Autophagy היא תהליך בכל מקום שמאפשר לתאים לבזות ולמחזר חלבונים ואת האברונים. אנו מיישמים מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתקדם כדי להמחיש ולכמת קטנים, אבל שינויים מהותיים, פיסיים הקשורים לאינדוקציה של autophagy, כולל הקמת וההפצה של autophagosomes וlysosomes, ומיזוגם בautolysosomes.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם
במאמר זה
סיכום
תקציר
סרטן הערמונית הוא הצורה המובילה של גידולים ממאירים בקרב גברים בארצות הברית בזמן ניתוח טומן בחובו סיכון משמעותי של חוסר אונים וחוסר שליטה, מסורתיים כימותרפיות גישות היו במידה רבה, לא הצליחו. טיפול הורמונלי הוא יעיל בשלב מוקדם, אבל לעתים קרובות לא מצליח עם ההתפתחות העתידית של גידולי הורמון עקשן. אנחנו כבר מתעניין בפיתוח תרופות למיקוד חסר מטבולי מסוימים של תאים סרטניים. לאחרונה הראינו כי תאים סרטניים בערמונית במיוחד חסרי אנזים (synthase argininosuccinate, או ASS) המעורבים בסינתזה של חומצת אמינו ארגינין 1. מצב זה גורם לתאים הסרטניים להיות תלוי בארגינין אקסוגני, והם עוברים לחץ מטבולי כאשר ארגינין החופשי תיגמר ידי ארגינין deiminase (ADI) 1,10. ואכן, יש לנו הראינו כי תאי ערמונית סרטניים אנושיים CWR22 RV1 נהרגים ביעילות על ידי עדי באפופטוזיס caspase-עצמאי וautopha האגרסיביGY (או macroautophagy) 1,2,3. Autophagy היא תהליך שימור אבולוציונית-המאפשר לתאים כדי לעכל חלבונים לא רצויים על ידי התמוטטות lysosomal במהלך רעב תזונתי 4,5. למרות המרכיבים החיוניים של מסלול זה הם מאופיינים היטב 6,7,8,9, היבטים רבים של המנגנון המולקולרי עדיין אינם ברורים - בפרט, מהו תפקידיו של autophagy במותו בתגובה של תאי סרטן ערמונית לאחר טיפול ADI ? על מנת לענות על שאלה זו, אנו נדרשים שיטת ניסוי כדי למדוד את הרמה וההיקף של תגובת autophagic בתאים - ומכיוון שאין סמנים מולקולריים ידועים במדויק יכול לעקוב אחר תהליך זה, בחרנו לפתח גישה מבוססת הדמיה, באמצעות מיקרוסקופיה 11,12. הקרינה 3D כמותית
שימוש בתאים CWR22Rv1 במיוחד שכותרתו עם בדיקות ניאון לautophagosomes וlysosomes, אנו מראים כי ערימות תמונת 3D רכשו עם או wiמיקרוסקופיה deconvolution defield (ומאוחר יותר, עם סופר רזולוציה, מיקרוסקופיה מובנה תאורה) יכולה ללכוד באופן ברור בשלבים הראשונים של האינדוקציה autophagy. עם יישומי ניתוח תמונה דיגיטליים זמינים מסחרי, אנחנו יכולים בקלות להשיג מידע סטטיסטי על מספר autophagosome ויזוזום, גודל, הפצה, ומידה מסוימת של colocalization מכל תא הדמיה. מידע זה מאפשר לנו לעקוב אחר ההתקדמות של autophagy בתאים חיים דווקא ומאפשר המשך החקירה שלנו לתוך התפקיד של autophagy בטיפול כימותרפי.
פרוטוקול
1. חלק 1: תא תרבות וסימון חיסוני ניאון
- לגדול CWR22 RV1 תאים סרטניים בערמונית אדם על זכוכית coverslips (# 1.5 או עובי מיקרומטר 170) הוצב ב6 גם צלחות, עם RPMI (מדיאטק, VA) המכיל 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין / גלוטמין.
- לגרום autophagy על ידי טיפול דגימות נבחרות עם ארגינין deiminase (ADI, 0.3 מיקרוגרם / מ"ל) שבנאגר מלוח פוספט (PBS).
- תקן תאים עם paraformaldehyde 4% (PFA, פישר סיינטיפיק, NH) מדולל PBS; 100 μl לכ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
רצף התמונות שמוצג באיור 1 מציג את השינויים הפיסיים המתרחשים בתאים במהלך CWR22 80 דקות הראשונה של האינדוקציה autophagy. בזה ומחקרים אחרים (לא מוצג) באופן עקבי ציינו: (1) תזוזה של הגרעין ממרכז התא; (2) הפחתה של נקודות מוקד הדבקה, וכן (3) טרנסלוקציה הכללית של autophagosomes וlysosomes לכיוון המרכז תא. בנוסף, אנחנו גם נצפו עלייה קטנה בcolocalization (מסומן בצהוב) בין autophagosomes (ירוק) וlysosomes (אדום), בנקודות זמן מאוחר יותר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תוך ההתבוננות הישירה של תאים שכותרתו עם בדיקות ניאון נגד LC3 מקובל כשיטת סטנדרטית כדי לאשר תגובת autophagic 6, ההדמיה 3D הכמותי של אותה המערכת (כפי שעשינו) מספק מידע ופירוט חסר תקדים על התהליך המורכב של הסלולר autophagy . בפרט, אנו צופים כי מאות (אם לא אלפי) של autophagosomes בתאים חיים נוצרים בתוך 80 דקות של השראת autophagy. באופן דומה, אנו רואים שינויים מורפולוגיים מעניינים מאוד בחלוקת תאי lysosomal במהלך האינדוקציה autophagy. בתוך תא נתון, הירידה במספר autophagosome .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
תמיכת גרנט: NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (HJ קונג), NIH CA150197S1 (ע"א Changou), מרכז-0,120,999 PHY NSF Biophotonics מדע וטכנולוגיה (DL וולפסון, FYS צ'ואנג), DOD PC073420 (RJ מודגש), המחקר המועצה של נורבגיה, Leiv Eiriksson מסעות גרנט 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ קונג גם מכיר בתמיכת קרן אובורן קהילת סרטן הקרן. RJ מודגש גם מכיר את תמיכתה של מקדונלד 'ס י הקדש.
אנו מודים לד"ר ג'ני ויי-ג'ן קונג וד"ר בור ון וו בDesigneRx לאספקה נדיבה של עדי.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ארגינין דימינאז (ADI) | DesigneRx | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| קזאין | סיגמא | C5890 | |
| פרפורמלדהיד | פישר | 4042 | |
| ספונין | סיגמא | S4521 | |
| אלקסה נגד עכבר 555 | Invitrogen | A21422 | |
| אלקסה נגד ארנב 647 | Invitrogen | A21244 | |
| LysoTracker אדום DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| אנטי Lamp1 | DSHB | H4A3 | |
| אנטי קדרין | איתות תאים | #3195 | |
| SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | |
| 35 מ"מ צלחת תחתונה מזכוכית מצופה פולי-די-ליזין | MatTek | P35GC-1.5-1.4-C | |
| מס '1, כיסוי 22 מ"מ | קורנינג | #2865-22 | |
| שקופיות מיקרוסקופ | גלובוס סיינטיפיק | 1324G |
מקורות
- Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).
- Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
