני μl מתכוונן נפח Fisherbrand 21-377-815
1-200 טיפים משופעים טבעיים μl ארה"ב מדעית, Inc 1111-1700
Discovery.V8 מיקרוסקופ סטריאו Zeiss MC1500
60 מ"מ x דיש תא התרבות פוליסטירן מטפל בסגנון 15 מ"מ קורנינג Incorporated 430166
מספרי סטרייט Vannas Storz Ophthalmics E3383 S
מלקחי הלבשה מעוקלים עם serrations העדין Storz Ophthalmics E1408
סכין Microsurgery תואר 15 Wilsברפואת העיניים קורפ 091204
קטמין Ketaset III נדא # 45-290
Xylazine מעבדות לויד נדא # 139-236
Bupivacaine (Marcaine) חברת AstraZeneca N /
עצירות סיגמה אולדריץ B9275

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prevalence of Blindness Data Tables [NEI Statistics and Data]. , National Eye Insitute. Available from: http://www.nei.nih.gov/eyedata/pbd_tables.asp (2011).
  2. Abe, T. Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation. Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).
  3. Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).
  4. Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
  5. Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa. Transplantation. 89, 911-919 (2010).
  6. Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
  7. Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa. Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).
  8. Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice. PLoS One. 6, e189992(2011).
  9. Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , Cold Spring Harbor Laboratories. (2010).
  10. Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42, 517-525 (2002).
  11. Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes. Mol. Vis. 5, 22(1999).
  12. Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. Mouse model resources for vision research. J. Ophthalmol. 2011, 391384(2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים