הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

איתור vivo מערכות הדמיה (IVIS) של וירוס אנצפליטים נוירו פולשנית

20.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/4429

⸱

2 בדצמבר 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental Pathology, University of Texas Medical Branch

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

שימוש בלוציפראז ובמערכות הדמית vivo (IVIS) כרומן האמצעי לזיהוי נקודתי קצה מחלה לפני התפתחויות קליניות להתרחש. IVIS אפשר לנו לחזות בזמן אמתו את הפלישה של וירוסי אנצפליטיים מעל ימים מרובים, מתן מודל מחלה מדויקת יותר למחקר עתידי. זה גם אפשר לנו לזהות את התכונות המגנות הפוטנציאליות של תרופות אנטי וחיסונים מהר יותר ממודלים של בעלי חיים מנוצלים כיום. היכולת לנצל חיות בודדות מעל נקודתי זמן מרובות מבטיחה דרישות מופחתות בבעלי חיים, עלויות ותחלואה הכוללת לבעלי החיים מנוצלים להבטיח אמצעי הומני יותר ויותר מדעי של מחקר מחלה.

תקציר

פיתוחים מודרניים בטכנולוגיית הדמיה לעודד פיתוח וחידוד נוסף בדרך המחקר נגיפי נעשה. הוצע בתחילה על ידי ראסל ורץ' ב3Rs של יום (החלפה, הפחתה, עידון), ניצול מודלים של בעלי החיים במחקר מדעי הוא תחת לחץ מתמיד לזהות מתודולוגיות חדשות כדי לצמצם את שימוש בעלי חיים תוך שיפור דיוק ומהירות מדעי. אתגר גדול למנהלים של יום לעומת זאת, הוא כיצד להבטיח את המחקרים סטטיסטיים מדויקים תוך הפחתת תחלואת מחלות בעלי חיים ומספרים באופן כללי. מחקרי יעילות חיסון כעת דורשים מספר רב של בעלי חיים כדי להיחשב משמעותי מבחינה סטטיסטית, ולעתים קרובות לגרום לתחלואה גבוהה ותמותת נקודתי קצה עבור זיהוי של הגנה חיסונית. אנו מנוצלים in vivo מערכות הדמיה (IVIS) בשיתוף עם אנזים bioluminescent גחלילית בהדרגה כדי לעקוב אחר הפלישה של מערכת העצבים המרכזית (CNS) על ידי enceוירוס phalitic במודל עכברי. בדרך כלל, המחלה מתקדמת לאט יחסית, עם זאת שכפול נגיף הוא מהיר, במיוחד בתוך מערכת העצבים מרכזיים, והוא יכול להוביל לעתים קרובות תוצאה, קטלנית. בעקבות זיהום אפי של העכברים עם TC83 לוק, זן נחלש ונצואלה סוסי דלקת מוח וירוס שונה למבטא גן לוציפראז; אנו מסוגלים לדמיין שכפול נגיף בתוך המוח לפחות שלושה ימים לפני התפתחות תסמיני מחלה קליניות. ניצול פלישת CNS כנקודת סיום מפתח אנצפליטי מחלת פיתוח אנו מסוגלים לזהות הגנת חיסון הטיפולי ובמהירות נגד זיהום TC83 לוק לפני שתסמינים קליניים להתפתח. בעזרת טכנולוגית IVIS אנו מסוגלים להדגים את הבדיקה המהירה ומדויקת של סמים ותרופות וחיסונים, תוך צמצום מספר בעלי חיים ותחלואה.

פרוטוקול

1. הכנת בעלי חיים

  1. הגעת בעלי חיים: עם ההגעה לרמת הבטיחות הביולוגית חית 2 (ABSL2) מתקנים, לאפשר חי מינימום של 2 ימים להסתגל לסביבתם החדשה. לאחר תקופת המנוחה הזו, לבדוק את בעלי החיים כדי להעריך את בריאותם ומראה החיצוני באופן כללי.
    1. כאשר ניצול כתבי ניאון חשוב למקם את כל נושאי חיות על תזונה ללא אספסת כדי להגביל את כמות autofluorescence עיכול ואות רקע.
  2. שבי חיות: כדי לשפר את אות bioluminescent זוהתה מאזור הגולגולת במהלך ההדמיה; לגלח את ראשיהם של כל בעלי החיים. הרדם את החיות בתערובת של גז חמצן ומתאדה isoflurane. לאחר שבעלי החיים הם מורדמים לגמרי, השתמש קוצץ חשמלי לגלח את ראשם. ברגע שסיים עם גילוח, להחזיר את החיות לכלובים שלהם ולבחון להתאוששות מלאה מההשפעות של ההרדמה.
  3. ביו מדיק נתונים(BMDS) הכנסת מערכות משדר (לחול בעקבות גילוח של העכברים בעוד בעלי החיים הם מורדמים מלא): לאמצעי פחות פולשניים כדי לעקוב אחר טמפרטורת שתל משדר preprogrammed BMDS אלחוטי תת עורי באזור הגבי של כל עכבר. משיבים אלו ייאפשרו זיהוי אלחוטי והקלטת טמפרטורה. לאחר ההשתלה של המשדר, להחיל דבק רקמות וטרינרי כיתה לפצע.
  4. אוסף בסיסי: לפני הזיהום, להקליט טמפרטורה בסיסית ומשקל לכל בעלי החיים. איסוף דם לבדיקת ניתוח הפחתת פלאק נטרול (PRNT) דרך לדמם רטרו במסלול (RO) בעוד שהעכברים הם תחת הרדמה. לאחר איסוף דם, להחיל משחת עיניים אנטיביוטית וטרינרית להפחתת זיהום חיידקים משתי פוטנציאלי. אוסף בסיסי זה אמור להסתיים תוך התחשבות במספר הפעמים שהחיות ממוקמות בהרדמה בשל לחץ על העכברים. s אוספי RO עתידייםhould יושלם לאחר הדמיה, בעוד העכבר הוא עדיין תחת הרדמה. הדם המרבי שנאסף מRO צריך להיות סביב 200 μl.
  5. זיהום: עכברי מקום תחת הרדמה כפי שתואר קודם לכן. לחסן דרך הציר אפי שימוש במינון של 5x10 6 עד 7 5x10 pfu TC83 לוציפראז-בהיקף כולל של 40 μl מדולל על ידי נאגר מלוח פוספט (PBS) באמצעות זיהום אפי. בעקבות זיהום, למקם את העכברים בתוך כלוב הדיור שלהם ולבחון את ההתאוששות.

2. בעלי החיים דימות

הצהרה: שמור עכברים בתוך יחידת הדיור שלהם, הבטיחות הביולוגית הקבינט (BSC), או תיבת הכלת XIC בכל העת. את BSCs אושר עבור פרוטוקול זה הוא B1 סוג II או סוג B2.

  1. להזריק כל בעלי החיים עם 10 μl לגרם של משקל גוף של (IP) luciferin intraperitoneal בריכוז של 15 מ"ג / מ"ל.
    1. עכברים שקבלו Ampligen הם להיות injecteIP ד במינון של משקל 12.5 מ"ג / קילו גוף בזיהום -4 שעתי הודעה או זיהום 48 שעתי הודעה המבוססת על הקבוצה שלהם.
  2. לפני הזריקה עם luciferin, להפריד את העכברים לקבוצות של שלוש, כדי להבטיח התאמה נכונה בתוך תיבת הכלת XIC-3.
    1. לכל ההדמיה, לנצל משחה עינית / סיכה כדי למנוע הייבוש של הקרנית לאורך ההליך.
  3. פתח את התוכנה ולחץ LivingImage האתחול להכין תיבת ההדמיה; שמירה אוטומטית סט, זמן חשיפה לאוטומטית (זמן חשיפה באופן אוטומטי הוא תכונה חדשה של תוכנת LivingImage 3.2 ומעלה), להציג שדה ל-C, ומסנן כדי לפתוח; תחום של ראות זו מבוססת על מספר העכברים אתה הדמיה; ויכול להיות מותאם לפי צורך מסנן לפרויקטי הדמיה אחרות.
  4. ודא שמסנני פחם האוויר לא פגו, מכל החמצן הוא מלא, ומאגר isoflurane מלא. הנח רצועות קטנות של סרט החשמל בXIC-3תיבת solation המסייעת בהפחתת תנועת בעלי חיים במהלך הדמיה.
  5. הזרק לעכברים עם IP luciferin כמתואר בסעיף 2.1 ומקום בתוך תא אינדוקצית isoflurane (עם המכסה נפתח) במשך 3-5 דקות.
  6. לאחר 5 דקות, לסגור את המכסה של תא האינדוקציה ולהתחיל את זרימת isoflurane. ההרדמה מופעלת על כ 3-5% בקבוצת קצב זרימת החמצן בכ 2.0 ליטר / דקה. ברגע באופן מלא יחכה מחוסר הכרה נוספת 30 שניות ולהעביר את העכברים לתיבת בידוד XIC-3. ודא ארון הבטיחות הביולוגית מנוצל מאפשר להדחה הבטוחה של isoflurane כנוהל זה יהיה כרוך בהפסד של isoflurane מתא האינדוקציה (יחידת IVIS מכילה המכל שלו הפסיבי הוגן ותיבת הכלת XIC-3 מתחברת ישירות לכניסה / יציאת ארובות כדי להבטיח זרימת הרדמה כלולה).
    1. העבר את העכברים המבוססים על מספר שבב / קבוצה לתיבת בידוד XIC-3 עם מחבר isoflurane המצורפתד לפתוח. מקם את העכברים ולכן הם ערוכים בעינת חזה עם ראשים בעדינות מונחים על רצועות הקלטת.
  7. נגב את תיבת הכלת XIC עם אתנול, ידי ריסוס ותחתון של XIC-3 עם cavicide, ולהעביר לחדר הדמית IVIS. חבר מחדש את ההרדמה לתיבת ההכלה פעם אחת בתוך יחידת ההדמיה.
  8. אחרי 10 דקות לאחר ההזרקה של luciferin, תמונת העכברים באמצעות תוכנת דמות החיה.
  9. בעקבות הדמיה ראשונית עם מסנן פתוח, ליזום הדמית 3-Dimensional DLIT באמצעות הניתוח של הרצף ואשף התקנת תמונה לבלוציפראז גחלילית bioluminescent. תהליך הדמיה זה ייקח 4-5 דקות ואמור להסתיים בשדה ראיה רלוונטי למספר העכברים הרצויים.
    1. ניתוח Ex-vivo הוא נתיחה לאחר מוות אפשרית הבאה ואוסף של המוח. מניח את המוח בצלחת פטרי סטרילית, לטפטף 50-100 μl מניות luciferin למעלה, ומקום בתוך imaגינג תיבה.
  10. לסיים תמונת מסנן פתוחה שנייה בזיהום שלאחר 15-17 דקות עם השלמת הדמית DLIT. ודא ניתוח רצף כבוי ואת שדה הראיה וגדרות מסננות מוחזרים להגדרות קודמות.

3. עכברי החזרה וניתוח נתונים

  1. כבה את מכשיר אדי isoflurane ולהעביר את תיבת הכלת XIC בחזרה לארון הבטיחות הביולוגית.
  2. מקם את העכברים בחזרה בתוך יחידת הדיור שלהם, לסגור אותו, לרסס חיצוני עם חומר חיטוי מתאים ומקום בחזרה על מדף הדיור.
    1. עכברים יבטיחו שהתאוששו לגמרי מהרדמה.
  3. חזור על התהליך הזה כניסוי דורש עד ההדמיה השלימה.
  4. לחטא BSC, כבה את הציוד, ולהעביר את כל הנתונים למיקום מעבדה מחוץ לניתוח נוסף.
  5. לנתח את הנתונים ולהפיק תמונות 3-ממדיות המבוססות על תוצאות IVIS utilizing תוכנת LivingImage.
    1. ודא שהתמונה כראוי אורינטציה והאיזון מוגדר תאורה / צבע. בתוך פלטת כלי האפשרויות כוללות תמונה התאימי, תיקונים, מידע תמונה, והגדרות החזר על השקעה.
    2. לנצל צורות החזר השקעה כדי לזהות את נקודתי חוזק אות ספציפית המבוסס על מיקום.
    3. לשחזר את טופוגרפית המשטח כדי להדגיש את גוף העכבר, לאתחל מחדש DLIT 3D, ולהשתמש בהתאמה ליניארי כדי להגדיר את מפת האיברים לשיקום הטופוגרפי.
  6. ניתוח טיטרציה ויראלי נוסף ניתן להשלים באמצעות אוסף של דם ואיברים. טיטרציה במחקר זה הושלמה באמצעות הומוגניזציה של רקמת המוח בmodified הבינוני נשרים (MEM). Homogenate היה מדולל באופן סדרתי ואנו נגועים צלחת גם 6 תאי Vero לשעה 1. התאים היו מכוסים בשכבת agarose/2xMEM 1.5% ודגרו על 2 ימים ב37 מעלות. תאים היו קבועים עם 10% פורמלין למשך 30 דקות ומוכתמיםסגול גביש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בוירוס מהונדס גנטי, TC83-לוציפראז, ראה עלייה בעוצמת אות bioluminescent כשכפול הנגיף עובר מאזור האף אל מערכת העצבים מרכזיים המרכזי (איור 1). עקב קצב השכפול הנגיפי הגבוה, אנו מצפים לראות רמות גבוהות של אות bioluminescent (איור 2 א) תלויות על הווקטור ואת התגובה החיסונית החיה לוקטור. אנו צופים גידול האות הזה להמשיך לשיא, בין זיהום שלאחר 5-7 ימים, בשילוב עם שיא שכפול נגיפי בתוך מערכת עצבים מרכזיים (התרשים 2B). בעקבות האות ושיא ויראלי, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בעוד פרוטוקול זה מכסה את היבטי ההדמיה לניתוח בvivo, חשוב להכיר את וקטור bioluminescent כגורם מרכזי למחקרים עתידיים. הניצול שלנו של TC83, של חיסון מוחלש של VEEV, כוקטור לביטוי של לוציפראז מבטיח שכמויות גדולות של האנזים שתופקנה, בשל השיעור הגבוה של שכפול הנגיף במערכת עצבים מרכזיים, כמתואר 1-4 בעבר. בעוד התוספת של אמרגן 2 subgenomic והתוצאות הגנטיות וציפראז בהנחתה נוספת של וירוס רקומביננטי בהשוואה לסוג פראי TC83, הנחתה זו אינה מופיעה כדי לשנות את המהלך הקליני של ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

מכון לTranslational UTMB-NIH מענק מדעי 1UL1RR029876-01 ואלישה פריית'ר על סיועה בעריכת וידאו לכתב היד הזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם המגיב חברה מספר קטלוגים תגובות (אופציונלי)
D-luciferin
Isoflurane
Xenogen IVIS מערכת (ספקטרום) Caliper מדעי חיים
מערכת ההרדמה XGI-8-גז Caliper מדעי חיים
תיבת הבלימה XIC-3 Caliper מדעי חיים
LivingImage 4.0 תוכנה Caliper מדעי חיים
שבבי טלמטריה / זיהוי ביו מדיק מערכות מידע IPTT-300 זיהוי בעלי חיים ומזגשבמקום
מזרק BD Integra 1ml TB עם GX מחט 26 3/8 " הפישר סיינטיפיק 305279
דבק רקמות ונד וטרינר הפישר סיינטיפיק NC9259532
משחה לרפואת עיני Vetropolycin מוצרי וובסטר הווטרינריים 78444656
פוספט של Dulbecco נאגר מלוח 1X Invitrogen 14190-144
BMDS צ'יפ קורא ביו מדיק מערכות מידע DAS-7007S
תוכנת DAS-HOST ביו מדיק מערכות מידע משמש להורדת מידע חללית

מקורות

  1. Steele, K. E., et al. Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice. Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).
  2. Ludwig, G. V., et al. Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice. Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).
  3. Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse. Virology. , 208-662 (1995).
  4. Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis. Virology. 344, 315-327 (2006).
  5. Patterson, M., et al. Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals. Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).
  6. Cook, S. H., Griffin, D. E. Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals. J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).
  7. Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nat. Med. 4, 245-247 (1998).
  8. Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging. PLoS ONE. 4, e6592(2009).
  9. Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors. J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).
  10. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
  11. Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus. Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).
  12. Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection. J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

זיהוי בביולומינצנציהדלקת המוח של סוסי ונצואלהמערכת העצבים המרכזיתלוציפראז של גחלילילמודל עכבריזיהום תוך-אפידימות תלת-ממדיטכנולוגיית IVISיעילות חיסון
איתור vivo מערכות הדמיה (IVIS) של וירוס אנצפליטים נוירו פולשנית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.