בפרוטוקול זה מוצג הייצור, ההתקנה והתפעול הבסיסי של ביו-ריאקטור פיקוליטר מיקרופלואידי (PLBR) לניתוח תאים בודדים של מיקרואורגניזמים פרוקריוטיים. מיקרואורגניזמים רלוונטיים מבחינה תעשייתית נותחו כהוכחה עקרונית המאפשרת תובנות לגבי קצב גדילה, מורפולוגיה והטרוגניות פנוטיפית על פני תקופות זמן מסוימות, בקושי אפשרי בשיטות קונבנציונליות.
מאמר שיטה
ביו-ריאקטור מיקרו-נוזלי פיקוליטר לניתוח מיקרוביאלי של תאים בודדים: ייצור, הגדרת מערכת ותפעול
במאמר זה
סיכום
תקציר
בפרוטוקול זה מתוארים בפירוט הייצור, ההתקנה הניסויית והתפעול הבסיסי של הביוריאקטור המיקרופלואידי. ניתן להשתמש ב-PLBR לניתוח חיידקים בודדים ומיקרו-מושבות כדי לחקור שאלות הקשורות לביוטכנולוגיה ומיקרוביולוגית הנוגעות, למשל, צמיחת תאים, מורפולוגיה, תגובת מתח וייצור מטבוליט או חלבון ברמת תא בודד. המכשיר כולל זרימת מדיה רציפה המאפשרת תנאים סביבתיים קבועים למחקרי הפרעות, אך בנוסף מאפשר החלפת מדיום מהירה כמו גם תנאים מתנודדים כדי לחקות כל מצב סביבתי רצוי. כדי לייצר את המכשירים החד-פעמיים, פרוסת סיליקון המכילה מבני SU-8 בגודל תת-מיקרומטר שימשה כתבנית השכפול ליציקת פולידימתילסילוקסן מהירה. השבבים נחתכו, הורכבו, חוברו והוצבו על מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה ואוטומטי לחלוטין המתאים להדמיית זמן-lapse, כלי רב עוצמה לניתוח תאים מרחביים-זמניים. כאן, אורגניזם הפלטפורמה הביוטכנולוגית Corynebacterium glutamicum נזרע לתוך ה-PLBR ומעקב אחר צמיחת תאים והפלואורסצנציה התוך-תאית נמשכו מספר שעות תוך פענוח הטרוגניות של אוכלוסייה תלוית זמן ברמת תא בודד, דבר שאינו אפשרי בשיטות ניתוח קונבנציונליות כגון ציטומטריית זרימה. מלבד תובנות לגבי ייצור מכשירים, יתר על כן, מודגמת הכנת קדם-תרבית, העמסה, לכידת חיידקים וגידול PLBR של תאים בודדים ומושבות. מכשירים אלה יוסיפו ממד חדש במחקר המיקרוביולוגי לניתוח תופעות תלויות זמן של חיידקים בודדים תחת בקרה סביבתית הדוקה. בשל תהליך הייצור הפשוט והקצר יחסית, ניתן להתאים את הטכנולוגיה בקלות בכל מעבדת מיקרופלואידיקה ופשוט להתאים אותה לצרכים ספציפיים.
מבוא
מיקרוסקופ זמן-lapse הוא כלי רב עוצמה לחקר תאים חיים in vivo1. בינתיים, פלטפורמות מיקרוסקופיה אוטומטיות לחלוטין הזמינות מסחרית, כולל פיצוי סחף מיקוד המושרה תרמית, מיושמות בדרך כלל במחקר ביולוגי לחקר תופעות תלויות זמן, החל ממחקר סרטן ותאי נוירונים על פני הנדסת רקמות ומחקרים דינמיים עם שמרים בודדים או תאי חיידקים2-6.
בדרך כלל לוחות באר שקופים, רפידות אגר או פשוט שקופיות מיקרוסקופיה מיושמות כדי לספק סביבות תרבית תאים במהלך הדמיית זמן-lapse7. למרות שהן מתאימות למחקר מסוים, למערכות פשוטות אלה יש שליטה מוגבלת מאוד על תנאי הסביבה ואינן מאפשרות הפרעות מורכבות יותר או שינויי מדיום מוגדרים ומהירים. מכשירי שבב מיקרופלואידיים חד פעמיים המיוצרים בייצור המוני הוצגו לשוק לאחרונה אך מותאמים בעיקר לסוגי תאים אוקריוטיים גדולים יותר4. למרות שניתן לעקוב אחר צמיחה, חקירות גדילה מוגדרות היטב הנוגעות, למשל, לכידת תאים מדויקת, גודל המושבה, כיוון הצמיחה והיכולת להסרת תאים מוגבלות. לבתי גידול וכורים מיקרופלואידיים, שבהם תאי חיידקים מגודלים בסביבות תלת מימדיות פותחו8-10, יש חסרונות כאשר עוסקים במחקרים כמותיים ברמת התא הבודד. בעוד שניתן לנתח את ההטרוגניות הכוללת של האוכלוסייה, לא ניתן לקבוע במדויק פרמטרים רבים של תאים ברזולוציה של תא בודד מכיוון שהצמיחה אינה מוגבלת לחד-שכבות.
מגבלה זו גרמה לפיתוח מיקרו-מערכות המאפשרות גידול תאים בתעלות ובבתי גידול מוגדרים היטב עם תאים הגדלים בחד-שכבות שטוחות עם רזולוציית תא בודד ובקרה הדוקה במיוחד על אספקת המדיה ותנאי הסביבה6,11,12. דוגמאות מעטות למערכות מיקרופלואידיות לגידול תאי חיידקים הודגמו12-14. חיידקים בדרך כלל מציגים קצב צמיחה מהיר מאוד ודורשים מבנים מיקרופלואידיים בטווח של כמה מיקרומטרים ומטה, במיוחד כאשר רצויים חד-שכבות של תאים למיקרוסקופיה. Keymer et al. הדגים צמיחה והתפשטות של זני E. coli בנופים מיקרו-מפוברקים15,16. מכיוון שהם התעניינו בדינמיקה של אוכלוסייה הם לא חקרו ברזולוציה של תא בודד.
פיתחנו את הביו-ריאקטור פיקוליטר (PLBR)13, המיושם כיום כדי לחקור מדדי ביצועים ביוטכנולוגיים שונים כגון צמיחה17 וניתוח פרודוקטיביות פלואורסצנטי ברמת תא בודד18,19. המכשיר המיקרופלואידי הנוכחי מאפשר בקרת כור סביבתי בנפח תרבית מוגדר של כפיקליטר אחד ותצפית רציפה של תא בודד בו זמנית. בהשוואה למערכות קופסאות חד-שכבתיות פתוחות11,14, שבהן צד אחד או שניים פתוחים לערוץ אספקת המדיה, ה-PLBR מאפשר לכידה ותרבות מבוקרות. התכנון מאפשר גידול ארוך טווח של חיידקים ללא סיכון של מספר מושבות סמוכות ליצור אוכלוסייה אחת גדולה. יתר על כן, המערכת משלבת אזורי גידול בגובה 1 מיקרומטר (לפי סדר קוטר התא) כדי להגביל את צמיחת החיידקים לחד-שכבות תאים. לעומת זאת, תעלות האספקה עמוקות פי 10 כדי למזער את ההתנגדות ההידראולית.
בהשוואה למערכות גידול אצווה ממוזערות20 המערכת הנוכחית מאפשרת גידול עם פרמטרים סביבתיים קבועים עקב זרימת מדיה רציפה. יתר על כן, ניתן לשלוט בקלות בפרמטרים סביבתיים כגון הרכב בינוני, טמפרטורה, קצב זרימה וחילופי גז תוך שניות. זה מאפשר חקירות ספציפיות של תגובה תאית לשינויים סביבתיים הנוגעים למשל לזמינות חומרים מזינים או גירוי לחץ. הדרישה לנפחי מדיה מופחתים, כלומר בטווח של כמה מיקרוליטרים בלבד, מאפשרת לחוקרים לבצע מחקרים חדשים, למשל הפרעה של תאים במהלך הדמיית זמן-lapse עם סופרנטנט של ניסויים בקנה מידה גדול החושפים את תגובת התא בתנאים סביבתיים ספציפיים אלה17. הביוריאקטור של פיקוליטר מספק לחוקרים מערכת חזקה השולטת באופן הדוק בתנאים הביופיזיים ומופעלת באמצעות משאבות מזרקים ברמת דיוק גבוהה ומיקרוסקופיה אוטומטית של שדה בהיר ופלואורסצנטי להדמיית זמן-lapse. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול שלם הכולל תכנון מכשירים, ייצור ויישומים לדוגמה.
פרוטוקול
1. ייצור פרוסות
- תכנן את ההתקן המיקרו-נוזלי המכיל כניסות, יציאות, תעלות ראשיות ו-PLBRs (איור 1A) באמצעות תוכנת CAD.
- התכן המוצג בפרוטוקול זה (איור 2) מורכב משני פתחי זריעה, מחולל שיפוע עבור ערבוב של שני מצעים שונים, יציאה אחת ושישה מערכים של PLBRs. כל מערך מכיל 5 PLBRs, וכתוצאה מכך 30 PLBRs מקבילים בתוך מכשיר מיקרופלואידי אחד.
- צור מסיכת פוטו ליתוגרפיה המכילה את פריסות השבבים הרצויות (איור 1B). מסכת הצילום הופקה בתוך הבית על ידי כתיבת קרן אלקטרונים ברזולוציה תת-מיקרונית. המסכה ששימשה הייתה מורכבת משכבת כרום על צלחת זכוכית 5ב-2.
הערה: בצע את כל השלבים הבאים בתנאי חדר נקי Class 100 ומעלה (תרשים זרימה של תהליך מוצג באיורים 3A ו-3B). - נקו פרוסת סיליקון בגודל 4 אינץ' עם פיראנה (יחס של 10:1 של חומצה גופרתית ומי חמצן) וחומצה הידרופלואורית למשך מספר דקות (זהירות: כימיקלים מסוכנים). יש לשטוף במים נטולי יונים (DI) למשך כ-10 שניות.
- יש לייבש את הוופל למשך 20 דקות בטמפרטורה של 200 מעלות צלזיוס.
- ציפוי סיבוב 1 מיקרומטר SU-8 2000.5 עמידות לאור על הפרוסה (שכבה ראשונה) (התנגדות של 4 מ"ל, סיבוב 10 שניות עם, v = 500 סל"ד, ו-a = 100 סל"ד/שנייה, סיבוב 30 שניות עם v = 1,000 סל"ד ו-a = 300 סל"ד/שנייה).
- הנח את הוופל המצופה על פלטה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס כדי לסלק עודפי ממס (1.5 דקות ב-65 מעלות צלזיוס, 1.5 דקות ב-95 מעלות צלזיוס ודקה אחת ב-65 מעלות צלזיוס; באופן אידיאלי השתמש בשתי פלטות חימום).
- הכנס מסיכת פוטו שכבה 1 (כאן אזורי הלכידה של כורי הפיקוליטר) ופרוסות בתוך מיישר המסכה וחשוף את הוופל ל-350-400 ננומטר (מגע ואקום, 64 mJ/cm², t = 3 שניות, I = 7 mW/cm²).
- בצע אפייה לאחר חשיפה על פלטה חמה ב-95 מעלות צלזיוס כדי להתחיל את הפילמור של SU-8 (דקה אחת ב-65 מעלות צלזיוס, דקה אחת ב-95 מעלות צלזיוס ודקה אחת ב-65 מעלות צלזיוס). הערה: לאחר שלב זה ניתן לראות את המבנים בשכבת SU-8.
- הנח את הוופל באמבט מפתח SU-8 למשך דקה אחת והעביר את הוופל למיכל שני עם מפתח SU-8 טרי למשך מספר שניות.
- שטפו את הוופל באיזופרופנול כדי להסיר מפתח SU-8 ופרוסה יבשה באמצעות זרימת חנקן של סביבון פרוסות.
- אופים קשה את הוופל במשך 10 דקות בחום של 150 מעלות צלזיוס.
- מעיל סיבוב 9 מיקרומטר SU-8 2010 פוטורזיסט על הפרוסה (שכבה שנייה) (להוציא התנגדות של 4 מ"ל, לסובב 10 שניות עם v = 500 סל"ד, a = 100 סל"ד לשנייה, ולסובב 30 שניות עם v = 4,000 סל"ד, a = 300 סל"ד לשנייה).
- הנח את הוופל עם SU-8 על פלטה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס כדי לסלק עודפי ממס (15 דקות ב-65 מעלות צלזיוס, 45-60 דקות ב-95 מעלות צלזיוס ו-10 דקות ב-65 מעלות צלזיוס). הערה: יש לשים לב לקמטים ולבועות. אם הפרוסה מחוממת למהירות של 95 מעלות צלזיוס, ממס מאודה עשוי להיות עטוף בבועות גז זעירות.
- הכנס את מסכת הצילום עם הפריסה הרצויה (כאן הערוצים העיקריים לאספקת חומרים מזינים) ואת הוופל לתוך יישור המסכה וחשוף ל-350-400 ננומטר (מגע קשה, 64 mJ/cm², t = 10 שניות, I = 7 mW/cm²)
- בצע אפייה לאחר חשיפה על פלטה חמה ב-95 מעלות צלזיוס כדי לסיים את הפילמור של SU-8 (5 דקות ב-65 מעלות צלזיוס, 3:30 דקות ב-95 מעלות צלזיוס, 3 דקות ב-65 מעלות צלזיוס). הערה: לאחר שלב זה ניתן לראות את המבנים בשכבת SU-8.
- הנח את הוופל באמבט מפתח SU-8 למשך 45 שניות, העביר את הוופל למיכל שני עם מפתח SU-8 טרי ופתח למשך 60 שניות.
- שטפו את הוופל 20 שניות עם איזופרופנול כדי להסיר שאריות מפתח SU-8 ופרוסות יבשות באמצעות חנקן בלחץ.
- לבסוף אופים קשה את הוופל בחום של 150 מעלות צלזיוס. כתוצאה מכך מתקבלת הפרוסה הסופית (איור 1C), שתשמש כתבנית מאסטר ליציקת PDMS.
- בצע מדידות פרופילומטר (איור 3C) כדי לאמת את גבהי המבנה של SU-8. הערה: אי דיוקים בגובה המבנה עלולים לגרום ללכידת תאים לא יעילה או לאובדן תאים במהלך הגידול.
2. ייצור שבב פולידימתילסילוקסן
הערה: כל השלבים הבאים צריכים להתבצע באופן אידיאלי בתנאי זרימה למינרית כדי למנוע חלקיקי אבק להפריע להליך הייצור (תרשים זרימה של תהליך מוצג באיור 4).
- הכן תערובת של בסיס פולידימתילסילוקסן (PDMS) וחומר ריפוי ביחס של 10:1. מערבבים בזהירות עד לקבלת תמיסה הומוגנית שנראית אטומה. הכן ככל הנדרש לגובה השכבה הרצוי (כאן 3 מ"מ).
- הסר את תערובת ה-PDMS למשך כ-30 דקות בוואקום קל עד שכל הבועות נעלמו.
- הכן מכשיר דפוס (או צלחת פטרי) עם פרוסת SU-8 מתאימה ושפך לתוכו את תערובת ה-PDMS (איור 1D).
- אופים את ה-PDMS במשך 3 שעות בחום של 80 מעלות בתנור.
- מקלפים בזהירות את לוח ה- PDMS מהרקיק. חותכים את הלוח לשבבים בודדים בעזרת אזמל נקי וחד.
- שטפו את הצ'יפס באמבט n-pentane למשך 90 דקות, ולאחר מכן שתי אמבטיות שטיפת אצטון (90 דקות כל אחת). יבש את הצ'יפס למשך הלילה כדי להסיר שאריות ממס. זהירות: בצע את שטיפת ה-PDMS מתחת למכסה אדים. הערה: במהלך שטיפת ה-n-pentane, מונומרים ודימרים מוסרים מה-PDMS הנרפא וגודל השבב עשוי להכפיל את עצמו באופן זמני במהלך הליך הכביסה.
- אחסן את שבבי ה-PDMS המיקרופלואידיים במיכלים סגורים עד לניסוי הסופי.
- רגע לפני הניסוי, נקב את חורי הכניסה והיציאה לתוך שבב ה-PDMS באמצעות מחט (או מחורר) בקוטר מעט קטן יותר מהמחברים המשמשים לחיבור צינורות עם שבב PDMS.
- נקה את שבב ה-PDMS המיקרופלואידי בזהירות עם איזופרופנול והשתמש בסקוטש כדי להסיר חלקיקי אבק שעלולים להידבק בצד ה-PDMS המובנה. השתמש בסקוטש מספר פעמים עד שלא ניתן לראות חלקיק על השבב.
- נקה שקופית זכוכית דקה של 170 מיקרומטר עם אצטון ואיזופרופנול ברצף. לבסוף יש לנקות במים נטולי יונים ולייבש עם חנקן בלחץ.
- לפני הפעלת הפלזמה, יש לחמם את מנקה הפלזמה ולהפעיל את הפלזמה למשך כ-300 שניות.
- יישר את ה-PDMS ושבב הזכוכית לפני ההדבקה. לבסוף, הניחו את שבב ה-PDMS בזהירות על שקופית הזכוכית (איור 1E). PDMS וזכוכית יתחברו תוך שניות. הערה: אין לדחוף עם פינצטה על החלק העליון של שבב ה-PDMS במהלך תהליך ההדבקה. זה עלול להוביל למה שנקרא קריסת גגות של התעלות והמבנים הקטנים.
- על מנת לחזק את הקשר, אופים את שבב הזכוכית הסופי PDMS למשך 10 שניות בחום של 80 מעלות צלזיוס.
3. הכנת תרבית החיידקים
הערה: יש להכין את כל הגידולים במדיום מסונן סטרילי כדי למנוע הצטברות של חלקיקים לא רצויים, העלולים להפריע במהלך הגידול.
- השתמש בצלחת אגר המכילה את האורגניזמים הרצויים (כאן, C. glutamicum ATCC 13032) וחסן מושבה אחת ל-20 מ"ל של מדיום BHI טרי, דגירה למשך הלילה (≈ 8-14 שעות) בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס על שייקר סיבובי (120 סל"ד).
- העבירו 10 מיקרוליטר מהתרבית המוקדמת למדיום הרצוי (כאן CGXII21) שישמש במהלך גידול מיקרופלואידי, ותנו לתא לגדול בן לילה ב-30 מעלות צלזיוס על שייקר סיבובי (120 סל"ד).
- העבירו את הכמות הרצויה של תרחיף התאים (בין 10-500 מיקרוליטר, תלוי בתחילת הניסוי) למדיום הרצוי (כאן CGXII21) שישמש במהלך גידול תאים מיקרופלואידיים. הערה: הטוב ביותר הוא להשתמש בתאים מהשלב הלוגריתמי המוקדם לזריעה. עבור תרבית C. glutamicum הצפיפות האופטית הטובה ביותר (OD600) לזריעה הייתה בין 0.5-2.
- מעבירים 1 מ"ל מתרבית החיידקים לצינור סטרילי של 2 מ"ל. הערה: יש לעשות זאת מיד לאחר הרכבת שבב ה-PDMS המיקרופלואידי, כדי למזער את זמן ההעברה בין בקבוק הניעור לגידול מיקרופלואידי. בדרך כלל זמן ההעברה הוא בסביבות 15 דקות ויש לשמור אותו קטן ככל האפשר כדי למנוע השפעה על חילוף החומרים הנגרמת על ידי הגבלת חמצן ושינויי טמפרטורה.
4. הגדרת ניסוי
הערה: כל השלבים מבוצעים באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
- הפעל את חממת המיקרוסקופ שעתיים לפני הניסוי כדי לחמם את המערכת. הערה: המיקרוסקופיה צריכה להיות מצוידת בחממה בגודל מלא כדי לשלוט בטמפרטורה ובמידת הצורך בזרימת הגז. אין צורך בבקרת לחות נוספת מכיוון שמערכת השבבים מוחדרת ברציפות במדיה.
- פתח את מערכת החממה, בחר את המטרה הרצויה ובמידת הצורך הוסף שמן טבילה על המטרה.
- התקן את השבב בתוך מחזיק השבב. במידת הצורך, תקן את לוחית הזכוכית עם סרט דבק על מנת למנוע שבב כלשהו במהלך פעולת השלב.
- מרכז את הדגימה על המיקרוסקופ והתמקד במערכי PLBR.
- חבר כניסות ויציאות עם צינורות מתאימים (איור 1F). חבר צינורות למאגר פסולת. ניתן לראות שבב מייצג באיור 4D.
- הכנס מזרקים למשאבות והתחל את זרימת המדיה. השתמש בתמיסת ציפוי בינונית, חיץ או במידת הצורך ושטוף את התעלות המיקרופלואידיות למשך כשעה אחת. הערה: תמיסת ציפוי משמשת לציפוי דפנות התעלה כדי למנוע הידבקות תאים לא ספציפית.
- עבור E. coli, תמיסה של 0.1% של BSA משמשת לציפוי דפנות התעלה. עבור C. glutamicum אין צורך בציפוי. לאחר הליך הציפוי יש לשטוף את השבב בזריעת תאים בינונית קודמת.
- לפני זריעה וטיפוח תאים, בדקו כי לא מתרחשת דליפה וכי הטמפרטורה קבועה.
5. זריעת תאי חיידקים לתוך המכשיר המיקרופלואידי.
- ודא שתמיסות החיידקים הרצויות זמינות במזרקים מתאימים המחוברים לצינורות.
- נתק את המאגר או תמיסת הציפוי וחבר את מתלה התא לשבב. כדי למזער את נפח המוות, בועות אוויר לא רצויות וכדי להפחית את זמן הניסוי, החלף את המחט השלמה כמו גם את הצינורות, ולא רק את המזרקים.
- להחדיר את תרחיף התאים לתעלות בקצב זרימה נפחי של 200 נ"ל/דקה עד שרוב ה-PLBRs מתמלאים בכמות התאים הרצויה (איור 5A). הערה: תוצאות הזריעה האופטימליות תלויות בזן החיידקים, OD600 ובמדיום הגידול של התרבית המוקדמת. יש להתאים את הפרמטרים הללו כדי להגדיל את יעילות הלכידה והזמן עד שמספר מספיק של תאים נלכדים במבני הכור. עבור C. glutamicum, בדרך כלל נעשה שימוש בתרחיף תאים של OD600 0.5-2; עבור E. coli ה-OD600 היה בין 0.5-1.
- אם רק מספר קטן של PLBRs מתמלאים, הגדל את קצב הזרימה ל-800-1,200 nl/min.
- נתק את מתלה התא וחבר את מצע הגידול לשבב (איור 5B). ודא שלא תוכנס בועת אוויר במהלך השינוי הבינוני. חלחל עם מצע גידול טרי ב 100 nl / min.
6. הדמיית זמן-lapse
- בחר PLBRs ספציפיים להדמיית זמן-lapse. בדרך כלל נבחרים PLBRs המכילים תא אם יחיד בתחילת הניסוי. מספר אזורי העניין שניתן לחקור בניסוי אחד תלוי בקצב הפריימים הרצוי ובהגדרה המיקרוסקופית.
- בחר קצב פריימים מתאים בהתאם למספר ה-PLBRs. ודא שהמיקרוסקופ יכול להתמודד עם כמות ההחזר הרצויה על ההשקעה במרווח הזמן לשגות הזמן.
- בחר ערכות מסננים מתאימות (כאן YFP). סגור אוטומטית את התריס במהלך תנועת הבמה ולאחר כל מדידת זמן-lapse כדי למנוע הלבנת כרומופור.
- הגדר את רצף המיקרוסקופיה של זמן-lapse והתחל את הניסוי.
- לאחר שכל ה-PLBRs גדלים יתר על המידה, ניתן לעצור את הניסוי, להשליך את שבב ה-PDMS המיקרופלואידי ולהעריך את הניסוי.
7. ניתוח
הערה: ניתן לבצע את השלבים או החלקים הבאים של ההליך באופן ידני או על ידי תוכניות ניתוח תמונות כגון ImageJ וכו'.
- קבע PLBRs מעניינים שבהם הגידול עונה על כל הקריטריונים הרצויים, למשל מספר תאי האם, מיקום תאי האם וכו'.
- כדי לקבוע את קצב הצמיחה של מיקרו-מושבה אחת, ספרו את מספר התאים בכל מסגרת זמן.
- חשב את קצב הצמיחה המרבי על ידי התוויית זמן לעומת ln (מספר תא). שיפוע החלקה מייצג את קצב הצמיחה ב-[1/שעה] (ראה איור 6).
- ניתוח נתוני פלואורסצנטיות תלוי מאוד בניסוי שבוצע. בדוח זה נבחרה דוגמה להמחשת הטרוגניות בין מושבה למושבה ותא לתא בין מיקרו-מושבות איזוגניות שונות (ראה איור 7).
תוצאות
ייצור המכשיר
מערכת ה-PLBR המיקרופלואידית מיוצרת על ידי שכבה אחת של PDMS המודבקת לשבב זכוכית דק המתאים למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. הייצור מורכב משני שלבים עיקריים: ראשית, ייצור תבנית השחזור (איורים 1A, 1B, ו-1C) ושנית, ייצור השבב (איורים 1D, 1E, ו-1נ"ש). בהתאם לפרוטוקול, נעשה שימוש בטכניקות סטנדרטיות של מיקרו-ייצור פוטוליתוגרפי כדי ליצור את תבנית המאסטר. מעבדות שאינן מחזיקות במתקן חדר נקי יכולות לרכוש תבניות מאסטר מותאמות אישית של SU-8 הזמינות מסחרית. באמצעות יציקה חוזרת של PDMS (איורים 1A, 1B, ו-1Cניתן לייצר מאות שבבים חד-פעמיים. ניתן לבצע את יצירת התבנית ב-PDMS ואת הרכבת השבב בכל מעבדה, ואין צורך במתקני חדר נקי, עם זאת, עמדות עבודה בעלות זרימת אוויר למינרית הן מועדפות.
התהליך מתחיל בתכנון של מערכת השבב המיקרופלואידי. בדרך כלל נעזרים בתוכנת CAD לתכנון השבב המיקרופלואידי (איור 1A). לאחר תכנון ה-CAD, מיוצרת מסכה באמצעות כותב אלקטרוני (e—beam writer) (איור 1B) בעלת רזולוציה סוב-מיקרונית. במחקר הנוכחי נוצרה מסכת כרום בעובי 5 in, אשר שימשה לליתוגרפיה של פרוסות SU-8. פרוסות הסיליקון-SU-8 הסופיות משמשות ליצירת תבניות PDMS (איור 1D). לאחר שלב אפייה, לוח ה-PDMS נחתך לשבבים המחוברים באופן בלתי הפיך למשבט זכוכית (איור 1E). לבסוף, מחוברת מערכת הצינורות (איור 1F).
איור 2 מציג את תכנון המערכת המיקרופלואידית בפירוט. היא מורכבת משני פתחי כניסה לזריעה, מחולל גרדיאנט לערבוב של תת-מצעים או מצעים שונים ופתח יציאה אחד. לתעלות הראשיות מימדים של 50 µm x 10 µm (רוחב x גובה). כל התקן מורכב משישה מערכים של PLBRs, המכילים 5 PLBRs כל אחד. הדבר מביא ל-30 ריאקטורים מקביליים בתוך התקן מיקרופלואידי אחד.
איור 3 ממחיש את ייצור תבנית השכפול. כפי שמתואר בפירוט בפרוטוקול, שכבת SU-8 ראשונה מיוצרת באמצעות ליתוגרפיית SU-8 (איור 3A). הליך דומה מיושם עבור השכבה השנייה (איור 3B). כדי לבדוק את גיאומטריית התעלות, חקרנו את גובה ה-PLBRs והתעלות הראשיות באמצעות פרופילומטר. בדוגמה המוצגת באיור 3C, נמדדה השכבה הראשונה (שכבת הגידול). כאן השכבה מראה גובה עקבי של 1,200 nm, המתאים לגידול של C. glutamicum במצע BHI.
איור 4 ממחיש את הליך היציקה של ה-PDMS, המתחיל בעירבוב ה-PDMS (איור 4A), לאחר מכן תהליך היציקה (איור 4B>) ולבסוף שלב ההדבקה (איור 4C>). איור 4D מציג את השבב המיקרופלואידי הסופי הכולל את לוחית הזכוכית בעובי 170 µm, שבב PDMS (גובה 3 mm) עם פתחי כניסה ויציאה ומחטים מפלדה המחוברות לצינוריות. לאחר הניסוי ניתן להשליך את השבב ואין צורך בניקוי נרחב. יתרה מכך, הוא קל להרכבה ולטיפול. אין צורך בהליך מילוי מורכב וקשה.
עקרון המכשיר
איור 5 מציג את עיקרון הפעולה של מערכת הריאקטור. תאים מוזרקים אל תוך ההתקן המיקרופלואידי, ותאים בודדים נלכדים בתוך ה-PLBR פשוט על ידי אינטראקציות של דופן התא. בשל ההבדל בהתנגדות ההידרודינמית של התעלה וה-PLBR, זרימה מינימלית בלבד מתרחשת בתוך ה-PLBR. לאחר זריעת ה-PLBR (איור 5A), שלב הצמיחה והתצפית מתחיל עם מעבר מתמיסת חיידקים למצע גידול (איור 5B). לאחר שה-PLBRs גדלים יתר על המידה (איור 5C), הניסוי מופסק בדרך כלל וניתן לנתח את תמונות ה-time-lapse. לפרטים נוספים על מנגנוני הלכידה ופרופיל הזרימה בתוך ה-PLBR, הקורא מופנה ל-Grünberger et al.13 .
ניתוח קצב גדילה
ניתן להחיל את המערכת הנוכחית כדי לחקור מינים בקטריאליים שונים ביחס לפרמטרים ביולוגיים שונים כגון צמיחה, מורפולוגיה או אות פלואורסצנטי. בדוגמה ראשונה, C. glutamicum, אורגניזם ייצור בעל רלוונטיות תעשייתית, תורבת תחת תנאי תרבית סטנדרטיים (T=30 °C, מצע CGXII21). איור 6A מציג את עקומות הצמיחה שהתקבלו משלוש מיקרו-מושבות איזוגניות. צמיחה מעריכית נשמרת עד שה-PLBRs מתמלאים, מה שמעיד על כך שלא חסר רכיב תזונתי. איור 6B מציג ארבע תמונות מיקרוסקופיה של DIC בשיטת time-lapse של מושבת C. glutamicum בצמיחה.
ניתוח פלואורסצנציה
עבור מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים בודדים, חוקרים משתמשים לעיתים קרובות בחלבונים פלואורסצנטיים ספציפיים, לדוגמה GFP או נגזרות שלו, כדי לקשר פנוטיפ ספציפי בעל עניין לפלט מדיד (אות פלואורסצנטית). כדי להדגים את ישימות ה-PBLR למחקרי time-lapse מבוססי פלואורסצנציה, בחנו את פליטת הפלואורסצנציה של זן C. glutamicum המייצר חלבון היתוך YFP-TetR מקודד בפלסמיד תחת בקרת פרומוטור Ptac (pEKEx2-yfp-tetR)18,22. נודע כי בנוכחות ריכוזים נמוכים של משרה (IPTG), ביטוי מפרומוטור Ptac מוביל לשונות משמעותית בין תאים באוכלוסיות חיידקיות איזוגניות. החל מתרבית מקדימה אחת, הגדילנו את הצמיחה ואת הפלואורסצנציה של תאים בודדים עבור מספר מיקרו-מושבות איזוגניות. כפי שניתן לראות ב-איור 7, צפינו בהטרוגניות פנוטיפית בין מיקרו-מושבות שונות ובהטרוגניות ברמת התא הבודד בתוך מושבות שהחלו מתא אם אחד. מושבה אחת (איור 7B, PLBR 1) כמעט ולא הראתה פליטת פלואורסצנציה, בעוד שתאים ב-PLBR 2 הראו פליטת פלואורסצנציה נמוכה עקב ביטוי בסיסי של yfp-tetR מפרומוטור Ptac. ב-PLBR 3 פליטת הפלואורסצנציה הייתה חזקה במידה ניכרת בהשוואה למושבות האחרות ונצפתה התפלגות רחבה של האוכלוסייה. דוגמה זו מדגימה את ישימות ה-PBLR למחקרי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ב-time-lapse. בהשוואה לציטומטריית זרימה, שבה ניתן לקבוע את הפלואורסצנציה של תאים בודדים בנקודת זמן אחת, המערכת הנוכחית מאפשרת מעקב אחר תאים ובדיקה של פלואורסצנציה של תאים בודדים בזמן אמת לאורך דורות רבים.
איור 1. סקירה כללית של תהליך ייצור שבב PLBR. ייצור תבנית מאסטר: החל מ-(A) תכנון, (B) ייצור מסיכת ליטוגרפיה, ו-(C) ייצור וופר. ייצור שבב PDMS-זכוכית: החל מ-(D) עיצוב PDMS, ולאחר מכן (E) חיבור זכוכית ו-PDMS ו-(F) הרכבה סופית של השבב.
איור 2. תכנון שבב ה-PLBR. (A) שרטוט CAD של כל השבב המיקרופלואידי; (B) הגדלה של מיקומי פריסה נבחרים: הפריסה כוללת שתי כניסות מצע (a1), מחולל מדרג עם תעלות ערבוב (a2) ו-6 מערכי PLBR מקבילים (b1). b2 מציג PLBR אחד, המוטמע בערוץ נוזלים ברוחב של 100 µm. ל-PLBR יש קוטר פנימי של 40 µm ותעלות הזנה ברוחב של 2 µm. לכניסת הזריעה יש אורך של 40 µm. צבע ורוד מייצג את השכבה הראשונה (אזור לכידה וטיפוח) וצבע כחול מייצג את השכבה השנייה (הובלת נוזלים).
איור 3. איור של תהליך ייצור פרוסות (wafers) דו-שכבתי. (A) ייצור השכבה הראשונה המכילה מבני לכידה; (B) ייצור השכבה השנייה המכילה תעלות זרימה, כניסות ויציאות; (C) פרופילי שטח מייצגים של השכבה הראשונה. במקרה זה, גובה השכבה הראשונה היה 1,200 nm והיא משמשת לגידול של C. glutamicum במצע מורכב.
איור 4. ייצור המכשיר ושבב מייצגהדגמה של תהליך היצירה של תבנית PDMS: (A(ערבוב ווידואו של PDMS;B) יציקת PDMS; (Cשחרור מהתבנית, חיתוך והדבקת שבבים. שבב סופי (שוחזר באישור של ה-Royal Society of Chemistry)13): (ד׳) תצלום של שבב ה-PDMS עם 2 כניסות ופתח יציאה אחד; (ה(תמונת CAD של שישה מערכים מקבילים, הכוללים כל אחד 5 PLBRs; (F) תמונת SEM של PLBR אחד.
איור 5. עקרון הפעולה של מערכת ה-PLBR. (A) שלב הזריעה; (B) שלב הצמיחה של מיקרו-מושבות חיידקים; (C) שלב הגלישה. שוכתב באישור של ה-Royal Society of Chemistry13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H.
איור 6. קביעת קצב הצמיחה של מיקרו-מושבות C. glutamicum WT. (A) גרף צמיחה של שלושה תרביתי PLBR והעקומות האקספוננציאליות שהתקבלו (חלקים הועתקו ברשות של ה-Royal Society of Chemistry)13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H. (B) תמונות Time-lapse של מושבת C. glutamicum בצמיחה.
איור 7. ניתוח הטרוגניות של אוכלוסייה מבוסס PBLR. מוצג C. glutamicum המבטא איחוי yfp-tetR תחת בקרת הפרומוטור Ptac (pEKEx2-yfp-tetR) בהיבסות של האינדוזר IPTG. (A) זרימת העבודה הניסויית; (B) שלוש מיקרו-מושבות איזוגניות המראות הטרוגניות בין מושבה למושבה והטרוגניות בין תא לתא; (C) התפלגות פלואורסנציה של תאים בודדים בתוך המיקרו-מושבות המתאימות.
איור 8. תמונות במיקרוסקופ אלקטרונים סורק של PLBRs שונים. תמונות SEM המראות פתחי זריעה לצורך אופטימיזציה של יעילות הלכידה. (A) פתחי זריעה גדולים (B) פתחי זריעה קטנים (C) פתחי זריעה "פתוחים" גדולים יותר (D) שני פתחי זריעה.
| שלב | בעיה | סיבה אפשרית | פתרון |
| ייצור פרוסות (Wafer Fabrication) | בועות אוויר כלואות ב-SU-8 במהלך אפייה רכה (soft bake) | עליית טמפרטורה מהירה מדי | אפייה ב-95 °C וב-65 °C מספר פעמים |
| ייצור פרוסות (Wafer Fabrication) | מבני SU-8 שנעלמו או נשברו | תהליך ייצור שאינו אופטימלי; מאמץ מכני במבני ה-SU-8 | אופטימיזציה של פרמטרים כגון זמן אפייה וזמן חשיפה |
| ייצור פרוסות (Wafer Fabrication) | שכבות SU-8 נמוכות או גבוהות מדי, או עובי שכבה לא אחיד | בעיה במהלך ציפוי סבב (spin coating) | בדיקת פרמטרי ה-spin-coater ותושבת הפרוסה (wafer chuck) |
| הדבקה והרכבת שבב | קריסת PLBRs | פרמטרי הדבקת PDMS שאינם אופטימליים | כוונון ההספק, זמן החשיפה לפלסמה וזמן האפייה לאחר ההדבקה |
| הדבקה והרכבת שבב | מבנים מלוכלכים וחלקיקים ב-PLBRs | השבב לא נוקה כראוי | שימוש בסרט דבק (scotch-tape) לניקוי פני השטח |
| הדבקה והרכבת שבב | הדבקה לא מספקת בין PDMS לזכוכית | פרמטרי הדבקה שאינם אופטימליים או ניקוי לא מספק | בדיקת הגדרות פלזמת החמסן |
| ניסוי מיקרופלואידי | דליפת נוזלים | חור הכניסה/יציאה לא נוקב כראוי | אופטימיזציה של תהליך ניקוב החורים |
| ניסוי מיקרופלואידי | חלקיקי PDMS קטנים רבים במהלך המילוי | החור לא נוקב כראוי | אופטימיזציה של תהליך ניקוב החורים |
| ניסוי מיקרופלואידי, היבט ביולוגי | אין צמיחת תאים | שאריות ממס מתהליך הניקוי | שטיפה מקיפה יותר של השבב לפני טעינת התאים או המתנה לאידוי הממס לפני ההדבקה |
| ניסוי מיקרופלואידי, היבט ביולוגי | שינויים בקצבי הצמיחה | סיבות שונות | בדיקת תרבית המקור (preculture) והטמפרטורה |
| ניסוי מיקרופלואידי, היבט ביולוגי | שינויים במורפולוגיית התאים במהלך הגידול | מגבלות תזונה או שינוי בטמפרטורה | בדיקת האינקובטור והזרימה |
| ניסוי מיקרופלואידי, היבט טכני | סחיפה (drift) במיקום במהלך מיקרוסקופיה של צילום רב-זמני (time lapse) | תנודות בטמפרטורה | בדיקת פרופיל הטמפרטורה לפני הניסויים עד להפסקת התנודות |
| ניסוי מיקרופלואידי, היבט טכני | איבוד תאים במהלך הגידול | גובה ריאקטור גבוה מעט מדי | אופטימיזציה של גובה הריאקטור |
| ניסוי מיקרופלואידי, היבט טכני | אין לכידה (trapping) | גובה ריאקטור נמוך מדי | אופטימיזציה של גובה הריאקטור |
טבלה 1. פתרון בעיות. טבלה זו מסכמת היבטים קריטיים, טעויות נפוצות ופתרונות אפשריים במהלך העבודה הניסויית.
דיון
תיארנו את הייצור, ההתקנה הניסיונית ונהלי הפעולה הקשורים של מכשיר PDMS מיקרופלואידי, המכיל מספר (PLBRs) לניתוח תאים בודדים של חיידקים.
מיקרו-ייצור בטכניקות ליתוגרפיה רכה מאפשר התאמות מהירות של מידות המכשיר עבור גדלים שונים ומורפולוגיה של חיידקים. נכון לעכשיו אנו מייעלים את הביוריאקטור של פיקוליטר לגבי גידול אורגניזמים מיקרוביאליים שונים ותפוקת הגידול. על מנת להגביר את יעילות הלכידה, גם גיאומטריית הכור נמצאת באופטימיזציה. איור 8 מציג ארבעה התקני PLBR חדשים המאומתים כעת. בכל האיורים תעלת הזריעה עוצבה מחדש מבחינת רוחב וצורה. בפועל, נראה שיש לכך השפעה על מספר התאים הלכודים, אך דורש חקירות נוספות. שיפורים משמעותיים ביעילות הלכידה הושגו גם על ידי שילוב תעלות הצפה נוספות שהובילו לזרימה קונבקציונית גבוהה יותר דרך הכור וללכידת תאים נוספים. עם זאת, במקביל מגבירים את הסיכון לשטוף תאים במהלך הגידול.
המכשיר מהווה אלטרנטיבה מעניינת לגידולים בקנה מידה מאקרו ששימשו במשך עשרות שנים לחקר תהליכי גידול וייצור ברמת תא בודד. עם זאת, יש לו כמה דרישות חשובות: לניטור מקביל של מספר ביו-ריאקטורים פיקוליטרים מערך מיקרוסקופי ברזולוציה גבוהה וממונע במלואו עם פיצוי סחף מיקוד הוא חובה. בנוסף, יש צורך במערכת דגירה כדי לשמור על טמפרטורת הגידול הרצויה קבועה לאורך כל המדידות.
אנו משיגים שיעור הצלחה של 95% בייצור מכשירים. הבעיות העיקריות קשורות להדבקה לא יעילה של זכוכית PDMS, קריסת גג PDMS או דליפת נוזלים (ראה טבלה 1 לפתרון בעיות ברוב הבעיות המתרחשות). למרות שעבודת הניסוי נעשית בחלקה בתנאים לא סטריליים, לעתים רחוקות אנו רואים זיהום במהלך הניסויים, בגלל מערכת הנוזלים הסגורה. התקני מיקרופלואידיקה PDMS הם שקופים אופטית, ולכן ניתן להשתמש בהם להדמיה ברזולוציה גבוהה in vivo . למרות שנראה ש-PDMS מושלם ליישום, יש לו זיקה גבוהה למולקולות הידרופוביות, מה שהופך את השימוש בממיסים הנמצאים בשימוש נרחב בתהליכים ביו-קטליטיים של תאים שלמים למוגבל. עם זאת, קיימים ציפויים מתאימים להתאמת הפרוטוקול ליישומים מסוג זה.
ה-PLBR המוצע מתאים היטב לניתוח מרחבי-זמני של אירועים תאיים ואפילו תת-תאיים של סוגים שונים של חיידקים. יתרון מרכזי של הגישה הנוכחית טמון ביכולת לכמת את צמיחת המיקרו-מושבה ישירות בניגוד לשיטות קונבנציונליות. יתר על כן, ה-PLBR מאפשר תרבית בתנאים מוגדרים וקבועים. מכיוון שהמערכת מאפשרת שימוש בכמויות קטנות של ריאגנטים או חומרים, היא נושאת את היתרונות של היותה זולה, ניתנת להתאמה אישית וניתנת לתפוקה גבוהה. בשיטות מסורתיות נלקחים בחשבון הערכים הממוצעים של כלל האוכלוסייה בעת ניתוח גידול מיקרוביאלי. יתר על כן, השיטות הקיימות זקוקות לדגימה ידנית שעלולה להוביל לפירוק הדגימות ובכך לטעויות במדידה. ה-PLBR מציע נקודות מבט חדשות לפיתוח תהליכים ביולוגיים וניתוח הטרוגניות של אוכלוסיות במיקרוביולוגיה. ה-PLBR הוא כלי מבטיח ליישומים שונים בפיתוח תהליכים ביולוגיים וניתן ליישם אותו בתחומי מחקר שונים, למשל ניתוח הטרוגניות של תא לתא, ניתוח אשכולות תאים ספציפיים בתוך שושלות תאים, סינון זני ייצור מיקרוביאלים וחקירה בזמן אמת של פנוטיפים של תאים.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
המחברים רוצים להודות לטכנאית אגנס מולר-שרואר על תרומתה רבת הערך. עבודה זו בוצעה בחלקה במתקן הננו-אלקטרוני של הלמהולץ (HNF) ב-Forschungszentrum Jülich GmbH. המחברים אסירי תודה על העזרה והתמיכה הנדיבה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פרוסת סיליקון בקוטר 100 מ"מ, P/BOR < 100> | Si-MAT, חומרי סיליקון, גרמניה | ||
| Photoresist SU-8 2000.5 | Micro Resist Technology GmbH, גרמניה | ||
| Photoresist SU-8 2010 | Micro Resist Technology GmbH, גרמניה | ||
| SU-8 מפתח mr DEV- 600 | Micro Resist Technology GmbH, גרמניה | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 ערכת | אלסטומר סיליקוןדאו קורנינג; Farnell GmbH, גרמניה | ||
| מחטי חלוקה טיפים מדויקים 27 גרם; מזהה = 0.2 מ"מ, OD = 0.42 מ"מ | Nordson EFD Deutschland, גרמניה | ||
| לוחות זכוכית D263 T eco, 30 מ"מ x 25 מ"מ x 0.17 מ"מ | Schott AG, גרמניה | ||
| מנקב חורים AKA 5130-B-90 | Harris צינורות חד-ליבתיים | ||
| Tygon S-54-HL, ID = 0.25 מ"מ, OD = 0.76 מ"מ | Saint Gobain; VWR International GmbH, גרמניה | ||
| מזרקים חד פעמיים – Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 מ"ל | B. Braun Melsungen AG, גרמניה | 552-183143 | |
| מזרקים, 1 מ"ל מזרקי זכוכית סטריליים | INNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS), גרמניה | ||
| כימיקלים | |||
| (NH4)2SO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה | ||
| Urea | Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה | ||
| KH2PO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה | ||
| K2HPO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה | ||
| MgSO4• 7H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה | ||
| MOPS | Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה | ||
| FeSO4• 7H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה | ||
| MnSO4• H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה | ||
| ZnSO4• 7H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה | ||
| CuSO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה | ||
| NiCl2• 6H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה | ||
| CaCl2 | Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה | ||
| ביוטין | Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה | ||
| חומצה פרוקטכואית | Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה | ||
| גלוקוז-מונוהידראט | Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה | ||
| BHI | Becton, Dickinson | ||
| Cells | |||
| Corynebacterium glutamicum ATTC 13032 | DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany | ||
| Escherichia coli MG 1655 | DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany | ||
| Equipment | |||
| מנקה פרוסות SSEC 3300 | Solid State Equipment LLC | ||
| Spin Coater SPIN150 -NPP | SPS Europe B.V. | ||
| מיישר מסכות MA-6 | Karl Suess | ||
| פלטה חמה HP30A - 2 | טורי פיינס | ||
| Memmert UN 200 | Memmert | ||
| מנקה פלזמה FEMTO | Diener Electronics, גרמניה | ||
| ומשאבות מזרק MESYS | Cetoni GmbH, גרמניה | ||
| בוחש מגנטי CB 162 | סטיוארט | VWR 442-0304 | |
| מיקרוסקופ ניקון אקליפס טי | ניקון מיקרוסקופיה מיקרוסקופ | ||
| אינקובוטור | Pecon GmbH, גרמניה | ||
| צנטריפוגה מיניספין פלוס " קו שחור" | אפנדורף | 9776501 | |
| פוטומטר ביופוטומטר פלוס | Eppendorf | 6132000008 | |
| שייקר/אינקובטור בקבוק שייק 3031 | GFL - Gesellschaft fü r Labortechnik mbH, גרמניה | ||
| Profilometer, Dektak 150 Stylus Profiler | Veeco |
מקורות
- Muzzey, D., van Oudenaarden, A. Quantitative Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Single Cells. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 25, 301-327 (2009).
- Wei, P., et al. Bacterial virulence proteins as tools to rewire kinase pathways in yeast and immune cells. Nature. 488, 384-388 (2012).
- Park, S., et al. Influence of topology on bacterial social interaction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13910-13915 (1073).
- Lee, P. J., Helman, N. C., Lim, W. A., Hung, P. J. A microfluidic system for dynamic yeast cell imaging. BioTechniques. 44, 91-95 (2008).
- Kobel, S. A., et al. Automated analysis of single stem cells in microfluidic traps. Lab Chip. 12, 2843-2849 (2012).
- Carlo, D. D., Wu, L. Y., Lee, L. P. Dynamic single cell culture array. Lab Chip. 6, 1445-1449 (2006).
- Locke, J. C. W., Young, J. W., Fontes, M., Jimenez, M. J. H., Elowitz, M. B. Stochastic Pulse Regulation in Bacterial Stress Response. Science. 334, 366-369 (2011).
- Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).
- Fritzsch, F. S. O., et al. Picoliter nDEP traps enable time-resolved contactless single bacterial cell analysis in controlled microenvironments. Lab Chip. 13, 397-408 (2013).
- Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
- Mather, W., Mondragon-Palomino, O., Danino, T., Hasty, J., Tsimring, L. S. Streaming Instability in Growing Cell Populations. Phys. Rev. Lett. 104, (2010).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr. Biol. 20, 1099-1103 (2010).
- Grunberger, A., et al. A disposable picolitre bioreactor for cultivation and investigation of industrially relevant bacteria on the single cell level. Lab Chip. 12, 2060-2068 (2012).
- Walden, M., Elf, J. Studying transcriptional interactions in single cells at sufficient resolution. Curr. Opin. Biotech. 22, 81-86 (2011).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Lambert, G., Liao, D., Austin, R. H. Computation of mutual fitness by competing bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20269-20273 (2008).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17290-17295 (2006).
- Grunberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnol. Bioeng. 110, 220-228 (2013).
- Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13, (2012).
- Mustafi, N., Grunberger, A., Kohlheyer, D., Bott, M., Frunzke, J. The development and application of a single-cell biosensor for the detection of L-methionine and branched-chain amino acids. Metab. Eng. 14, 449-457 (2012).
- Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microb. Cell Fact. 8, (2009).
- Keilhauer, C., Eggeling, L., Sahm, H. Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon. J. Bacteriol. 175, 5595-5603 (1993).
- Frunzke, J., Bramkamp, M., Schweitzer, J. E., Bott, M. Population Heterogeneity in Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 caused by prophage CGP3. J. Bacteriol. 190, 5111-5119 (2008).
הדפסות חוזרות והרשאות
