ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

Summary

Autophagy היא תהליך בכל מקום שמאפשר לתאים לבזות ולמחזר חלבונים ואת האברונים. אנו מיישמים מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתקדם כדי להמחיש ולכמת קטנים, אבל שינויים מהותיים, פיסיים הקשורים לאינדוקציה של autophagy, כולל הקמת וההפצה של autophagosomes וlysosomes, ומיזוגם בautolysosomes.

Abstract

סרטן הערמונית הוא הצורה המובילה של גידולים ממאירים בקרב גברים בארצות הברית בזמן ניתוח טומן בחובו סיכון משמעותי של חוסר אונים וחוסר שליטה, מסורתיים כימותרפיות גישות היו במידה רבה, לא הצליחו. טיפול הורמונלי הוא יעיל בשלב מוקדם, אבל לעתים קרובות לא מצליח עם ההתפתחות העתידית של גידולי הורמון עקשן. אנחנו כבר מתעניין בפיתוח תרופות למיקוד חסר מטבולי מסוימים של תאים סרטניים. לאחרונה הראינו כי תאים סרטניים בערמונית במיוחד חסרי אנזים (synthase argininosuccinate, או ASS) המעורבים בסינתזה של חומצת אמינו ארגינין ^1. מצב זה גורם לתאים הסרטניים להיות תלוי בארגינין אקסוגני, והם עוברים לחץ מטבולי כאשר ארגינין החופשי תיגמר ידי ארגינין deiminase (ADI) ^1,10. ואכן, יש לנו הראינו כי תאי ערמונית סרטניים אנושיים CWR22 RV1 נהרגים ביעילות על ידי עדי באפופטוזיס caspase-עצמאי וautopha האגרסיביGY (או macroautophagy) ^1,2,3. Autophagy היא תהליך שימור אבולוציונית-המאפשר לתאים כדי לעכל חלבונים לא רצויים על ידי התמוטטות lysosomal במהלך רעב תזונתי ^4,5. למרות המרכיבים החיוניים של מסלול זה הם מאופיינים היטב ^6,7,8,9, היבטים רבים של המנגנון המולקולרי עדיין אינם ברורים - בפרט, מהו תפקידיו של autophagy במותו בתגובה של תאי סרטן ערמונית לאחר טיפול ADI ? על מנת לענות על שאלה זו, אנו נדרשים שיטת ניסוי כדי למדוד את הרמה וההיקף של תגובת autophagic בתאים - ומכיוון שאין סמנים מולקולריים ידועים במדויק יכול לעקוב אחר תהליך זה, בחרנו לפתח גישה מבוססת הדמיה, באמצעות מיקרוסקופיה ^11,12. הקרינה 3D כמותית

שימוש בתאים CWR22Rv1 במיוחד שכותרתו עם בדיקות ניאון לautophagosomes וlysosomes, אנו מראים כי ערימות תמונת 3D רכשו עם או wiמיקרוסקופיה deconvolution defield (ומאוחר יותר, עם סופר רזולוציה, מיקרוסקופיה מובנה תאורה) יכולה ללכוד באופן ברור בשלבים הראשונים של האינדוקציה autophagy. עם יישומי ניתוח תמונה דיגיטליים זמינים מסחרי, אנחנו יכולים בקלות להשיג מידע סטטיסטי על מספר autophagosome ויזוזום, גודל, הפצה, ומידה מסוימת של colocalization מכל תא הדמיה. מידע זה מאפשר לנו לעקוב אחר ההתקדמות של autophagy בתאים חיים דווקא ומאפשר המשך החקירה שלנו לתוך התפקיד של autophagy בטיפול כימותרפי.

Protocol

1. חלק 1: תא תרבות וסימון חיסוני ניאון

1. לגדול CWR22 RV1 תאים סרטניים בערמונית אדם על זכוכית coverslips (# 1.5 או עובי מיקרומטר 170) הוצב ב6 גם צלחות, עם RPMI (מדיאטק, VA) המכיל 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין / גלוטמין.
2. לגרום autophagy על ידי טיפול דגימות נבחרות עם ארגינין deiminase (ADI, 0.3 מיקרוגרם / מ"ל) שבנאגר מלוח פוספט (PBS).
3. תקן תאים עם paraformaldehyde 4% (PFA, פישר סיינטיפיק, NH) מדולל PBS; 100 μl לכל coverslip, במשך 10 דקות ב RT.
4. שטוף תאי 3x עם 1 מיליליטר HBS / BSA.
5. Permeabilize תאים עם saponin 0.05% (Sigma, מיזורי) בHEPES (HBS) / BSA, 100 μl לכל coverslip, במשך 15 דקות ב RT.
6. לפני חיסוני תיוג, דגימות בלוק עם 2.5% קזאין (Sigma, מיזורי) ברוורד / BSA, 100 μl לכל coverslip, לשעה 1 ב RT.
7. דגירה תאים קבועים עם נוגדנים עיקריים מדוללים 2.5% קזאין / HBS / BSA, 100 μl לcoverslה-IP, O / N ב 4 ° C.
8. שטוף תאי 3x עם 1 מיליליטר HBS / BSA.
9. דגירה תאים קבועים עם נוגדנים משני מדולל 2.5% קזאין / HBS / BSA, 100 μl לכל coverslip, עבור שעה 1 ב RT.
10. שטוף תאי 3x עם 1 מיליליטר HBS / BSA.
11. הר coverslips הוכנה על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית רגילות עם זהב SlowFade או להאריך את מגיב זהב antifade (Invitrogen, CA) המכיל 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
12. חותם קצות coverslip עם לק. לקבלת התוצאות הטובות ביותר הדמיה, לאפשר זמן (באופן אידיאלי O / N) לתקשורת אנטי לדעוך לחלחל יסודיות תאים.
13. פני השטח coverslip נקיים עם מתנול ו / או כלורופורם.
14. הוסף שמן טבילה (מקדמת שבירה 1.520 כאשר הדמיה על 37 מעלות צלזיוס, או 1.516 כאשר הדמיה ב RT) לעדשה האובייקטיבית 60x 1.42 NA (אולימפוס, יפן).
15. שקופית עמדה על הבמה מיקרוסקופ ולהקים מוקד עם התאים של עניין.

2. חלק 2: הכנת תאים להדמית חיה

1. לגדול CWR22 RV1 תאים המבטאים שרשרת ירוקה ניאון-חלבון בשילוב אור 3 (LC3-GFP) בתקשורת ובתרבות RPMI המכיל 10% FBS ו -1% אנטיביוטיקה על 35 מ"מ מנות תרבות פולי-D-ליזין מצופים זכוכית תחתונה (MatTek, MA). תאים צריכים להיות מצופה בצפיפות מספקת כדי להקל על התפשטות מהירה, אבל לא כל כך הרבה, כי תאים הם מגודל ופסע בכבדות על ידי הזמן של הדמיה.
2. פנק את דגימות תאים שנבחרו עם עדי (0.3 מיקרוגרם / מ"ל) ב-PBS.
3. כ 1 שעות לפני ההדמיה, לדלל 1.5 μl של 20 אדום DND-99 (Invitrogen, CA) עם Lysotracker מיליליטר RPMI. המכיל 10% FBS ו -1% אנטיביוטיקה. השתמש בפתרונות המכילים עדי לדגימות שנבחרו. חם בכל אמצעי התקשורת עד 37 מעלות צלזיוס לפני הוספה לצלחת התרבות.
4. דגירה תאים עם RPMI המכיל Lysotracker האדום DND-99 עבור 15-45 דקות בשעה 37 ° C.
5. כ -30 דקות לפני ההדמיה, הדלק את המתחם הסביבתי WeatherStation ולאפשר לאזן עד 37 ° C-CO ₂ ו -5% (עם humidifאוויר IED).
6. שטוף תאים עם PBS ולהחליף את התקשורת עם התקן RPMI המכיל רק 10% FBS ו -1% אנטיביוטיקה. הוסף לADI דגימות כפי שצוין.
7. מנות מ"מ הר 35 coverglass-תחתונות התרבות במתאם מותאם אישית (Applied Precision, Inc, וושינגטון), ועמדה על הבמה מיקרוסקופ. השתמש בשמן טבילה (מקדמת שבירה 1.520) על עדשת 60x 1.42 NA האובייקטיבי, ולמקם את המנה התרבות רכוב על הבמה.

3. חלק 3: מיקרוסקופית Deconvolution וניתוח

הפרוטוקול בסעיף זה מניח את השימוש במיקרוסקופ DeltaVision האישי DV deconvolution והנלווה SoftWorX יישום החבילה (Applied Precision, Inc, וושינגטון).

1. הפעל מערכת מיקרוסקופ, כולל תחנת עבודה ורכישת בקר מכשיר. פתח את יישום Resolve3D כדי לאתחל את הבמה מיקרוסקופ והפעל את מקור אור קסנון. לאפשר 10 דקות למקור אור כדי להתחמם ולהגיע לתנאים יציבים.
2. הוסףטיפה של שמן טבילה (מקדמת שבירה 1.520 עבור דגימות חיות ב 37 מעלות צלזיוס או 1.516 לדגימות קבועות ב RT) על עדשת 60x 1.42 NA האובייקטיבי, ודגימת שקופית מרכז (כיסוי פנים להחליק למטה) על פני העדשה האובייקטיבית.
3. או באמצעות תאורה בהירת שדה או חיצונית ולהתמקד גס ידית כוונון, להעלות לאט עדשה האובייקטיבית עד חרוז שמן טבילה יוצר קשר עם מכסה זכוכית ההפוכה. (מנקודה זו, שכבת התאים צריכה לבוא אל מוקד תוך כמה סיבובים של קנס המיקוד להתאים ידית). כאשר עובדים עם דגימות קבועות על השקופיות, מומלץ להימנע מתאים בתוך או בקרבת אזורים עם כל בועות. בעת צפייה בשידור חי בדגימות עם צלחת זכוכית התחתונה, להימנע מהזזת העדשה האובייקטיבית מחוץ לגבולות של coverslip הזכוכית.
4. יכול להיות מזוהה על ידי Autophagosomes eGFP אות (ירוק). Lysosomes מזוהה על ידי Lysotracker האדום (מדגם חי) או נוגדני ניאון אנטי Lamp1 (מדגם קבוע). גרעין תא מזוהה על ידי DAPI staining (מדגם קבוע).
5. בחר תחום רצוי של נוף. באופן אידיאלי, תאים צריכים להפגין אות ניאון טובה בכל הערוצים המתאימים, ומספיק מחוברים ופרושים על פני השטח coverslip כך שהתוכן תאיים הם קל לדמיין. התאמות קטנות ברוחב X, Y ו-Z-מיקוד יכולות להיות נשלטו על ידי מחשב באמצעות ממשק Acquire3D. הגדר binning ל1x1 או 2x2, תלוי תחום רצוי של צפייה (ניתן לראות יותר תאים בתחום כאשר binning מוגדר 2x2).
6. לתמונת נתונה דרך הבטן של תא, להגדיר את הפרמטרים חשיפה (למשל% עוצמת שידור וזמן חשיפה) כאלה שעוצמת פיקסל המקסימלי אינה עולה על 3,000 סעיפים. באופן כללי,% הולכה צריכה להיות מוגדרת נמוך ככל האפשר, מבלי להעלות את זמן החשיפה המקביל מעל 1 שניות. חזור על תהליך עבור כל צבע פלואורסצנטי להיות צילמו ועבור כל שדה נפרד של נוף כדי לקבל את התמונות באיכות הגבוהות ביותר.
7. הגדר את upper ותחתונים גבולות של Z-המחסנית על ידי התאמת ההתמקדות רק מעט מעל החלק העליון והתחתון של מדגם התא, בהתאמה. המספר הכולל של תמונות בניתן Z-מחסנית יהיה ובכך ייקבע על ידי מגבלות אלה ועל ידי המרווח בין שכבות (ערך ברירת מחדל: 0.2 מיקרומטר).
8. כדי למזער את ממצא תנועה במהלך רכישת תמונה, אנו ממליצים שנגדיר את המצב לרכישת התמונה "אורך גל אז Z-מחסנית" לדגימות קבועות, ו" Z-מחסנית אז אורך גל "לדגימות חיות.
9. תמונות הקרינה הם deconvolved באמצעות SoftWorX (יישומי Precision, וושינגטון) ולאחר מכן נותחו באמצעות Volocity (אימפרוביזציה, החברה פרקין אלמר, MA).

4. חלק 4: סופר רזולוציה, מיקרוסקופית מובנה תאורה (OMX)

הפרוטוקול בסעיף זה חל על השימוש במיקרוסקופ התאורה מובנית OMX (יישומי Precision, וושינגטון).

1. הפעל את כוח העיקרי ולייזרים רצויים (410 ננומטר, 488 ננומטר, ו / או 532 ננומטר). חכה ל20 ק"מn ללייזרים שהתייצבו תרמית.
2. הוסף שמן טבילה (מקדמת שבירה 1.516 עבור דגימות קבועות ב RT) על עדשת 60x 1.42 NA האובייקטיבי. אם בועות נראות בטיפת השמן, לנקות האובייקטיבי ולהוסיף שמן שוב.
3. הנח שקופיות מדגם על הבמה ובמידת צורך, לאפשר 10 דקות לתאים להתיישב על coverslip.
4. לאתחל את תכנית הרכישה. השתמש בתאורת הקרינה כדי להתאים את הפוקוס עד שניתן לראות קווי המתאר חדים של התא. (יש להקפיד בכל העת כדי לצמצם את החשיפה של תאים לעירור הקרינה, ועד לרכישת התמונה בפועל).
5. ניתן לרכוש סריקת פסיפס ספירלה לצפות בתצוגה מקדימה של אזורים גדולים יותר המדגם לבחור תאים או אזורים של עניין. מומלץ להשתמש בזמני חשיפה קצרים (1-10 אלפיות שנייה) ואת כוח עירור נמוך (0.1-1% העברת) בזמן סריקת המדגם או מציאת מטרות.
6. זהה autophagosomes על ידי הקרינה ה-GFP-LC3. זהה lysosomes ידי Alexa פלואוריד 555 אנטי LAMP(חלבון קרום יזוזום הקשורים) וגרעין תא באמצעות DAPI (דגימות קבועות).
7. בחר תנאי ניסוי כולל גל עירור, שטח תמונה (לדוגמא 512x512), עובי מחסנית, זמן חשיפה, ואחוז ההולכה לייזר. לקבלת תמונות סופר נפתרו, ודא שאפשרות התאורה מובנית מופעלת. למיקרוסקופיה deconvolution על OMX, בחר את אפשרות התאורה הקונבנציונלית.
8. לקבלת התוצאות הטובות ביותר לשיקום, בחר תנאי ניסוי כאלה שספירת עוצמתו המרבית היא בין 10,000 ל -15,000 במהלך הרכישה. אם photobleaching הוא דאגה, ניתן להשתמש בהדמיה בחשיפה נמוכה (ספירה בין 5,000 ל 10,000). באופן אידיאלי, את הספירות לא צריכים להפחית יותר מגורם של שתיים במהלך כל הרכישה, ויש להימנע מירידות של יותר מגורם של ארבע. במידת צורך, להפחית את עובי הערימה כדי להבטיח ספירת העצמה מתמשכת. המצלמה מרווה ב64,000 ספירה, אז מקסימום באף פעם לא צריכה דריכות תעלה על זה. לקבלת דוגמיות טובה, מצאנו את תנאי הניסוי להיות 10 ~ 50 בזמן החשיפה אלפיות שני עם 1% שידור בלייזר. דגימות בהירות וphotostable שניתן הדמיה שוב ושוב עדיפות. כתם יציב נדרש לזמן לשגות, תמונות נפתרו העל.
9. כדי להפחית את הרעש, מהירות קריאת נתונים 95MHz (אפשרות מהירות בינונית) וזמן רכישה של 2 אלפיות שני או יותר מומלץ. חפצים מוגברים מתקבלים בהדמיה המשוחזרת, כאשר המדגם נע במהלך הרכישה. בשל השפעה זו, חשיפות קצרות מומלצות לתאים שאינם חסיד או הנעים במהירות.
10. הדמיה רבת ערוצים יכולה להתבצע בו זמנית או ברצף. בין דיבורים תשואות מצב רציפים והוא פחות וכך מומלץ.
11. כדי להפחית photobleaching, זה מומלץ בדרך כלל לתמונה עם אורכי גל ארוכים יותר עירור ראשון (532 ננומטר, 488 ננומטר, ולאחר מכן 410 ננומטר). עם זאת, לתוצאות הניסוי שמוצגות באיור 3, צו זה היה הפוךד (ננומטר כלומר 48, 532 ננומטר ו 410 ננומטר) בשל photostability של מדגם המסוים הזה.
12. הגדר את הגבול העליון / התחתון של Z-המחסנית על ידי הזזת הבמה מיקרוסקופ עד שהחלק העליון / התחתון של התאים הוא קצת מחוץ לפוקוס. המרחק הרצוי בין כל תמונה צריך להיות מוחזק קבוע ב0.125 מיקרומטר לסופר רזולוציה הדמיה, כתוכנה שיחזור לקחת את הערך הזה כברירת מחדל.
13. לשחזר ערימות תמונה באמצעות SoftWorX (יישומי Precision, וושינגטון) ולנתח באמצעות Volocity 6.0 (פרקין אלמר, MA).

Results

רצף התמונות שמוצג באיור 1 מציג את השינויים הפיסיים המתרחשים בתאים במהלך CWR22 80 דקות הראשונה של האינדוקציה autophagy. בזה ומחקרים אחרים (לא מוצג) באופן עקבי ציינו: (1) תזוזה של הגרעין ממרכז התא; (2) הפחתה של נקודות מוקד הדבקה, וכן (3) טרנסלוקציה הכללית של autophagosomes וlysosomes לכיוון המרכז תא. בנוסף, אנחנו גם נצפו עלייה קטנה בcolocalization (מסומן בצהוב) בין autophagosomes (ירוק) וlysosomes (אדום), בנקודות זמן מאוחר יותר.

Discussion

תוך ההתבוננות הישירה של תאים שכותרתו עם בדיקות ניאון נגד LC3 מקובל כשיטת סטנדרטית כדי לאשר תגובת autophagic ^6, ההדמיה 3D הכמותי של אותה המערכת (כפי שעשינו) מספק מידע ופירוט חסר תקדים על התהליך המורכב של הסלולר autophagy . בפרט, אנו צופים כי מאות (אם לא אלפי) של autophagosomes בתאים חיים נוצרים בתוך 80 דקות של השראת autophagy. באופן דומה, אנו רואים שינויים מורפולוגיים מעניינים מאוד בחלוקת תאי lysosomal במהלך האינדוקציה autophagy. בתוך תא נתון, הירידה במספר autophagosome ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ארגינין דימינאז (ADI)	DesigneRx
HEPES	Sigma	H4034
קזאין	סיגמא	C5890
פרפורמלדהיד	פישר	4042
ספונין	סיגמא	S4521
אלקסה נגד עכבר 555	Invitrogen	A21422
אלקסה נגד ארנב 647	Invitrogen	A21244
LysoTracker אדום DND-99	Invitrogen	L7528
אנטי Lamp1	DSHB	H4A3
אנטי קדרין	איתות תאים	#3195
SlowFade Gold	Invitrogen	S36936
35 מ"מ צלחת תחתונה מזכוכית מצופה פולי-די-ליזין	MatTek	P35GC-1.5-1.4-C
מס '1, כיסוי 22 מ"מ	קורנינג	#2865-22
שקופיות מיקרוסקופ	גלובוס סיינטיפיק	1324G