Citrobacter rodentium דגם עכבר: תרומות הפתוגן ומארח לומדים קוליטיס המדבק

סיכום

זיהום rodentium Citrobacter מספק מודל יקר ללמוד זיהומים חיידקיים enteric כמו גם לארח תגובות וקוליטיס חיסוניים בעכברים. פרוטוקול זה מתאר מדידה של יושרת מכשול, עומס הפתוגן ופגיעת היסטולוגית מאפשרת אפיון היסודי של תרומות פתוגן ומארח לקוליטיס המדבק העכברי.

תקציר

פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לייצר מודל חזק של מחלה מדבקת וקוליטיס, כמו גם את השיטות כדי לאפיין Citrobacter זיהום rodentium בעכברים. ג rodentium הוא הפתוגן גרם שלילי, עכברי ספציפי חיידקים הקשור באופן הדוק לחשיבות קלינית האנושי פתוגנים enteropathogenic E. coli וenterohemorrhagic E. coli. עם ההידבקות בג עכברי rodentium, immunocompetent סובלים מירידה במשקל צנוע וחולפת ושלשולים. ביסטולוגיה, התארכות מעי קריפטה, חדירה לתא חיסוני, ודלדול תא גביע הם נצפו. חיסול של זיהום מושג לאחר 3 עד 4 שבועות. מדידה של יושרת מעי אפיתל מכשול, עומס חיידקים, וניזק היסטולוגית בנקודתי זמן שונים לאחר הדבקה, מאפשרת אפיון של זני עכברים רגישים לזיהום.

מנגנון הארסיותזה שבו חיידקים פתוגנים ליישב את המעי של מארחיהם, כמו גם תגובות מארחות ספציפיות המגנות מפני זיהומים כאלה הם הבינו היטב. לכן ג מודל rodentium של זיהום חיידקי enteric משמש ככלי חשוב כדי לסייע בהבנה של תהליכים אלה שלנו. חיידקי enteric נקשר גם למחל מעי דלקתיות (IBDs). זה כבר שער שהתגובה הדלקתית הכרונית הסתגלותי ראתה בחולי IBD לפתח אצל אנשים רגישים גנטיים לאחר חשיפה לא תקינה של מערכת החיסון ברירית המעי לחיידקי enteric. לכן, המחקר של מודלים של קוליטיס המדבק מציע פוטנציאל משמעותי להגדרת פוטנציאל תגובות מארחות פתוגניים לחיידקי enteric. ג rodentium המושרית קוליטיס היא דגם נדיר אחד כזה שמאפשר ניתוח של תגובות מארחות לחיידקי enteric, קידום ההבנה של מנגנונים אפשריים של IBD פתוגנזה שלנו;חיוני בפיתוח טיפולים מונעים וטיפוליים חדשניים.

מבוא

זיהום על ידי חיידקים פתוגנים enteric מעורר דלקת במערכת עיכול (GI), כמו גם פתולוגיה במעיים ופתופיזיולוגיה, כולל שלשולים ובעיות בתפקוד מחסום אפיתל במעי. המנגנונים הארסיים שבו חיידקים פתוגנים ליישב במערכת העיכול של מארחיהם, כמו גם תגובות מארחות ספציפיות המגנות מפני זיהומים כאלה הם הבינו היטב, אך ההתקדמות האחרונה בדוגמנות של זיהומים חיידקיים enteric החלה לסייע להבנה של תהליכים אלה שלנו. חיידקי enteric נקשר גם למחל מעי דלקתיות (IBDs). המחלות של IBDs קרוהן (CD) והאוניברסיטה קליפורניה הן מחלות מורכבות של מסיבות לא ברור, המתאפיינות בדלקת מעיים כרוניות וניזק לרקמות. מודלי עכבר רבים של דלקת מעיים קיימים, מדלקת ספונטנית בזנים מהונדסים גנטי, כגון IL10 - / - עכברים, לאתגרים עם תרכובות כימיים, כגון נתרן גופרתי dextran (DSS) ודinitrobenzene חומצת sulfonic (DNBS) ^1. זה כבר שער שהתגובה הדלקתית הכרונית הסתגלותי בהווה בחולי IBD לפתח באנשים רגישים גנטי עם חשיפה לא תקינה של מערכת החיסון ברירית המעי לחיידקי enteric ^2, ולכן המחקר של מודלים של קוליטיס המדבק גם מציע פוטנציאל משמעותי להגדרת פוטנציאל מארח פתוגניים . תגובות לחיידקי enteric Citrobacter rodentium המושרה קוליטיס היא האחד הדגמים הנדירים של קוליטיס המדבק שכבר אפיינו ^1,3 היטב, ומאפשרים לניתוח של תגובות מארחות לחיידקי enteric והבנה נוספת של מנגנונים אפשריים של היווצרות מחלת מעי דלקתי; צעד חיוני בפיתוח טיפולים מונעים וטיפוליים חדשניים.

ג rodentium הוא מצרף גרם שלילי והשתפשפות (/ E) הפתוגן, עכברי ספציפי חיידקים הקשור באופן הדוק לאדם החשובפתוגנים enteropathogenic E. coli (EPEC) וenterohaemorrhagic E. coli (EHEC) ^3-8. משפחתו של פתוגנים / E אינטימית לצרף קרום התא המארח הקודקוד של האפיתל cecal ומעי גס, ויצרה מבנה לא פולשנית דום דמוי בתא הפונדקאי. אתגר אוראלי עם ג rodentium של 10 ⁸ -10 ⁹ אורגניזמים מייצר דגם חזק של קוליטיס המדבק מתאפיין היפרפלזיה או התארכות מעי של מאורות, חדירה לתא חיסוני mononuclear וירידה בכמות תאי גביע ^3,4. האתר הראשוני של קולוניזציה, כמה שעות אחרי אתגר, הוא בתיקון cecal, ואחרי התקדמות למעי גס דיסטלי 2 עד 3 ימים לאחר ההדבקה ^3. בזני עכברי immunocompetent, אישור של הפתוגן מושגת 3 עד 4 שבועות לאחר ההדבקה ^1,3,4. עם זאת, זנים רבים מהונדסים גנטי, כלומר גן לקוי או נוקאאוט (- / -) עכברים, נמצא להצגת increased רגישות לזיהום וכתוצאה מכך לניזק מוגזם ו / או דלקת ודלקת כרונית ^9-14. השימוש במודל זה קוליטיס המדבק בנוקאאוט הזנים האלה, חסרי חלבוני איתות מולדות רבות, היה הכרחי בחושפים כמה חלבונים מארחים אינטגרליים לרזולוציה של זיהום ודלקת מעיים.

פרוטוקול

1. הכנת Citrobacter rodentium הבידוד וGavage האוראלי של עכברים

1. הכן וחיטוי לוריא Bertani מרק (LB).
2. השג ג קיימא rodentium ממניות גליצרול קפוא ופס על הצלחת אגר LB באמצעות לולאת סטרילי inoculating או קצה פיפטה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לחסן 3 מ"ל של מרק LB סטרילי בצינור תרבות בז עם מושבות מצלחת LB באמצעות לולאה או inoculating קצה פיפטה. הכנת הבידוד צריך להיעשות תוך שימוש בטכניקות אספטיים.
3. דגירת ג תרבות rodentium אירובי על 37 מעלות צלזיוס בלילה בbenchtop דגירה ייקר ב 200 סל"ד. מרק LB המחוסן אמור להופיע לאחר מעונן תרבות הלילה.
4. השתמש בנורה הטתה מחט gavage קיבה מחוברת למזרק 1 מ"ל לgavage כל עכבר עם 100 μl של ג הלילה תרבות rodentium. בעדינות את עורף העכבר, תוך כדי אחיזה בעור הרפוי בחוזקה את הצוואר ובגבועם אגודל ואצבעות. משוך את ראשו של בעל החיים עם האצבע שלך כדי לשתק את הראש וליישר את הוושט להחדרה של מחט gavage.
5. שמור על העכבר בתנוחה זקופה ולכוון את קצה הנורה של מחט gavage בצד של הפה שלו ועל לשונו. בעדינות להעביר את המחט לאורך הגג של הפה ולקדם אותו לוושט. אם קיימת התנגדות הרגישה במהלך הליך זה, להסיר את מחט gavage מחדש להכניס אותו.
6. לאט לאט להזריק 100 μl של בידוד החיידקים ועדינות להסיר את מחט gavage. לפקח על קצב נשימה ובהתנהגות של העכבר לאחר החזרתו לכלוב שלו.

הערות:

• בשלבי 2 ו 3, גם להכין צינור תרבות בז באמצעות טכניקות אספטיים עם 3 מ"ל של מרק LB סטרילי כדי להיות מתורבת לילה כדי לוודא שאין זיהום חיידקים של המרק עצמו. מרק LB צריך להופיע ברור לאחר תרבות הלילה.
• עדינות להתסיס את התרבות בתוך צינור הבז לפני טעינת מזרקים לgavage כך שמינון שווה של חיידקים מועבר לכל עכבר, בשלב 4.
• תרבות לינה אמורה להיות מושלכת אם הוא כבר מחוסן במשך 24 שעות.
• הכל ג זיהומי rodentium ודיור של חיות נגועות צריכים להתבצע ברמת בטיחות ביולוגית מתקן 2.

2. מדידת חדירות המחסום אפיתל במעי ג עכברים נגועים rodentium

1. מדוד שלמות המחסום לאחר פגיעת נקודת זמן רצוי.
2. ביום של assay, להכין מספיק 4 isothiocyanate kDa fluorescein (FITC)-dextran מומסת בנאגר מלוח פוספט (PBS) לריכוז של 80 מ"ג למ"ל ^-1 gavage כל עכבר עם 150 μl ולהכין את עקומת הסטנדרט.
3. עורף העכבר וgavage עם 150 μl של FITC-dextran. למשוך אוכל מכלוב בשלב זה.
4. הרדם עכברים 4 שעות אחריgavaging ולאסוף כמה שיותר דם ככל האפשר (~ 450 μl) דרך לנקב לב. הוסף את הדם לריכוז סופי של 3% דקסטרוז החומצה ציטראט בצינור microcentrifuge להרתיע קרישה. להרדים את העכברים ולאסוף רקמות מעי גסות בPBS לספירת חיידקים (שלבים 3.1-3.5) ושל 10% בפורמלין לקיבוע רקמה וסופו של דבר צביעת immunofluorescence (שלבים 4.1-4.8).
5. לסובב את דגימות הדם ב1000 XG ל12 דקות בצנטריפוגה ב 4 ° C. לאסוף הסרום ולדלל ל 1/10 ו1 / 100 ב PBS. הוסף 100 μl של כל דגימה בשני הדילולים האלה לצלחת גם 96 במשכפל.
6. כדי להכין את עקומת הסטנדרט, לדלל המקורי 80 מ"ג המ"ל ^-1 FITC-dextran משמש לgavage העכברים בPBS לריכוזים הבאים: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, ו 0 מיקרוגרם / מ"ל . הוסף 100 μl של כל ריכוז לצלחת גם 96 בשלושה העתקים.
7. לכמת את הקרינה של כל דגימה באמצעות fluorometer בעירור wavelength של 485 ננומטר וגל פליטה 535 ננומטר.
8. לנתח את נתוני הגלם ידי התוויית עקומת הסטנדרט. את הנתונים הגולמיים לכל דגימה למשוואה של הקו שנוצר על ידי עקומת הסטנדרט כדי לקבוע את הריכוז של FITC-dextran בכל מדגם קלט.

הערות:

• מגיל 4 ואילך צעד, לשמור דגימות דם על קרח ולצמצם את החשיפה לאור.
• כאשר מודדים את שלמות המחסום אפיתל זמן נקודה, או לפני, 7 ימים לאחר הפגיעה הם אופטימליים, כניזק לרקמות חמור מתרחש לאחר נקודה זו. מדידת יושרת מכשול בטרם התרחשות ניזק חמורה מאפשרת לך לקבוע את ההבדלים בחדירות מקסימאליים במהלך ג זיהום rodentium בין הזנים של עכברים.
• ודא שעכברי בקרה נגועים גם נבדקים לשלמות מחסום האפיתל.

3. מדידה של עומס חיידקים ברקמות של ג עכברים נגועים rodentium

1. הוסף 1 המ"ל סטרילי PBSND מתכת חרוז לסיבוב autoclaved שפל צינור צנטריפוגה מ"ל 2 באמצעות טכניקת aseptic. רקמות בודדות שנאספו מכל חיה תהיינה ממוקמות בצינורות PBS נפרדות. לשקול את הצינורות לפני תוספת של הרקמה.
2. הסר את cecum ומעי הגס מהעכבר. הפרד cecum מהמעי הגס ודוחף החוצה את תוכן luminal באמצעות מלקחיים. הוסף את התוכן לצינור PBS. לאחר שנפרד 0.5 סנטימטר מסעיפים במעי הגס וcecum דיסטלי לקיבעון פורמלין 10%, חתך את המעי הגס וcecum נותר longitudinally ולשטוף עם PBS סטרילי לפני נחת צינורות ברקמות.
3. לשקול את צינורות PBS עם רקמה ולאחר מכן הומוגני את הדגימות באמצעות מקצף חרוז 6 דקות ליום 30 רץ.
4. באמצעות שימוש בטכניקות אספטיים, להוסיף 180 PBS סטרילי μl להיטב לצלחת גם 96. הוסף 20 μl של כל מדגם הומוגני לבאר הראשונה בכל שורה. מערבב היטב ולדלל סדרתי, והוסיף 20 μl מכל קודם גם להשיג דילולים מ -10 ^-1 (ראשוןLL) ל10 ^-6. 10 μl הצלחת של כל דילול מכל מדגם בשלושה עותקים בצלחת LB תחתית מרובעת עם רשת. דגירת הלילה בשעת 37 ° C.
5. ספירת יחידות מושבה להרכיב (CFU), אז ממוצע של 3 ספירות, ולהקליט את הדילול שבכל דגימה שנספרה. הכפל CFU הממוצע של 50, כמו 20 μl של מדגם המ"ל המקורי 1 היה בשימוש, ועל ידי גורם הדילול שבמדגם נספר כתוצאה CFU / מ"ל. לבסוף, לחלק לפי משקל הרקמה כדי לקבוע CFU / g.

4. הערכה היסטולוגית וכתמי immunofluorescence של רקמות נגועות קולון

1. איסוף רקמות כמו בשלב 3.2. רקמות חנות בלילה פורמלין, ולאחר מכן לשטוף עם אתנול 70%. שבץ רקמות בפרפין ולחתוך 5 חלקי מיקרומטר לכתמים. כתם עם hematoxylin & eosin להערכה היסטולוגית ולהמשיך לשלבים הבאים להכתמת immunofluorescence.
2. לdeparaffinize רקמות לפני הצביעה, מחליק במקוםצנצנת מכתימה Coplin ולשים באמבט מי 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בשלב בא, שקופיות מקום בקסילן במשך ארבע כביסות של 2 דקות כל אחד. שקופיות אז יש rehydrated עם שתי כביסות 5-דקות באתנול 100%, ואחרי 5 דקות לשטוף 1 בכל אחד מאלה: אתנול 95%, 75% אתנול ו DH ₂ 0. שטיפות אלו צריכות להיעשות במנדף להימנע מחשיפה לאדים מזיקים.
3. שקופיות מקום בצנצנת Coplin עם חיץ מראש התחמם נתרן ציטראט ולאחר מכן למקום ספינה למשך 30 דקות, אז תנו לו לשבת 30 דקות. תהליך זה מפרק את חלבון קישורי צלב עשוי קיבעון פורמלין אחזור אתרי antigenic פוטנציאליים.
4. לשטוף עם PBS יזיד למשך 5 דקות, שלוש פעמים. מגלשות יבשות ושטח סביב סימן רקמות עם עט PAP כדי ליצור מחסום הידרופובי, שמירה על ריאגנטים המכתים מותאמים ברקמות.
5. רקמה חסומה לשעה 1 בטמפרטורת חדר עם חיץ חסימה (למשל α תיש סרום) בתא לחות immunostaining.
6. דלל חסודנוגדן ארי לריכוז רצוי באמצעות חיץ דילול נוגדן. יוצק את חסימת חיץ ולהוסיף 50-100 μl של נוגדן ראשוני לרקמות. לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות.
7. לשטוף עם PBS יזיד למשך 5 דקות, שלוש פעמים. הוסף 50-100 μl של נוגדן משני דילול בחיץ דילול נוגדנים לרקמות ו הדגירה בטמפרטורת החדר למשך השעה 1 בחושך. לשטוף עם DH ₂ O למשך 5 דקות, שלוש פעמים.
8. מייבש שקופיות, להוסיף DAPI להאריך בינוני זהב הרכבה ולהחיל coverslip. צפו בשקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

הערות:

• PBS יזיד ניתן להחליף עם PBS המוכן טרי כאלטרנטיבה, כדי למנוע התפתחות חיידקים במדיום השטיפה מ4 ואילך צעד.

תוצאות

במהלך ניסוי זיהום רגיל, עכברים נגועים בכ -2.5 x 10 CFU ⁸ עד gavage של 100 ג לילה μl תרבות rodentium. זיהום של עכברי C57BL / 6 עם ג תוצאות rodentium בירידה במשקל צנוע וחולפת ושלשולים. אמנם נדיר עם C57BL / 6 עכברים, בעלי חיים עלולים להיות חולים ודורשים euthanization. לכן, עכברים צריכים להיות במעקב למידה של ירידה במשקל ותסמינים של מצוקה כגון פרוות piloerect ויציבה כפופה, כדי לקבוע את המידה שבה זנים שונים מושפעים מהזיהום.

דיון

זיהום rodentium Citrobacter מספק מודל יקר לחקר מחלות וקוליטיס בעכברים מדבקים. מודל ייחודי זה מאפשר אפיון של שתי התגובות המארחות, כמו גם את התכונות של חיידקים פתוגניים. השלבים מתוארים בפירוט בפרוטוקול זה שימוש המוצלח של דגם זה.

ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה כדי לזכור בעת גרימת קוליטיס ומנתח את התשובות. ראשית, ההכנה טרי ג לילה בידוד rodentium במרק LB נדרש לזיהום מוצלח של עכברים. כמ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב / חומרים	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
מרק לוריא	ABM	G247	הוסף 25 גר 'אבקת LB ל1L של מים. חיטוי לפני השימוש.
צלחת תחתונה מרובעת עם רשת	דיג	08-757-11A
צינור תרבות פלקון	Sarstedt	62.515.006
נורה הטתה מחט gavage קיבה	כלי מדע פיין	18060-20
מזרק 1 מ"ל	BD Biosciences	309659
4 kDa FITC-dextran	סיגמא	FD-4
חומצת לימון	סיגמא	C7129
ציטרט הנתרן	דיג	S279-500
דקסטרוז	דיג	D16.1
חומצת ציטראט דקסטרוז			20 חומצת mM ctiric, ציטרט הנתרן mM 110, 5 המ"מ דקסטרוז
לוח שחור 96-היטב	דיג	07-200-762
חרוזי מתכת (5 מ"מ)	Qiagen	69989
10% פורמלין	דיג	5F93-4
5 מיליליטר בקבוקון	DiaMed	STK3205
Hematoxylin	דיג	H345-23
Eosin	דיג	E511-100
קסילן	דיג
20 Tween	סיגמא	P5927
צנצנת מכתימה Coplin	VWR	47751-792
חיץ ציטרט הנתרן			10 ציטרט הנתרן מ"מ, 0.05% Tween 20, pH 6.0
עט פאפ	Cedarlane	Mu22
סרום עיזים	סיגמא	G902-3
שור אלבומין (BSA)	דיג	BP1600-100
טריטון X-100	סיגמא	T8532
יזיד הנתרן	סיגמא	SZ002
חסימת חיץ			2% סרום עיזים, 1% BSA, 0.1% Triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% נתרןתזיד, 0.01 M PBS, 7.2 pH, לערבב וחנות ב 4 ° C.
חיץ דילול נוגדן			0.1% Triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% יזיד הנתרן, 0.04% EDTA
חיץ דילול חיץ ונוגדן לחסימת טיר			מתכונים כנ"ל, אך ללא תוספת של חומרי ניקוי (טריטון X-100 ו 20 tween)
להאריך מגיב Antifade זהב עם DAPI	Invitrogen	P-36931
Coverslips	דיג	12.54SE
Benchtop דגירה ייקר	Barnstead מעבדת קו	מקס Q4000
Fluorometer	פרקין אלמר	Victor2D
צנטריפוגה בקירור	Beckman Coulter	Microfuge 22R
אוניית קיטור	בלק אנד דקר
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	Zeiss	Axio Image.Z1