ביו-ריאקטור מיקרו-נוזלי פיקוליטר לניתוח מיקרוביאלי של תאים בודדים: ייצור, הגדרת מערכת ותפעול

סיכום

בפרוטוקול זה מוצג הייצור, ההתקנה והתפעול הבסיסי של ביו-ריאקטור פיקוליטר מיקרופלואידי (PLBR) לניתוח תאים בודדים של מיקרואורגניזמים פרוקריוטיים. מיקרואורגניזמים רלוונטיים מבחינה תעשייתית נותחו כהוכחה עקרונית המאפשרת תובנות לגבי קצב גדילה, מורפולוגיה והטרוגניות פנוטיפית על פני תקופות זמן מסוימות, בקושי אפשרי בשיטות קונבנציונליות.

תקציר

בפרוטוקול זה מתוארים בפירוט הייצור, ההתקנה הניסויית והתפעול הבסיסי של הביוריאקטור המיקרופלואידי. ניתן להשתמש ב-PLBR לניתוח חיידקים בודדים ומיקרו-מושבות כדי לחקור שאלות הקשורות לביוטכנולוגיה ומיקרוביולוגית הנוגעות, למשל, צמיחת תאים, מורפולוגיה, תגובת מתח וייצור מטבוליט או חלבון ברמת תא בודד. המכשיר כולל זרימת מדיה רציפה המאפשרת תנאים סביבתיים קבועים למחקרי הפרעות, אך בנוסף מאפשר החלפת מדיום מהירה כמו גם תנאים מתנודדים כדי לחקות כל מצב סביבתי רצוי. כדי לייצר את המכשירים החד-פעמיים, פרוסת סיליקון המכילה מבני SU-8 בגודל תת-מיקרומטר שימשה כתבנית השכפול ליציקת פולידימתילסילוקסן מהירה. השבבים נחתכו, הורכבו, חוברו והוצבו על מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה ואוטומטי לחלוטין המתאים להדמיית זמן-lapse, כלי רב עוצמה לניתוח תאים מרחביים-זמניים. כאן, אורגניזם הפלטפורמה הביוטכנולוגית Corynebacterium glutamicum נזרע לתוך ה-PLBR ומעקב אחר צמיחת תאים והפלואורסצנציה התוך-תאית נמשכו מספר שעות תוך פענוח הטרוגניות של אוכלוסייה תלוית זמן ברמת תא בודד, דבר שאינו אפשרי בשיטות ניתוח קונבנציונליות כגון ציטומטריית זרימה. מלבד תובנות לגבי ייצור מכשירים, יתר על כן, מודגמת הכנת קדם-תרבית, העמסה, לכידת חיידקים וגידול PLBR של תאים בודדים ומושבות. מכשירים אלה יוסיפו ממד חדש במחקר המיקרוביולוגי לניתוח תופעות תלויות זמן של חיידקים בודדים תחת בקרה סביבתית הדוקה. בשל תהליך הייצור הפשוט והקצר יחסית, ניתן להתאים את הטכנולוגיה בקלות בכל מעבדת מיקרופלואידיקה ופשוט להתאים אותה לצרכים ספציפיים.

מבוא

מיקרוסקופ זמן-lapse הוא כלי רב עוצמה לחקר תאים חיים in vivo¹. בינתיים, פלטפורמות מיקרוסקופיה אוטומטיות לחלוטין הזמינות מסחרית, כולל פיצוי סחף מיקוד המושרה תרמית, מיושמות בדרך כלל במחקר ביולוגי לחקר תופעות תלויות זמן, החל ממחקר סרטן ותאי נוירונים על פני הנדסת רקמות ומחקרים דינמיים עם שמרים בודדים או תאי חיידקים^2-6.

בדרך כלל לוחות באר שקופים, רפידות אגר או פשוט שקופיות מיקרוסקופיה מיושמות כדי לספק סביבות תרבית תאים במהלך הדמיית זמן-lapse⁷. למרות שהן מתאימות למחקר מסוים, למערכות פשוטות אלה יש שליטה מוגבלת מאוד על תנאי הסביבה ואינן מאפשרות הפרעות מורכבות יותר או שינויי מדיום מוגדרים ומהירים. מכשירי שבב מיקרופלואידיים חד פעמיים המיוצרים בייצור המוני הוצגו לשוק לאחרונה אך מותאמים בעיקר לסוגי תאים אוקריוטיים גדולים יותר⁴. למרות שניתן לעקוב אחר צמיחה, חקירות גדילה מוגדרות היטב הנוגעות, למשל, לכידת תאים מדויקת, גודל המושבה, כיוון הצמיחה והיכולת להסרת תאים מוגבלות. לבתי גידול וכורים מיקרופלואידיים, שבהם תאי חיידקים מגודלים בסביבות תלת מימדיות פותחו^8-10, יש חסרונות כאשר עוסקים במחקרים כמותיים ברמת התא הבודד. בעוד שניתן לנתח את ההטרוגניות הכוללת של האוכלוסייה, לא ניתן לקבוע במדויק פרמטרים רבים של תאים ברזולוציה של תא בודד מכיוון שהצמיחה אינה מוגבלת לחד-שכבות.

מגבלה זו גרמה לפיתוח מיקרו-מערכות המאפשרות גידול תאים בתעלות ובבתי גידול מוגדרים היטב עם תאים הגדלים בחד-שכבות שטוחות עם רזולוציית תא בודד ובקרה הדוקה במיוחד על אספקת המדיה ותנאי הסביבה^6,11,12. דוגמאות מעטות למערכות מיקרופלואידיות לגידול תאי חיידקים הודגמו^12-14. חיידקים בדרך כלל מציגים קצב צמיחה מהיר מאוד ודורשים מבנים מיקרופלואידיים בטווח של כמה מיקרומטרים ומטה, במיוחד כאשר רצויים חד-שכבות של תאים למיקרוסקופיה. Keymer et al. הדגים צמיחה והתפשטות של זני E. coli בנופים מיקרו-מפוברקים^15,16. מכיוון שהם התעניינו בדינמיקה של אוכלוסייה הם לא חקרו ברזולוציה של תא בודד.

פיתחנו את הביו-ריאקטור פיקוליטר (PLBR)¹³, המיושם כיום כדי לחקור מדדי ביצועים ביוטכנולוגיים שונים כגון צמיחה¹⁷ וניתוח פרודוקטיביות פלואורסצנטי ברמת תא בודד^18,19. המכשיר המיקרופלואידי הנוכחי מאפשר בקרת כור סביבתי בנפח תרבית מוגדר של כפיקליטר אחד ותצפית רציפה של תא בודד בו זמנית. בהשוואה למערכות קופסאות חד-שכבתיות פתוחות^11,14, שבהן צד אחד או שניים פתוחים לערוץ אספקת המדיה, ה-PLBR מאפשר לכידה ותרבות מבוקרות. התכנון מאפשר גידול ארוך טווח של חיידקים ללא סיכון של מספר מושבות סמוכות ליצור אוכלוסייה אחת גדולה. יתר על כן, המערכת משלבת אזורי גידול בגובה 1 מיקרומטר (לפי סדר קוטר התא) כדי להגביל את צמיחת החיידקים לחד-שכבות תאים. לעומת זאת, תעלות האספקה עמוקות פי 10 כדי למזער את ההתנגדות ההידראולית.

בהשוואה למערכות גידול אצווה ממוזערות²⁰ המערכת הנוכחית מאפשרת גידול עם פרמטרים סביבתיים קבועים עקב זרימת מדיה רציפה. יתר על כן, ניתן לשלוט בקלות בפרמטרים סביבתיים כגון הרכב בינוני, טמפרטורה, קצב זרימה וחילופי גז תוך שניות. זה מאפשר חקירות ספציפיות של תגובה תאית לשינויים סביבתיים הנוגעים למשל לזמינות חומרים מזינים או גירוי לחץ. הדרישה לנפחי מדיה מופחתים, כלומר בטווח של כמה מיקרוליטרים בלבד, מאפשרת לחוקרים לבצע מחקרים חדשים, למשל הפרעה של תאים במהלך הדמיית זמן-lapse עם סופרנטנט של ניסויים בקנה מידה גדול החושפים את תגובת התא בתנאים סביבתיים ספציפיים אלה¹⁷. הביוריאקטור של פיקוליטר מספק לחוקרים מערכת חזקה השולטת באופן הדוק בתנאים הביופיזיים ומופעלת באמצעות משאבות מזרקים ברמת דיוק גבוהה ומיקרוסקופיה אוטומטית של שדה בהיר ופלואורסצנטי להדמיית זמן-lapse. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול שלם הכולל תכנון מכשירים, ייצור ויישומים לדוגמה.

פרוטוקול

1. ייצור פרוסות

1. תכנן את ההתקן המיקרו-נוזלי המכיל כניסות, יציאות, תעלות ראשיות ו-PLBRs (איור 1A) באמצעות תוכנת CAD.
2. התכן המוצג בפרוטוקול זה (איור 2) מורכב משני פתחי זריעה, מחולל שיפוע עבור ערבוב של שני מצעים שונים, יציאה אחת ושישה מערכים של PLBRs. כל מערך מכיל 5 PLBRs, וכתוצאה מכך 30 PLBRs מקבילים בתוך מכשיר מיקרופלואידי אחד.
3. צור מסיכת פוטו ליתוגרפיה המכילה את פריסות השבבים הרצויות (איור 1B). מסכת הצילום הופקה בתוך הבית על ידי כתיבת קרן אלקטרונים ברזולוציה תת-מיקרונית. המסכה ששימשה הייתה מורכבת משכבת כרום על צלחת זכוכית 5^ב-2.
   הערה: בצע את כל השלבים הבאים בתנאי חדר נקי Class 100 ומעלה (תרשים זרימה של תהליך מוצג באיורים 3A ו-3B).
4. נקו פרוסת סיליקון בגודל 4 אינץ' עם פיראנה (יחס של 10:1 של חומצה גופרתית ומי חמצן) וחומצה הידרופלואורית למשך מספר דקות (זהירות: כימיקלים מסוכנים). יש לשטוף במים נטולי יונים (DI) למשך כ-10 שניות.
5. יש לייבש את הוופל למשך 20 דקות בטמפרטורה של 200 מעלות צלזיוס.
6. ציפוי סיבוב 1 מיקרומטר SU-8 2000.5 עמידות לאור על הפרוסה (שכבה ראשונה) (התנגדות של 4 מ"ל, סיבוב 10 שניות עם, v = 500 סל"ד, ו-a = 100 סל"ד/שנייה, סיבוב 30 שניות עם v = 1,000 סל"ד ו-a = 300 סל"ד/שנייה).
7. הנח את הוופל המצופה על פלטה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס כדי לסלק עודפי ממס (1.5 דקות ב-65 מעלות צלזיוס, 1.5 דקות ב-95 מעלות צלזיוס ודקה אחת ב-65 מעלות צלזיוס; באופן אידיאלי השתמש בשתי פלטות חימום).
8. הכנס מסיכת פוטו שכבה 1 (כאן אזורי הלכידה של כורי הפיקוליטר) ופרוסות בתוך מיישר המסכה וחשוף את הוופל ל-350-400 ננומטר (מגע ואקום, 64 mJ/cm², t = 3 שניות, I = 7 mW/cm²).
9. בצע אפייה לאחר חשיפה על פלטה חמה ב-95 מעלות צלזיוס כדי להתחיל את הפילמור של SU-8 (דקה אחת ב-65 מעלות צלזיוס, דקה אחת ב-95 מעלות צלזיוס ודקה אחת ב-65 מעלות צלזיוס). הערה: לאחר שלב זה ניתן לראות את המבנים בשכבת SU-8.
10. הנח את הוופל באמבט מפתח SU-8 למשך דקה אחת והעביר את הוופל למיכל שני עם מפתח SU-8 טרי למשך מספר שניות.
11. שטפו את הוופל באיזופרופנול כדי להסיר מפתח SU-8 ופרוסה יבשה באמצעות זרימת חנקן של סביבון פרוסות.
12. אופים קשה את הוופל במשך 10 דקות בחום של 150 מעלות צלזיוס.
13. מעיל סיבוב 9 מיקרומטר SU-8 2010 פוטורזיסט על הפרוסה (שכבה שנייה) (להוציא התנגדות של 4 מ"ל, לסובב 10 שניות עם v = 500 סל"ד, a = 100 סל"ד לשנייה, ולסובב 30 שניות עם v = 4,000 סל"ד, a = 300 סל"ד לשנייה).
14. הנח את הוופל עם SU-8 על פלטה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס כדי לסלק עודפי ממס (15 דקות ב-65 מעלות צלזיוס, 45-60 דקות ב-95 מעלות צלזיוס ו-10 דקות ב-65 מעלות צלזיוס). הערה: יש לשים לב לקמטים ולבועות. אם הפרוסה מחוממת למהירות של 95 מעלות צלזיוס, ממס מאודה עשוי להיות עטוף בבועות גז זעירות.
15. הכנס את מסכת הצילום עם הפריסה הרצויה (כאן הערוצים העיקריים לאספקת חומרים מזינים) ואת הוופל לתוך יישור המסכה וחשוף ל-350-400 ננומטר (מגע קשה, 64 mJ/cm², t = 10 שניות, I = 7 mW/cm²)
16. בצע אפייה לאחר חשיפה על פלטה חמה ב-95 מעלות צלזיוס כדי לסיים את הפילמור של SU-8 (5 דקות ב-65 מעלות צלזיוס, 3:30 דקות ב-95 מעלות צלזיוס, 3 דקות ב-65 מעלות צלזיוס). הערה: לאחר שלב זה ניתן לראות את המבנים בשכבת SU-8.
17. הנח את הוופל באמבט מפתח SU-8 למשך 45 שניות, העביר את הוופל למיכל שני עם מפתח SU-8 טרי ופתח למשך 60 שניות.
18. שטפו את הוופל 20 שניות עם איזופרופנול כדי להסיר שאריות מפתח SU-8 ופרוסות יבשות באמצעות חנקן בלחץ.
19. לבסוף אופים קשה את הוופל בחום של 150 מעלות צלזיוס. כתוצאה מכך מתקבלת הפרוסה הסופית (איור 1C), שתשמש כתבנית מאסטר ליציקת PDMS.
20. בצע מדידות פרופילומטר (איור 3C) כדי לאמת את גבהי המבנה של SU-8. הערה: אי דיוקים בגובה המבנה עלולים לגרום ללכידת תאים לא יעילה או לאובדן תאים במהלך הגידול.

2. ייצור שבב פולידימתילסילוקסן

הערה: כל השלבים הבאים צריכים להתבצע באופן אידיאלי בתנאי זרימה למינרית כדי למנוע חלקיקי אבק להפריע להליך הייצור (תרשים זרימה של תהליך מוצג באיור 4).

1. הכן תערובת של בסיס פולידימתילסילוקסן (PDMS) וחומר ריפוי ביחס של 10:1. מערבבים בזהירות עד לקבלת תמיסה הומוגנית שנראית אטומה. הכן ככל הנדרש לגובה השכבה הרצוי (כאן 3 מ"מ).
2. הסר את תערובת ה-PDMS למשך כ-30 דקות בוואקום קל עד שכל הבועות נעלמו.
3. הכן מכשיר דפוס (או צלחת פטרי) עם פרוסת SU-8 מתאימה ושפך לתוכו את תערובת ה-PDMS (איור 1D).
4. אופים את ה-PDMS במשך 3 שעות בחום של 80 מעלות בתנור.
5. מקלפים בזהירות את לוח ה- PDMS מהרקיק. חותכים את הלוח לשבבים בודדים בעזרת אזמל נקי וחד.
6. שטפו את הצ'יפס באמבט n-pentane למשך 90 דקות, ולאחר מכן שתי אמבטיות שטיפת אצטון (90 דקות כל אחת). יבש את הצ'יפס למשך הלילה כדי להסיר שאריות ממס. זהירות: בצע את שטיפת ה-PDMS מתחת למכסה אדים. הערה: במהלך שטיפת ה-n-pentane, מונומרים ודימרים מוסרים מה-PDMS הנרפא וגודל השבב עשוי להכפיל את עצמו באופן זמני במהלך הליך הכביסה.
7. אחסן את שבבי ה-PDMS המיקרופלואידיים במיכלים סגורים עד לניסוי הסופי.
8. רגע לפני הניסוי, נקב את חורי הכניסה והיציאה לתוך שבב ה-PDMS באמצעות מחט (או מחורר) בקוטר מעט קטן יותר מהמחברים המשמשים לחיבור צינורות עם שבב PDMS.
9. נקה את שבב ה-PDMS המיקרופלואידי בזהירות עם איזופרופנול והשתמש בסקוטש כדי להסיר חלקיקי אבק שעלולים להידבק בצד ה-PDMS המובנה. השתמש בסקוטש מספר פעמים עד שלא ניתן לראות חלקיק על השבב.
10. נקה שקופית זכוכית דקה של 170 מיקרומטר עם אצטון ואיזופרופנול ברצף. לבסוף יש לנקות במים נטולי יונים ולייבש עם חנקן בלחץ.
11. לפני הפעלת הפלזמה, יש לחמם את מנקה הפלזמה ולהפעיל את הפלזמה למשך כ-300 שניות.
12. יישר את ה-PDMS ושבב הזכוכית לפני ההדבקה. לבסוף, הניחו את שבב ה-PDMS בזהירות על שקופית הזכוכית (איור 1E). PDMS וזכוכית יתחברו תוך שניות. הערה: אין לדחוף עם פינצטה על החלק העליון של שבב ה-PDMS במהלך תהליך ההדבקה. זה עלול להוביל למה שנקרא קריסת גגות של התעלות והמבנים הקטנים.
13. על מנת לחזק את הקשר, אופים את שבב הזכוכית הסופי PDMS למשך 10 שניות בחום של 80 מעלות צלזיוס.

3. הכנת תרבית החיידקים

הערה: יש להכין את כל הגידולים במדיום מסונן סטרילי כדי למנוע הצטברות של חלקיקים לא רצויים, העלולים להפריע במהלך הגידול.

1. השתמש בצלחת אגר המכילה את האורגניזמים הרצויים (כאן, C. glutamicum ATCC 13032) וחסן מושבה אחת ל-20 מ"ל של מדיום BHI טרי, דגירה למשך הלילה (≈ 8-14 שעות) בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס על שייקר סיבובי (120 סל"ד).
2. העבירו 10 מיקרוליטר מהתרבית המוקדמת למדיום הרצוי (כאן CGXII²¹) שישמש במהלך גידול מיקרופלואידי, ותנו לתא לגדול בן לילה ב-30 מעלות צלזיוס על שייקר סיבובי (120 סל"ד).
3. העבירו את הכמות הרצויה של תרחיף התאים (בין 10-500 מיקרוליטר, תלוי בתחילת הניסוי) למדיום הרצוי (כאן CGXII²¹) שישמש במהלך גידול תאים מיקרופלואידיים. הערה: הטוב ביותר הוא להשתמש בתאים מהשלב הלוגריתמי המוקדם לזריעה. עבור תרבית C. glutamicum הצפיפות האופטית הטובה ביותר (OD₆₀₀) לזריעה הייתה בין 0.5-2.
4. מעבירים 1 מ"ל מתרבית החיידקים לצינור סטרילי של 2 מ"ל. הערה: יש לעשות זאת מיד לאחר הרכבת שבב ה-PDMS המיקרופלואידי, כדי למזער את זמן ההעברה בין בקבוק הניעור לגידול מיקרופלואידי. בדרך כלל זמן ההעברה הוא בסביבות 15 דקות ויש לשמור אותו קטן ככל האפשר כדי למנוע השפעה על חילוף החומרים הנגרמת על ידי הגבלת חמצן ושינויי טמפרטורה.

4. הגדרת ניסוי

הערה: כל השלבים מבוצעים באמצעות מיקרוסקופ הפוך.

1. הפעל את חממת המיקרוסקופ שעתיים לפני הניסוי כדי לחמם את המערכת. הערה: המיקרוסקופיה צריכה להיות מצוידת בחממה בגודל מלא כדי לשלוט בטמפרטורה ובמידת הצורך בזרימת הגז. אין צורך בבקרת לחות נוספת מכיוון שמערכת השבבים מוחדרת ברציפות במדיה.
2. פתח את מערכת החממה, בחר את המטרה הרצויה ובמידת הצורך הוסף שמן טבילה על המטרה.
3. התקן את השבב בתוך מחזיק השבב. במידת הצורך, תקן את לוחית הזכוכית עם סרט דבק על מנת למנוע שבב כלשהו במהלך פעולת השלב.
4. מרכז את הדגימה על המיקרוסקופ והתמקד במערכי PLBR.
5. חבר כניסות ויציאות עם צינורות מתאימים (איור 1F). חבר צינורות למאגר פסולת. ניתן לראות שבב מייצג באיור 4D.
6. הכנס מזרקים למשאבות והתחל את זרימת המדיה. השתמש בתמיסת ציפוי בינונית, חיץ או במידת הצורך ושטוף את התעלות המיקרופלואידיות למשך כשעה אחת. הערה: תמיסת ציפוי משמשת לציפוי דפנות התעלה כדי למנוע הידבקות תאים לא ספציפית.
7. עבור E. coli, תמיסה של 0.1% של BSA משמשת לציפוי דפנות התעלה. עבור C. glutamicum אין צורך בציפוי. לאחר הליך הציפוי יש לשטוף את השבב בזריעת תאים בינונית קודמת.
8. לפני זריעה וטיפוח תאים, בדקו כי לא מתרחשת דליפה וכי הטמפרטורה קבועה.

5. זריעת תאי חיידקים לתוך המכשיר המיקרופלואידי.

1. ודא שתמיסות החיידקים הרצויות זמינות במזרקים מתאימים המחוברים לצינורות.
2. נתק את המאגר או תמיסת הציפוי וחבר את מתלה התא לשבב. כדי למזער את נפח המוות, בועות אוויר לא רצויות וכדי להפחית את זמן הניסוי, החלף את המחט השלמה כמו גם את הצינורות, ולא רק את המזרקים.
3. להחדיר את תרחיף התאים לתעלות בקצב זרימה נפחי של 200 נ"ל/דקה עד שרוב ה-PLBRs מתמלאים בכמות התאים הרצויה (איור 5A). הערה: תוצאות הזריעה האופטימליות תלויות בזן החיידקים, OD₆₀₀ ובמדיום הגידול של התרבית המוקדמת. יש להתאים את הפרמטרים הללו כדי להגדיל את יעילות הלכידה והזמן עד שמספר מספיק של תאים נלכדים במבני הכור. עבור C. glutamicum, בדרך כלל נעשה שימוש בתרחיף תאים של OD₆₀₀ 0.5-2; עבור E. coli ה-OD₆₀₀ היה בין 0.5-1.
4. אם רק מספר קטן של PLBRs מתמלאים, הגדל את קצב הזרימה ל-800-1,200 nl/min.
5. נתק את מתלה התא וחבר את מצע הגידול לשבב (איור 5B). ודא שלא תוכנס בועת אוויר במהלך השינוי הבינוני. חלחל עם מצע גידול טרי ב 100 nl / min.

6. הדמיית זמן-lapse

1. בחר PLBRs ספציפיים להדמיית זמן-lapse. בדרך כלל נבחרים PLBRs המכילים תא אם יחיד בתחילת הניסוי. מספר אזורי העניין שניתן לחקור בניסוי אחד תלוי בקצב הפריימים הרצוי ובהגדרה המיקרוסקופית.
2. בחר קצב פריימים מתאים בהתאם למספר ה-PLBRs. ודא שהמיקרוסקופ יכול להתמודד עם כמות ההחזר הרצויה על ההשקעה במרווח הזמן לשגות הזמן.
3. בחר ערכות מסננים מתאימות (כאן YFP). סגור אוטומטית את התריס במהלך תנועת הבמה ולאחר כל מדידת זמן-lapse כדי למנוע הלבנת כרומופור.
4. הגדר את רצף המיקרוסקופיה של זמן-lapse והתחל את הניסוי.
5. לאחר שכל ה-PLBRs גדלים יתר על המידה, ניתן לעצור את הניסוי, להשליך את שבב ה-PDMS המיקרופלואידי ולהעריך את הניסוי.

7. ניתוח

הערה: ניתן לבצע את השלבים או החלקים הבאים של ההליך באופן ידני או על ידי תוכניות ניתוח תמונות כגון ImageJ וכו'.

1. קבע PLBRs מעניינים שבהם הגידול עונה על כל הקריטריונים הרצויים, למשל מספר תאי האם, מיקום תאי האם וכו'.
2. כדי לקבוע את קצב הצמיחה של מיקרו-מושבה אחת, ספרו את מספר התאים בכל מסגרת זמן.
3. חשב את קצב הצמיחה המרבי על ידי התוויית זמן לעומת ln (מספר תא). שיפוע החלקה מייצג את קצב הצמיחה ב-[1/שעה] (ראה איור 6).
4. ניתוח נתוני פלואורסצנטיות תלוי מאוד בניסוי שבוצע. בדוח זה נבחרה דוגמה להמחשת הטרוגניות בין מושבה למושבה ותא לתא בין מיקרו-מושבות איזוגניות שונות (ראה איור 7).

תוצאות

ייצור מכשירים

מערכת ה-PLBR המיקרופלואידית מיוצרת על ידי שכבה אחת של PDMS המודבקת על שבב זכוכית דק המתאים למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. הייצור מורכב משני שלבים עיקריים: ראשית ייצור מאסטר השכפול (איורים 1A, 1B ו-1C) ושנית ייצור השבבים (איורים 1D, 1E ו-1F). על פי הפרוטוקול, טכניקות מיקרו-ייצור פוטוליתוגרפיות סטנדרטיות משמשות ליצירת תבנית המאסטר. מעבדות ללא מתקן חדר נקי יכולות לרכוש תבניות מאסטר SU-8 מותאמות אישית זמינות מסחרית. באמצעות יציקת PDMS חוזרת על עצמה (איורים 1A, 1B ו-1C) ניתן לייצר מאות שבבים חד-פעמיים. דפוס PDMS והרכבת שבבים יכולים להיעשות בכל מעבדה ואינם דורשים מתקני חדרים נקיים, עם זאת, מקומות עבודה של זרימת אוויר למינרית נוחים.

התהליך מתחיל בתכנון מערכת השבבים המיקרופלואידית. בדרך כלל משתמשים בתוכנת CAD לתכנון השבב המיקרופלואידי (איור 1A). אחרי CAD, מסיכה נוצרת על ידי כותב קרן e (איור 1B) ברזולוציה תת-מיקרונית. במחקר הנוכחי נוצרה מסכת כרום 5 אינץ' ששימשה לליתוגרפיה של פרוסות SU-8. פרוסת הסיליקון הסופית - SU - 8 משמשת ליציקת PDMS (איור 1D). לאחר שלב אפייה, לוח ה-PDMS נחתך לשבבים המודבקים באופן בלתי הפיך על שקופיות הזכוכית (איור 1E). לבסוף הצינור מחובר (איור 1F).

איור 2 מציג את התכנון של המערכת המיקרופלואידית בפירוט. הוא מורכב משני כניסות זריעה, מחולל שיפוע לערבוב של מצעים או מדיה שונים ושקע אחד. לערוצים הראשיים יש ממד של 50 מיקרומטר x 10 מיקרומטר (W x H). כל מכשיר מורכב משישה מערכים של PLBRs, המכילים 5 PLBRs כל אחד. התוצאה היא 30 כורים מקבילים בתוך מכשיר מיקרופלואידית אחד.

איור 3 ממחיש את ייצור האב של השכפול. כפי שמתואר בפירוט בפרוטוקול, שכבת SU-8 ראשונה מיוצרת על ידי ליתוגרפיה SU-8 (איור 3A). הליך דומה מיושם עבור השכבה השנייה (איור 3B). כדי לבדוק את גיאומטריית הערוץ חקרנו את גובה ה-PLBRs והערוצים הראשיים באמצעות פרופילומטר. בדוגמה המוצגת באיור 3C, נמדדה השכבה הראשונה (שכבת הגידול). כאן השכבה מראה גובה עקבי של 1,200 ננומטר, המתאים לגידול של C. glutamicum במדיום BHI.

איור 4 ממחיש את הליך יציקת ה-PDMS החל מערבוב PDMS (איור 4A) ואחריו תהליך היציקה (איור 4B) ולבסוף שלב ההדבקה (איור 4C). איור 4D מציג את השבב המיקרופלואידי הסופי המשלב את לוח הזכוכית בעובי 170 מיקרומטר, שבב PDMS (3 מ"מ גובה) עם כניסות ויציאות ומחטי פלדה המחוברות לצינורות. לאחר הניסוי ניתן להשליך את השבב ואין צורך בניקוי נרחב. יתר על כן, קל להרכיב ולטפל. אין צורך בהליך מילוי מורכב וקשה.

עקרון המכשיר

איור 5 מציג את עקרון העבודה של מערכת הכור. תאים מוזרקים למכשיר המיקרופלואידי, ותאים בודדים נשארים לכודים בתוך ה-PLBR פשוט על ידי אינטראקציות בין דופן התא. בשל ההבדל בהתנגדות ההידרודינמית של התעלה וה- PLBR, מתרחשת רק זרימה מינימלית בתוך ה- PLBR. אחרי הזריעה של ה-PLBR (איור 5A), שלב הגידול והתצפית מתחיל עם שינוי מתמיסת חיידקים למצע גידול (איור 5B). לאחר שה-PLBRs גדלים יתר על המידה (איור 5C) הניסוי בדרך כלל נעצר וניתן לנתח תמונות זמן-lapse. עבור מנגנוני הלכידה ופרופיל הזרימה בתוך ה-PLBR הקורא מופנה ל-Grünberger et al.¹³ לפרטים נוספים.

ניתוח קצב צמיחה

ניתן ליישם את המערכת הנוכחית כדי לחקור מיני חיידקים שונים ביחס לפרמטרים ביולוגיים שונים כגון גדילה, מורפולוגיה או אות פלואורסצנטי. בדוגמה ראשונה C. glutamicum, אורגניזם ייצור רלוונטי מבחינה תעשייתית תורבת בתנאי גידול סטנדרטיים (T=30 מעלות צלזיוס, CGXII medium²¹). איור 6A מציג את עקומות הצמיחה הנגזרות משלוש מיקרו-מושבות איזוגניות. הצמיחה האקספוננציאלית נשמרת עד למילוי ה-PLBRs, מה שמצביע על כך שלא מתרחשת מגבלה תזונתית. איור 6B מציג ארבע תמונות מיקרוסקופיה של DIC של מושבת C. glutamicum גדלה.

ניתוח פלואורסצנטי

עבור מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תא בודד, חוקרים משתמשים לעתים קרובות בחלבונים פלואורסצנטיים ספציפיים, למשל GFP או נגזרות, כדי להצמיד פנוטיפ ספציפי מעניין לפלט מדיד (אות פלואורסצנטי). כדי להדגים את תחולת ה-PBLR למחקרי זמן-lapse מבוססי פלואורסצנטיות, חקרנו את פליטת הקרינה של זן C. glutamicum המייצר חלבון היתוך YFP-TetR מקודד פלסמיד בשליטת מקדם Ptac (pEKEx2-yfp-tetR)^18,22. בנוכחות ריכוזי משרה נמוכים (IPTG), ביטוי מ-Ptac ידוע כמוביל לשונות משמעותית מתא לתא באוכלוסיות חיידקים איזוגניות. החל מקדם-תרבית אחת, עקבו אחר הגידול והפלואורסצנציה של תא בודד עבור מספר מיקרו-מושבות איזוגניות. כפי שניתן לראות באיור 7, ראינו הטרוגניות פנוטיפית בין מיקרו-מושבות שונות והטרוגניות ברמת התא הבודד בתוך מושבות החל מתא אם אחד. מושבה אחת (איור 7B, PLBR 1) הראתה כמעט ללא פליטת פלואורסצנטיות, בעוד שתאים של PLBR 2 הראו פליטת פלואורסצנטיות נמוכה עקב ביטוי yfp-tetR בסיסי ממקדם Ptac. ב-PLBR 3 פליטת הקרינה הייתה חזקה במידה ניכרת בהשוואה למושבות האחרות ונצפתה התפלגות רחבה של האוכלוסייה. דוגמה זו מדגימה את תחולת ה-PBLR למחקרי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בזמן-lapse. בהשוואה לזרימה ציטומטרית, שבה ניתן לקבוע את הקרינה של תאים בודדים בנקודת זמן אחת, המערכות הנוכחיות מאפשרות מעקב אחר תאים וחקר הקרינה של תא בודד בזמן אמת לאורך דורות רבים.

איור 1.סקירה כללית של תהליך ייצור שבבי PLBR. ייצור תבניות ראשי: החל מ- (A) עיצוב, (B) ייצור מסכות ליתוגרפיה ו- (C) ייצור רקיקים. ייצור שבבי זכוכית PDMS: החל מ-(D) של יציקת PDMS ואחריו (E) זכוכית והדבקת PDMS ו-(F) הרכבת שבב סופית.

איור 2. תכנון שבב PLBR. (A) ציור CAD של כל השבב המיקרופלואידי; (B) הגדלה של מיקומי פריסה נבחרים: הפריסה מכילה שני כניסות בינוניות (a1), מחולל שיפוע עם ערוצי ערבוב (a2) ו-6 מערכי PLBR מקבילים (b1). b2 מציג PLBR אחד, המוטבע בתעלה נוזלית ברוחב של 100 מיקרומטר. ל-PLBR קוטר פנימי של 40 מיקרומטר ותעלות הזנה ברוחב של 2 מיקרומטר. אורך כניסת הזריעה הוא 40 מיקרומטר. צבע ורוד מייצג את השכבה הראשונה (אזור השמנה וטיפוח) וצבע כחול מייצג את השכבה השנייה (הובלת נוזלים).

איור 3.איור של תהליך ייצור פרוסות דו-שכבתיות. (א) ייצור השכבה הראשונה המכילה מבני לכידה; (ב) ייצור השכבה השנייה המכילה תעלות נוזלים, כניסות ויציאות; (ג) פרופילי משטח מייצגים של השכבה הראשונה. במקרה זה גובה השכבה הראשונה היה 1,200 ננומטר והיא משמשת לגידול C. glutamicum במדיום מורכב.

איור 4.ייצור מכשירים ושבב מייצג. איור של תהליך יציקת ה-PDMS: (א) ערבוב והסרת גז PDMS; (ב) יציקת PDMS; (ג) שחרור עובש, חיתוך והדבקת שבבים. שבב סופי (שוחזר באישור החברה המלכותית לכימיה¹³): (D) תצלום של שבב PDMS עם 2 כניסות ויציאה אחת; (E) תמונת CAD של שישה מערכים מקבילים המכילים 5 PLBRs כל אחד; (F) תמונת SEM של PLBR אחד.

איור 5. עקרון העבודה של מערכת PLBR. (א) שלב הזריעה; (B) שלב הגדילה של המיקרו-מושבות החיידקים; (ג) שלב הצפה. הועתק באישור החברה המלכותית לכימיה13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H.

איור 6.קביעת קצב הגדילה של מיקרו-מושבות C. glutamicum WT. (A) חלקת גידול של שלושה גידולי PLBR ועקומות מעריכיות כתוצאה מכך (חלקים ששוחזרו באישור החברה המלכותית לכימיה)13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H. (B) תמונות דולג זמן של מושבת C. glutamicum גדלה.

איור 7. ניתוח מבוסס PBLR של הטרוגניות אוכלוסייה. מוצג C. glutamicum המבטא היתוך yfp-tetR בשליטת מקדם ה-Ptac (pEKEx2-yfp-tetR) בהיעדר המשרה IPTG. (א) זרימת עבודה ניסיונית; (B) שלוש מיקרו-מושבות איזוגניות שמראות הטרוגניות בין מושבה למושבה והטרוגניות בין תא לתא; (ג) התפלגות הקרינה של תא בודד בתוך המיקרו-מושבות המתאימות.

איור 8. סריקת תמונות אלקטרונים של PLBRs שונים. תמונות SEM המציגות פתחי זריעה למיטוב יעילות ההשמנה. (A) כניסות זריעה של לאגר (B) כניסות זריעה קטנות יותר (C) מפרצוני זריעה "פתוחים" גדולים יותר (D) שני פתחי זריעה.

צעד	בעיה	סיבה אפשרית	תמיסה
ייצור רקיק	בועות אוויר כלואות ב-SU-8 במהלך אפייה רכה	העלאת הטמפרטורה לצום	אופים בחום של 95 מעלות ו-65 מעלות מספר פעמים
ייצור רקיק	מבני SU-8 נעלמים ושבורים	הליך ייצור לא אופטימלי; לחץ מכני במבני SU-8	אופטימיזציה של פרמטר כגון זמן אפייה, זמן חשיפה
ייצור רקיק	שכבות SU-8 לעובי שכבה נמוך או גבוה או לא אחיד	בעיה במהלך ציפוי הסיבוב	בדוק את הפרמטרים של ציפוי הסיבוב ואת צ'אק הוופל
הדבקה והרכבה של שבב	PLBRs קורסים	פרמטרי מליטה PDMS אינם אופטימליים	התאם את הכוח, זמן החשיפה לפלזמה. וזמן האפייה לאחר ההדבקה
הדבקה והרכבה של שבב	מבנים וחלקיקים מלוכלכים ב- PLBRs	השבב לא נוקה כראוי	מרחו סקוטש לניקוי פני השטח
הדבקה והרכבה של שבב	הדבקה לא מספקת של PDMS-זכוכית	פרמטרי מליטה אינם ניקוי אופטימלי או לא מספיק	בדוק את ההגדרות של פלזמת חמצן
Microfluidic Experiment	דליפת נוזלים	חור הכניסה/יציאה לא נוקב כראוי	אופטימיזציה של תהליך ניקוב החורים
Microfluidic Experiment	חלקיקי PDMS קטנים רבים במהלך המילוי	החור לא נוקב כראוי	אופטימיזציה של תהליך ניקוב החורים
ניסוי מיקרופלואידי, היבט ביולוגי	אין צמיחת תאים	שאריות ממס מהליך הניקוי	שטפו את השבב בצורה נרחבת יותר לפני טעינת התאים או תנו לממס להתאדות לפני ההדבקה
ניסוי מיקרופלואידי, היבט ביולוגי	שיעורי צמיחה משתנים	סיבות שונות	בדוק את התרבות המוקדמת והטמפרטורה
ניסוי מיקרופלואידי, היבט ביולוגי	שינויים במורפולוגיה של התאים במהלך הגידול	מגבלות נוטריינטים או שינוי טמפרטורה	בדוק את החממה והזרימה
ניסוי מיקרופלואידי, היבט טכני	סחיפה במיקום במהלך מיקרוסקופ זמן-lapse	תנודות טמפרטורה	בדוק את פרופיל הטמפרטורה בניסויים קודמים עד ללא תנודה
ניסוי מיקרופלואידי, היבט טכני	אובדן תאים במהלך הגידול	גובה כור מעט גבוה	אופטימיזציה של גובה הכור
ניסוי מיקרופלואידי, היבט טכני	ללא השמנה	גובה כור נמוך מדי	אופטימיזציה של גובה הכור

טבלה 1. פתרון בעיות. טבלה זו מסכמת היבטים קריטיים, טעויות נפוצות ופתרונות אפשריים במהלך עבודה ניסויית.

דיון

תיארנו את הייצור, ההתקנה הניסיונית ונהלי הפעולה הקשורים של מכשיר PDMS מיקרופלואידי, המכיל מספר (PLBRs) לניתוח תאים בודדים של חיידקים.

מיקרו-ייצור בטכניקות ליתוגרפיה רכה מאפשר התאמות מהירות של מידות המכשיר עבור גדלים שונים ומורפולוגיה של חיידקים. נכון לעכשיו אנו מייעלים את הביוריאקטור של פיקוליטר לגבי גידול אורגניזמים מיקרוביאליים שונים ותפוקת הגידול. על מנת להגביר את יעילות הלכידה, גם גיאומטריית הכור נמצאת באופטימיזציה. איור 8 מציג ארבעה התקני PLBR חדשים המאומתים כעת. בכל האיורים תעלת הזריעה עוצבה מחדש מבחינת רוחב וצורה. בפועל, נראה שיש לכך השפעה על מספר התאים הלכודים, אך דורש חקירות נוספות. שיפורים משמעותיים ביעילות הלכידה הושגו גם על ידי שילוב תעלות הצפה נוספות שהובילו לזרימה קונבקציונית גבוהה יותר דרך הכור וללכידת תאים נוספים. עם זאת, במקביל מגבירים את הסיכון לשטוף תאים במהלך הגידול.

המכשיר מהווה אלטרנטיבה מעניינת לגידולים בקנה מידה מאקרו ששימשו במשך עשרות שנים לחקר תהליכי גידול וייצור ברמת תא בודד. עם זאת, יש לו כמה דרישות חשובות: לניטור מקביל של מספר ביו-ריאקטורים פיקוליטרים מערך מיקרוסקופי ברזולוציה גבוהה וממונע במלואו עם פיצוי סחף מיקוד הוא חובה. בנוסף, יש צורך במערכת דגירה כדי לשמור על טמפרטורת הגידול הרצויה קבועה לאורך כל המדידות.

אנו משיגים שיעור הצלחה של 95% בייצור מכשירים. הבעיות העיקריות קשורות להדבקה לא יעילה של זכוכית PDMS, קריסת גג PDMS או דליפת נוזלים (ראה טבלה 1 לפתרון בעיות ברוב הבעיות המתרחשות). למרות שעבודת הניסוי נעשית בחלקה בתנאים לא סטריליים, לעתים רחוקות אנו רואים זיהום במהלך הניסויים, בגלל מערכת הנוזלים הסגורה. התקני מיקרופלואידיקה PDMS הם שקופים אופטית, ולכן ניתן להשתמש בהם להדמיה ברזולוציה גבוהה in vivo . למרות שנראה ש-PDMS מושלם ליישום, יש לו זיקה גבוהה למולקולות הידרופוביות, מה שהופך את השימוש בממיסים הנמצאים בשימוש נרחב בתהליכים ביו-קטליטיים של תאים שלמים למוגבל. עם זאת, קיימים ציפויים מתאימים להתאמת הפרוטוקול ליישומים מסוג זה.

ה-PLBR המוצע מתאים היטב לניתוח מרחבי-זמני של אירועים תאיים ואפילו תת-תאיים של סוגים שונים של חיידקים. יתרון מרכזי של הגישה הנוכחית טמון ביכולת לכמת את צמיחת המיקרו-מושבה ישירות בניגוד לשיטות קונבנציונליות. יתר על כן, ה-PLBR מאפשר תרבית בתנאים מוגדרים וקבועים. מכיוון שהמערכת מאפשרת שימוש בכמויות קטנות של ריאגנטים או חומרים, היא נושאת את היתרונות של היותה זולה, ניתנת להתאמה אישית וניתנת לתפוקה גבוהה. בשיטות מסורתיות נלקחים בחשבון הערכים הממוצעים של כלל האוכלוסייה בעת ניתוח גידול מיקרוביאלי. יתר על כן, השיטות הקיימות זקוקות לדגימה ידנית שעלולה להוביל לפירוק הדגימות ובכך לטעויות במדידה. ה-PLBR מציע נקודות מבט חדשות לפיתוח תהליכים ביולוגיים וניתוח הטרוגניות של אוכלוסיות במיקרוביולוגיה. ה-PLBR הוא כלי מבטיח ליישומים שונים בפיתוח תהליכים ביולוגיים וניתן ליישם אותו בתחומי מחקר שונים, למשל ניתוח הטרוגניות של תא לתא, ניתוח אשכולות תאים ספציפיים בתוך שושלות תאים, סינון זני ייצור מיקרוביאלים וחקירה בזמן אמת של פנוטיפים של תאים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פרוסת סיליקון בקוטר 100 מ"מ, P/BOR < 100>	Si-MAT, חומרי סיליקון, גרמניה
Photoresist SU-8 2000.5	Micro Resist Technology GmbH, גרמניה
Photoresist SU-8 2010	Micro Resist Technology GmbH, גרמניה
SU-8 מפתח mr DEV- 600	Micro Resist Technology GmbH, גרמניה
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 ערכת	אלסטומר סיליקוןדאו קורנינג; Farnell GmbH, גרמניה
מחטי חלוקה טיפים מדויקים  27 גרם; מזהה = 0.2 מ"מ, OD = 0.42 מ"מ	Nordson EFD Deutschland, גרמניה
לוחות זכוכית D263 T eco, 30 מ"מ x 25 מ"מ x 0.17 מ"מ	Schott AG, גרמניה
מנקב חורים AKA 5130-B-90	Harris צינורות חד-ליבתיים
Tygon S-54-HL, ID = 0.25 מ"מ, OD = 0.76 מ"מ	Saint Gobain; VWR International GmbH, גרמניה
מזרקים חד פעמיים – Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 מ"ל	B. Braun Melsungen AG, גרמניה	552-183143
מזרקים, 1 מ"ל מזרקי זכוכית סטריליים	INNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS), גרמניה
כימיקלים
(NH4)2SO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה
Urea	Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה
KH2PO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה
K2HPO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה
MgSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה
MOPS	Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה
FeSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה
MnSO4• H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה
ZnSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה
CuSO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה
NiCl2• 6H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה
CaCl2	Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה
ביוטין	Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה
חומצה פרוקטכואית	Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה
גלוקוז-מונוהידראט	Carl Roth GmbH + Co. KG, גרמניה
BHI	Becton, Dickinson
Cells
Corynebacterium glutamicum ATTC 13032	DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany
Escherichia coli MG 1655	DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany
Equipment
מנקה פרוסות SSEC 3300	Solid State Equipment LLC
Spin Coater SPIN150 -NPP	SPS Europe B.V.
מיישר מסכות MA-6	Karl Suess
פלטה חמה HP30A - 2	טורי פיינס
Memmert UN 200	Memmert
מנקה פלזמה FEMTO	Diener Electronics, גרמניה
ומשאבות מזרק MESYS	Cetoni GmbH, גרמניה
בוחש מגנטי CB 162	סטיוארט	VWR 442-0304
מיקרוסקופ ניקון אקליפס טי	ניקון מיקרוסקופיה מיקרוסקופ
אינקובוטור	Pecon GmbH, גרמניה
צנטריפוגה מיניספין פלוס " קו שחור"	אפנדורף	9776501
פוטומטר ביופוטומטר פלוס	Eppendorf	6132000008
שייקר/אינקובטור בקבוק שייק 3031	GFL - Gesellschaft fü r Labortechnik mbH, גרמניה
Profilometer, Dektak 150 Stylus Profiler	Veeco