שינוי ורקומבינציה גנטי של תרבויות איברי בלוטות רוק

סיכום

טכניקה גנטית כדי לתמרן בתוך כל תאי האפיתל Vivo לשעבר בלוטות תרבית עוברית של עכברי לסת תחתונה (SMGs) באמצעות העברת גנים נגיפית מתוארות. שיטה זו מנצלת את היכולת המולדת של SMG האפיתל וmesenchyme ספונטני לrecombine לאחר פרידה וזיהום של יסודות אפיתל עם וקטורי adenoviral.

תקציר

מסעף המורפוגנזה מתרחש במהלך ההתפתחות של איברים רבים, ובלוטת הלסת התחתונה העכבר העוברית (SMG) היא מודל קלסי ללימוד הסתעפות המורפוגנזה. בSMG פיתוח, תהליך זה כרוך איטרטיבי צעדים של ניצן אפיתל והיווצרות דביקה, סופו של דבר לתת לעלייה לרשת מסועפת של acini מורכבת וצינורות, המשמשת לייצור ולשנות / להעביר את הרוק, בהתאמה, לחלל הפה ^{1 - 3.} קרום אפיתל הקשורים למרתף וההיבטים של תא mesenchymal, כוללים תאי mesenchyme, גורמי גדילה והתאי, המיוצרים על ידי תאים אלה, הם קריטיים למנגנון ההסתעפות, למרות כמה האירועים התאיים ומולקולריים מתואמים נשאר הבינו היטב ⁴ . המחקר של המנגנונים המולקולריים נהיגת התקדמות המורפוגנזה אפיתל הבנת מנגנוני התפתחות שלנו ומספק תובנה regener האפשריגישות רפואה ative. מחקרים כאלה כבר הקשו בשל העדר השיטות יעילות למניפולציה גנטית של האפיתל הרוק. נכון לעכשיו, תמרת adenoviral מייצגת את השיטה היעילה ביותר להכוונת תאי אפיתל בבלוטות למבוגרות in vivo ^5. עם זאת, בexplants העוברי, mesenchyme צפוף וקרום המרתף המקיף את תאי האפיתל מונעים גישה נגיפית לתאי האפיתל. אם mesenchyme מוסר, האפיתל ניתן transfected באמצעות adenoviruses, ויסודות אפיתל יכולים לחדש את הסתעפות המורפוגנזה בנוכחות Matrigel או laminin-111 ^6,7. צמיחת הגמד אפיתל mesenchyme ללא דורשת גם תוספת נוספת עם גורמי גדילה מסיסים ולא לסכם המורפוגנזה הסתעפות באופן מלא כפי שהוא מתרחש בבלוטות שלמות ^8. כאן אנו מתארים טכניקה המאפשרת תמרת adenoviral של תאי האפיתל והתרבות של דואר transfectedpithelium עם mesenchyme המשויך. בעקבות microdissection של SMGs העוברי, הסרת mesenchyme והזיהומים נגיפיים של האפיתל עם אדנווירוס GFP המכיל, אנו מראים כי האפיתל משלב מחדש באופן ספונטני עם mesenchyme הנגוע, משחזר מבנה בלוטות SMG שלם ומסועף המורפוגנזה. אוכלוסיית תאי אפיתל המהונדס גנטי ניתן לפקח בקלות באמצעות שיטות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רגילות, אם תייג-fluorescently מבני adenoviral משמשים. שיטת רקומבינציה הרקמות המתוארות כאן היא כיום השיטה היעילה והנגישה ביותר לtransfection של תאי האפיתל עם וקטור פראי סוג או מוטציה בתוך מבנה רקמת 3D מורכב שאינו דורש דור של בעלי חיים מהונדסים.

פרוטוקול

הפרוטוקול מכיל ארבעה שלבים עיקריים, כמתואר באיור 1. כל הצעדים מתוארים בפירוט מלא. בניית adenovirus וטיהור נגיפית צריכות להיות מופעלים מראש של קצירת האיברים לשימוש בהתמרה הגנטית של יסודות אפיתל גזור. כל אמצעי בטיחות BSL-2 הסטנדרטי צריך להיות אחרי כשעובד עם adenoviruses.

1. בלוטת קצירת עכבר עוברי לסת תחתונה (SMG) וmicrodissection

1. להרדים עכברי מתוזמן בהריון נשי (מתח outbred CD-1 או ICR) באמצעות ₂ CO הרדמה, ואחרי עקירת צוואר רחם ומחרוזות קציר של עוברי עכברים ביום עוברי 13 (E13, 3-5 ניצני אפיתל) הליכים שאשרו IACUC המוסדי ועדה. היום של גילוי תקע נרתיק מיועד כE0. בלוטות רוק יכולות גם להיות שנקטפו ותרבית בE12 השלב שבו יש ניצן אחד עיקרי וגבעול עם בתרי רק מתחילליזום. SMGs לפני שלב זה דורש תנאי תרבות שונים מאלה שצוינו כאן.
2. העברת חוטי עובר ל 10 מנות סטריליים סנטימטר רקמות תרבות מלאה עם 25 מ"ל של מדיום DMEM / החם של F12 (F12) החסרים אדום פנול (חיים טכנולוגיים) והשלים עם 100 U / המ"ל פניצילין, ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין (עט סטרפטוקוקוס, חי טכנולוגיות).
3. באמצעות אזמל סטרילי (# 11 להבים) ומלקחיים (# 5, כלי מדע פיין, 11252-20), להסיר את העוברים מהצ'קים לתוך צלחת נפרדת סנטימטר המכיל 10 מ"ל של 25 DMEM/F12 + עט סטרפטוקוקוס.
4. לנתק את ראש העובר עם חתך אלכסוני ממש מתחת ללסת התחתונה.
5. לבודד את הצבתות הנמוכות מהראשים תחת מיקרוסקופ לנתח סטריאו עם אור בסיס משודר (ניקון SMZ645 או שווה ערך) באמצעות חתך מתחת ללסת העליונה. הנח את הרקמות על גבי חתיכה נוספת של זכוכית ולא ישירות על מרכיב כוס בסיס מיקרוסקופ.
6. לאסוף את הצבתות הנמוכות ל3 מ"ל של DMEM/F12 + עט סטרפטוקוקוס בצלחת סטרילית 35 מ"מ רקמת תרבות.
7. מניח פרוס לסת תחתונה על במת מיקרוסקופ לנתח כך שהלשון היא בתחתית של הפרוסה אבל הוא מצביע לעבר כיוון השעה 12:00.
8. שימוש בצד אחד של שני מלקחיים מוצלבים בתנועת מספריים, להסיר ולסלק ^rd הנמוך 1/3 מפרוסת הלסת התחתונה.
9. הפעל ° 90 הפרוסה לימין (אם ימני), ובאמצעות קיצוץ מספריים עם המלקחיים, לחתוך את החלק העליון של פרוסת הלסת התחתונה (בלי לחתוך את הלשון) באמצע הדרך לפרוסה.
10. קולף את הרקמה העודפת ולהסיר אותו משם, כדי לחשוף את SMGs מתחת. יהיה אחד בכל צד ליד בסיס הלשון.
11. שימוש בזוג אחד של מלקחיים להחזיק את הרקמה על ידי הלשון, להשתמש במלקחיים האחרים להקניט את SMG מהלשון. חזור לבלוטה האחרת.
12. לאסוף את בלוטות רוק microdissected ל3 מ"ל של DMEM/F12 + עט סטרפטוקוקוס לתוך רקמת מ"מ חדשה סטרילית 35מנת התרבות. הערה: את בלוטות הלסת התחתונות הגדולות יותר (3-5 ניצני אפיתל) יחד עם בלוטת sublingual הקטנה המחוברת (ניצן 1) יכולות להיות מתורבתות בשלמות על ידי דילוג לשלב 4 וביצוע צעדים 4.1, 4.3, ו -4.4, כפי שתואר לעיל ^2,8.

2. SMG הפרדת הגמד אפיתל

1. מקום 5 (או יותר) בלוטות רוק לתוך קרקעית מזכוכית, 50 מ"מ קוטר microwell מנה (מאטק תאגיד, P50G-1.5-14-F) ובו 200 μl של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS חסר Ca ^{+ +} או Mg ^{+ +,} חיים טכנולוגיים) המכיל 0.4% (v / v) dispase (חיים טכנולוגיים, חתול. לא. 17105-041) ודגירה במשך 15 דקות ב 37 ° C.
2. לאחר הדגירה, באמצעות קצה פיפטה סטרילי 200 μl, לשאוב בזהירות את פתרון dispase מבלי להפריע לבלוטות. מייד להוסיף 200 μl של DMEM/F12 מדיה המכילה 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, לעקר מראש עם 0.22-מיקרומטר מסנן) כדי לנטרל את dispase.
3. תחת מיקרוסקופ לנתח, בעזרת זוג מלקחיים עם טיפים יפים (# 5 Dumostar, כלי מדע פיין, 11295-20), בעדינות להפריד mesenchyme המשוחרר מכל את הבלוטות וצינוריות אפיתל SMG, דואג להשאיר את האפיתל שלם .
4. טרום רטוב טיפ סטרילי 200 μl פיפטה עם DMEM/F12-BSA תקשורת ועדינות פיפטה את יסודות אפיתל לתוך צלחת חדשה בקוטר 50 מ"מימ המכילה 200 microwell μl של DMEM/F12 + עט סטרפטוקוקוס. השתמש בקצה איכות גבוהה 200 μl פיפטה עם קצה חלק.
5. במנה שמכילה את חלקי mesenchyme, להשליך כל רקמה שאינה mesenchymal כוללת את בלוטות sublingual וכל ניצני בלוטת לסת תחתונות מנותקים.

3. זיהום adenoviral של יסודות ראשונים אפיתל

1. לעשות 200 μl של תקשורת זיהום ויראלי על ידי דילול אדנווירוס עניין בDMEM/F12 + עט סטרפטוקוקוס בצינור microcentrifuge כך שכייל של הפתרון המתקבל הוא 1x10 ^{8 9} PFUs -10.כייל אופטימלי הנדרש לאיתור וירוסים שונים עשוי להשתנות. חשוב להשתמש כלוריד צסיום (CsCl)-מטוהר הכנות יראליים לשימוש יעיל בספיגה אופטימלית.
2. הסר את המדיה מהצלחת המכילה את החמישה יסודות אפיתל. להוסיף במהירות 200 μl של תקשורת הזיהום, שמירה על היסודות רטובים בכל העת. לנקוט באמצעי זהירות הנדרש בעת טיפול בנגיף והשלכה של טיפי pipet מזוהמים. לחטא את כל משטחים מזוהמים בוירוס, 10% בתמיסת כלור.
3. העבר את יסודות אפיתל רחוק אחד מהשני עם מלקחיים כדי למנוע מהם להידבק זה לזה ולאפשר להם להתיישב לתחתית הצלחת. דגירת יסודות בתקשורת הנגיפית לשעה 1 בטמפרטורת חדר. במהלך הדגירה, להפריד את היסודות, אם הם יעברו קרובים זה לזה. נדנדה או תנועה מוגזמת תאפשר את בלוטות גוש ביחד.
4. לאחר הדגרה, בעדינות להסיר את המדיה נגיפית המכיל ולהשליך כראוי, נזהר שלא לשבש את rudiments. הוסף 200 μl של DMEM/F12 + עט סטרפטוקוקוס. חזור על לשטוף את זה לפחות פעמים נוספות ולהחליף עם 200 μl של DMEM/F12 + תקשורת העט סטרפטוקוקוס. השטיפות האלה הן קריטיות כדי להסיר כל וירוס שאינו קשור מאוד לאפיתל ולמנוע הדבקה של mesenchyme.
5. דגירת יסודות אפיתל עם 200 מ"ל של DMEM/F12 מכיל 2% (v / v) Matrigel (BD Biosciences, 356231) למשך 20 דקות. אנו מוצאים כי דגירה קצרה זה בMatrigel ממזערת את הרגרסיה של בתרי קיים בתקופת התרבות הראשונית, אבל צעד זה ניתן לוותר אם החשיפה לMatrigel אינה רצויה.

4. תרבות vivo לשעבר של SMGs recombined

1. הנח כל גמד, אחד בכל פעם, באמצעות קצה פיפטה מראש רטוב 200 μl, על גבי (חתך קטן) מחורצים 13 מ"מ, 0.1 מיקרומטר Nuclepore קרום מסנן מסלול-Etch (Whatman) מרחף מעל 200 μl של מדיה התרבות ( 5 יסודות / סינון) בצלחת microwell בעלת קרקעית זכוכית. תקשורת התרבותהוא: DMEM/F12 + עט סטרפטוקוקוס המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל וחומצה transferrin 150 מיקרוגרם / מ"ל אסקורבית, כפי שתואר קודם לכן ^2,8. Transferrin ידוע כדי לעורר הישרדות והסתעפות המורפוגנזה של בלוטות רוק וexplants איברים האחרים ^9. תוספת של חומצה אסקורבית הוכחה לעורר SMG הסתעפות ^10. זה ידוע לפעול כcofactor בתגובות hydroxylation רבות של מסלולים מטבוליים (כגון hydroxylation פרולין במהלך היווצרות סיבי קולגן ¹¹⁾ וגם ממריץ ייצור פיברונקטין וlaminin בexplants איברים האחרים ^12.
2. הסר כתקשורתיים רבה על גבי המסנן ככל האפשר לאחר ההוספה כל גמד אפיתל. יותר מדי תקשורת על גבי המסנן עלולה לגרום למסנן לשקוע, בעוד פחות המדיה הופכת מיקום של היסודות וmesenchyme הרבה יותר קל. תקשורת העודפת ניתן להסיר גם עם קצה פיפטה או באמצעות מלקחיים לאחיזה בתקשורת בין הקצוות.
3. חתיכות mesenchyme מקום נגזרו הלוך ושובמ 3-4 בלוטות על גבי ו / או סביב כל גמד אפיתל. הוצא את כל אמצעי נוסף המקיף את הבלוטות כדי למנוע תנועה של mesenchyme הרחק מהיסודות. Mesenchyme נגזר מבלוטות יותר אינו מועיל אך פחות יכול להיות מזיק לצמיחת הגמד אפיתל.
4. דגירת SMGs מורכב בחממת humidified (אוויר / 5 CO _2% 95%) על 37 מעלות צלזיוס למשך 48 -72 שעות, בהתאם לצורך.
5. Brightfield לרכוש ו / או תמונות ניאון של בלוטות חיות ב0 שעות (אם רוצה), 2 שעות לאחר רקומבינציה וכל 24 שעות לאחר מכן במיקרוסקופ אור הפוכה, כלפי מעלה, או סטריאו מצויד במצלמה דיגיטלית באמצעות הגדלת מטרת 4X או 5X ל ללכוד את הבלוטה מורכב כולו במסגרת אחת מנוף. תמונות של בלוטות הרוק להראות את הניגוד הטוב ביותר תוך שימוש בהגדרת brightfield או טבעת השלב המתאימה להציב דרך חלק לתוך נתיב האור (דבר שאינו אפשרי במיקרוסקופים מלאים אוטומטיים). לעומת שלב סטנדרטי היא לאלא הכרחי מאז הבלוטה היא עבה ויוצר ניגוד.
6. בנקודתי זמן וברצוי, SMGs מורכב יכולה להיות קבוע במשך 20 דקות עם פתרון מקבע עשויות paraformaldehyde 2% (PFA) ב1X PBS המכיל 5% (w / v) סוכרוז (טוב יותר לשמור על המבנה תאי הפנימי על ידי שמירה על התאים ב מדינת מליחות). שלא כמו 4% PFA, 2% PFA ישמור כמות משמעותית של אות ה-GFP אם מקבעים נמחק לחלוטין לאחר קיבוע. בלוטות ניתן לאחסן עד השבוע 1 ב 1X PBS בחושך ב 4 ° C עד immunocytochemistry הר השלם והדמית confocal מבוצע, כפי שדווח בעבר ^3,6,13-15. באופן אידיאלי, יש לבצע הדמית immunocytochemistry וזמן קצר לאחר קיבוע לקבל את התמונות באיכות הטובה ביותר. בלוטות יכולות להיות גם lysed במאגר Ripa ל- PAGE SDS אחרי ניתוח סופג מערבי.

תוצאות

הזרימה של צעדי הניסוי המרכזיים מתוארת באיור 1. דוגמה של SMG שלם, גמד אפיתל מבודד, וmesenchyme המקביל שלה מוצגת באיור 2. תמונות של brightfield SMGs מורכב, שממשיך לעבור הסתעפות המורפוגנזה כאשר vivo לשעבר תרבותי לזמנים שצוינו, המוצגים באיור 3. בלוטות recombined גדלו במשך 48 שעות להביע GFP אפיתל מוצגות באיור 4. תמונות confocal של SMGs מורכב קבועות וצלמו לאחר 72 שעות בתרבות ואחרי immunocytochemistry, מוצגים

דיון

טכניקת רקומבינציה אפיתל-mesenchymal vivo לשעבר פורסמה לראשונה לבלוטות רוק לסת תחתונות בשנת 1981 ^16. בפרוטוקול זה, אנו עומדים בהרחבה על השיטה המקורית, באמצעות זיהום adenoviral כדי לתפעל ביטוי גני התא אפיתל בהקשר של בלוטה התחברה מחדש. אנו מראים כי אחוז של תאי האפיתל נגוע באדנווירוס, ואילו אחוז מתאים נגועים תלוי במאפיינים של אמרגן ויראלי, כייל נגיף, וטוהר נגיפי. התבררנו לנו שיש צורך להשתמש בוירוסי CsCl שיפוע מטוהר-לתמרת אפיתל יעילה, הטיהור שאינו מתוארת כאן. מאז גם...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
DMEM / החם של F12 בינוני ללא פנול אדום	חי טכנולוגיות	21041-025
פניצילין וסטרפטומיצין	חי טכנולוגיות	15070-163	מניית 10X
Dispase	חי טכנולוגיות	17105-041	הקפא aliquots שימוש היחיד ב- 20C
BSA	סיגמא	A2934-100G	V שבריר, אנדוטוקסין הנמוך
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	צריך להיות כייל נוגדנים גבוה (1x10 10 pfu / מ"ל). וירוסים מטוהרים CsCl יעילים יותר ממטוהר טור וירוסים בבדיקה זו.
16% Paraformaldehyde	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	15710	דילול של 2% בPBS עם סוכרוז 5% (w / v)
1X פוספט-נאגר מלוח (PBS)	חי טכנולוגיות	70011-044	הכין ממניות 10X
תמיסת המלח המאוזן של האנק	חי טכנולוגיות	14175095	לא סידן, לא מגנזיום, לא אדום פנול
Transferrin	סיגמא	T8158	25 מ"ג / מיליליטר פתרון המניות בDMEM/F12 תקשורת. הקפא aliquots שימוש יחיד ב- 20C
חומצת L-אסקורבית (הוויטמין C)	סיגמא	A4403	75 מ"ג / מיליליטר פתרון המניות בDMEM/F12 aliquots media.Freeze שימוש יחיד ב- 20C
			טבלת 1. רשימה של חומרים כימיים הנדרש לSMG פרוטוקול רקומבינציה.
10 מנות פלסטיק סטריליים סנטימטר	קורנינג	430167	צלחות ללא רקמת התרבות שטופלה יכולות לשמש גם.
מיקרוסקופ לנתח סטריאו עם אור בסיס מועבר	ניקון	SMZ645	כל סטריאו ביתור מיקרוסקופ ניתן להשתמש כי יש בסיס אור מועבר.
35 מנות תרבות רקמות מ"מ	בז	353001	צלחות ללא רקמת התרבות שטופלה יכולות לשמש גם.
50 מנות microwell קוטר המ"מ	מאטק תאגיד	P50-G-1.5-14F
מסננים הממברנה מסלול-Etch Nuclepore	Whatman	110405	קוטר מ"מ 13, גודל נקבובי 0.1 מ"מ
מיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield	Carl Zeiss, ארה"ב	Axio אובזרוור Z1	כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי (זקוף, אניnverted או ביתור מיקרוסקופ סטריאו) ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר ביטוי של GFP בהגדלה נמוכה עם מצלמה דיגיטלית מצורפת.
מיקרוסקופ confocal	Microsystems היקה	TCS SP5	מיקרוסקופיה confocal יש צורך לראות מבנים ניידים מפורטים. כל confocal מיקרוסקופ ניתן להשתמש.
עכברי מתוזמן בהריון נשים, מתח CD-1 או ICR	צ'ארלס ריבר מעבדות		עוברים נקצרים ביום 13 (עם היום של גילוי תוסף המיועד כיום 0).
להב אזמל # 11	כלי מדע פיין	10011-00
ידית אזמל # 3	כלי מדע פיין	10003-12
דומון # 5 סגסוגת מלקחי inox, 0.05 X 0.02mm	כלי מדע פיין	11252-20	אידיאלי לקציר בלוטות מעוברים
דומון # 5 סגסוגת מלקחי dumostar, 0.05 X 0.01mm	כלי מדע פיין	11295-20	טיפי גלם דרושים להסרת mesenchyme מהאפיתל. מחטי טונגסטן יכולים לשמש גם.
			טבלה 2. ציוד המשמש בSMG פרוטוקול רקומבינציה.