דור וטיהור של מכלולי אדם INO80 הכרומטין שיפוץ וSubcomplexes

סיכום

פרוטוקול זה מתאר הליך להפקת וטיהור מסוג בר וגרסאות מוטציה של מתחם שיפוץ הכרומטין INO80 האנושי. Epitope מתויג גרסאות של יחידות משנה INO80 באות לידי ביטוי ביציבות בתאי HEK293, ומתחמים שלמים ומתחמים חסרי מערכות ספציפיות של יחידות משנה הם מטוהרים על ידי כרומטוגרפיה immunoaffinity.

תקציר

מתחמי שיפוץ הכרומטין INO80 להסדיר דינמיקת הנוקלאוזום ונגישות DNA על ידי מזרזות שיפוץ הנוקלאוזום תלוי ATP. מתחמי INO80 אדם מורכבים מ14 יחידות משנה חלבון כולל Ino80, ATPase כמו SNF2, המשמש גם כמקטע קטליטי והפיגום להרכבה של המכלולים. פונקציות של יחידות משנה האחרות והמנגנונים שבאמצעותם הם תורמים לפעילות שיפוץ הכרומטין של מתחם INO80 להישאר הבינו היטב, בין שאר בשל האתגר של יצירת מכלולי INO80 בתאים אנושיים או מערכות ביטוי Heterologous. פרוטוקול יופיטר זה מתאר הליך המאפשר טיהור של subcomplexes שיפוץ הכרומטין INO80 האנושי שחסרי מקטע או קבוצת משנה של יחידות משנה. epitope דגל N-סופני מתויג Ino80 cDNA הם הציגו ביציבות לכליה עוברית אנושית (HEK) 293 שורות תאים באמצעות רקומבינציה בתיווך FLP. במקרה שקבוצת משנה של יחידות משנה של מתחם INO80 הוא bדואר שנמחק, אחד מבטא חלבוני Ino80 במקום מוטציה שחסר את הפלטפורמה הנדרשת להרכבה של תת יחידות אלה. באירוע למקטע בודד הוא להיות מדולדל, siRNAs אחד transfects מיקוד למקטע זה לשורת תאי HEK 293 יציבות להביע FLAG tagged Ino80 ATPase. תמציות גרעיניות מוכנות, וimmunoprecipitation FLAG מתבצעת על מנת להעשיר את השברים חלבון המכילים נגזרי Ino80. הקומפוזיציות של subcomplexes INO80 מטוהר לאחר מכן ניתן לנתח באמצעות שיטות כגון immunoblotting, צביעת כסף, וספקטרומטריית מסה. Subcomplexes INO80 וINO80 שנוצר על פי פרוטוקול זה ניתן לנתח נוסף באמצעות מבחני ביוכימיים שונים, אשר מתוארים בפרוטוקול יופיטר הנלווה. השיטות שתוארו כאן יכולות להיות מותאמות ללימודים של התכונות המבניות ותפקודיות של כל שיפוץ הכרומטין רב למקטע של יונקים ומתחמי שינוי.

מבוא

מתחמי שיפוץ הכרומטין משפחת SNF2 אבולוציונית שמורים הם רגולטורים מרכזיים של ארגון הכרומטין ונגישות DNA ^1. מתחמי שיפוץ אלה תמיד כוללים מקטע מרכזי כמו SNF2-ATPase, אשר, במקרים מסוימים, מרכיב בחלבוני אבזר שונים ויוצר מכלולי מקרו מולקולרי רב למקטע. כדי לחקור את הפרטים המולקולריים של תהליך שיפוץ הכרומטין תלוי ATP, זה חשוב להבין את תרומתם של תת קבוצות מסוימות של יחידות משנה ו / או מבני תחום לפעילות של מתחמים. ניתוח מסוג זה דורש את היכולת ליצור מתחמי מוטציה נקיים במיוחד שחסרות יחידות משנה חלבון מסוימות או מבני תחום.

מחקרי מבנה פונקציה קודמים של מתחמי שיפוץ הכרומטין תלוי ATP התמקדו באופן נרחב במערכת שמרי המודל בשל manipulability מעולה של הגנום השמרים (ראה, למשל, שופטים ^1-4). בהתחשב בשימורהרכב למקטע ופונקציונליות בין מתחמי שיפוץ orthologous, מחקרים של המבנה והתפקוד של קומפלקסי שיפוץ שמרים סיפקו תובנות חשובות עמיתיהם באאוקריוטים גבוהים יותר. עם זאת, מינים ספציפיים ניכרים הבדלים בין מתחמי שיפוץ קיימים, כתוצאה מרווח או הפסד של מינים ספציפיים יחידות משנה, הרווח או הפסד של תחומים מינים ספציפיים של יחידות משנה נשמרו, והשתנות רצף בתוך תחומים משומרים של יחידות משנה נשמרת. יכולים באופן עקרוני להיות מונעים את ההבדלים כאמור על ידי הצורך בתאים האיקריוטים גבוהים יותר להסתגל לסביבות מולקולריות ותאיות חדשות. לפיכך, ההבנה כיצד יחידות משנה של מתחמי שיפוץ אוקריוטים גבוהים לתרום לתהליך שיפוץ הנוקלאוזום היא בעל ערך, כי זה לא רק גם שופך אור על מנגנונים בסיסיים של תהליך שיפוץ הכרומטין תלוי ATP, אבל יכול לספק תובנה חשובה המנגנונים שבאמצעותם מבנה הכרומטין וביטוי גנים בפואאוקריוטים מוסדרים.

עד כה, יש כבר מוגבל רק מחקרים מבניים ותפקודיים של מתחמי שיפוץ הכרומטין יונקים רב למקטע, נובע בחלקו בקשיים בהשגת מתחמים מוגדרים ביוכימית הכרומטין שיפוץ וsubcomplexes. באופן חלקי יש לנו לעקוף את הקשיים הללו לנהלים שיפורטו להלן, שבו לטיהור immunoaffinity משמשת להכנת subcomplexes INO80 או INO80 שלם מהתאים אנושיים ביציבות להביע epitope דגל N-סופני מתויג סוג בר או גרסאות מוטציה של Ino80 ^5-7 (איור 1) . כדי להשיג מתחמי INO80 שלמים מהתאים אנושיים, רקומבינציה בתיווך FLP משמשת ליצירת שורות תאי HEK293 מהונדסים ביציבות להביע cDNAs מתויגים epitope דגל קידוד יחידות משנה של המתחם INO80 ^8-10. בגלל ביטוי יתר של יחידות משנה INO80 יכול להיות רעיל במידה מסוימת, יש צורך לבודד ולשמור על שורות תאים משובטים תחת שיתוף סלקטיביnditions כדי להבטיח ביטוי transgene יציב במהלך הקטעים רבים הנדרשים להרחבה של תרביות תאים בקנה מידה גדולה. כדי להשיג subcomplexes INO80 קטן יותר המכיל רק קבוצת משנה של יחידות משנה, השתמשנו בהצלחה שתי גישות (איור 2 א, ב '). בחלק הראשון, אנו יוצרים שורות תאי HEK293 FLP-In ביציבות להביע גרסאות מוטציה של Ino80 שחסרת ​​תחומים הנדרשים לאינטראקציה עם יחידות משנה ספציפיות ^5. לחלופין, מציאה בתיווך siRNA משמשת לרוקן למקטע הרצוי מהתאים לבטא מקטע מתאים מתויג דגל INO80 (נתונים שלא פורסמו). לבסוף, כדי לטהר את מתחמי INO80 האנושיים, כרומטוגרפיה המבוססת agarose FLAG ¹¹ משמשת להעשרת חלק המכיל INO80 מתמציות גרעיניות, ובכך מפחיתה ביעילות את נוכחותם של חלבונים מזהמים cytosolic בשבריר הסופי המכיל subcomplexes INO80 או INO80 המטוהר.

פרוטוקול

.1 ייצור ותרבות של שורות תאי יציבות HEK293 הבעה באורך מלא או גרסות משתנות של הדגל epitope מתויג Ino80 או יחידות משנה INO80 מורכבות אחרות

1. שיבוט cDNA קידוד באורך מלא או Ino80 ATPase אנושי מוטציה או מקטע INO80 אחר לpcDNA5 / FRT וקטור ביטוי של היונקים עם, תג epitope דגל מסוף N במסגרת.
2. לאשר את הרצף של cDNAs הוכנסו על ידי רצפי DNA לפני שתמשיך.
3. כדי לבצע transfection, לגדול FLP-In HEK293 תאים בצלחות תרבית רקמת 10 סנטימטר במצע המכיל DMEM (הנשר בינוני השתנה Dulbecco), 5% גלוטמין, ו10% FBS (בסרום שור עוברי).
4. כאשר תאים מגיעים confluency ~ 70%, להוסיף לכל מנה בתרבית רקמת תערובת של 40 μl של מגיב transfection FuGENE6, 0.5 מיקרוגרם של פלסמיד ביטוי pcDNA5 / FRT המתאים, ו9.5 מיקרוגרם של pOG44, אשר מקודד recombinase FLP, בהיקף כולל של 800 μl.
5. 48 שעות מאוחר יותר, trypsinize והיםPlit תאים ביחס של 01:30 ל10 מנות סנטימטר, ולגדל אותם בDMEM עם גלוטמין 5%, 10% FBS, ו100 מיקרוגרם / hygromycin B מ"ל ל3 - 4 שבועות. לשנות את התרבות בינונית בכל פעם שהוא מתחיל להפוך צהוב (בדרך כלל כל 3 - 5 ימים).
6. לזהות שיבוטים חיוביים המבטאים את הרמה הגבוהה ביותר של החלבון מתויג דגל, בחר מושבות B עמיד hygromycin האישי ולהעבירם לטוב אחד של צלחת 24 גם.
   1. ברגע שהתאים מגיעים confluency 80%, תאי קציר מכל טוב ב~ 1 מ"ל PBS וגלול על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 למשך 5 דקות.
   2. לאחר הסרת supernatant, resuspend התא גלולה ב60 μl של חיץ מדגם SDS-PAGE.
   3. מחצית נושא של התא גלולה resuspended לדף SDS ומערבי סופג לפקח ביטוי של FLAG tagged חלבון פיתיון; להציל את החצי השני לעתיד ניתוחים.
7. אם לא חלבון Ino80 אדם מתויג דגל מזוהה בlysates תא, להרחיב את popu התאים המשובט הראשוןויסות נוסף על ידי תאי ציפוי מבארות בודדות של צלחת 24 גם לצלחות תרבית רקמת 15 סנטימטר.
   1. למסוק תאים מ15 מנות סנטימטר, resuspend ליד תאים ומחוברות בקרח הקר PBS והעברת צינור חרוטי 50 מ"ל.
   2. להביא לנפח סופי של 50 מ"ל על ידי הוספת PBS נוסף.
   3. תאים גלולה ב 1,000 XG למשך 5 דקות, ולהסיר ככל האפשר מsupernatant.
   4. Resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל של חיץ Lys450 (20 pH HEPES מ"מ-NaOH 7.9, 450 mM NaCl, 0.5% TritonX-100, 10 מ"מ KCl, 4 מ"מ MgCl _2, 0.2 mM EDTA, גליצרול 10%, 1 מ"מ DTT, 200 PMSF מיקרומטר, ו1: 1,000 קוקטייל מעכבי פרוטאז).
      הערה: כאן ובמקומות אחרים, תמיד להוסיף DTT, PMSF, ומעכבי פרוטאז קוקטייל למאגרים מייד לפני תחילת ניסוי.
   5. חיסוני משקע הדגל מתויג חלבונים מlysate התא השלם וכתוצאה מכך באמצעות 20 μl של agarose ג'ל אנטי FLAG, ולנתח את eluates FLAG על ידי מערבי סופג. [לפרטים של immunהליך oprecipitation, ראה שלב 5]
8. הכן מניות קפוא של שורות תאים משובטים רצויים ¹² ולאחסן אותם בחנקן נוזלי עד לשימוש.

2 קווים סלולריים HEK293 גידול בבקבוקי רולר

להכנה בקנה מידה גדולה של מתחמי INO80, תאי תרבות ב10 - 20 בקבוקים גליליים; תשואה אופיינית מכל בקבוק רולר היא ~ 1 מ"ל של תאים ארוזים.

1. לכל בקבוק רולר, להוסיף 200 מ"ל DMEM, 5% גלוטמין, ו10% עגל בסרום, ללא B. hygromycin
2. העבר את כל התאים מצלחת 15 סנטימטר כמעט ומחוברות אחת לכל בקבוק רולר
3. בקבוקי רולר מקום לחממת בקבוק רולר 37 מעלות צלזיוס ולסובב ב0.2 סל"ד.
4. , ברגע שתאים מגיעים confluency ~ 70% לשפוך ותשאיר את המדיום.
5. להוסיף ~ PBS 50 מ"ל של קרח קר לכל בקבוק. מחזיק בקבוקים אופקיים, בעדינות מערבולת כדי לשחרר את monolayer התא.
6. להעביר את תאי resuspended 250 plast מ"לבקבוקי ic חרוטי ומניחים על קרח.
7. יש לשטוף את בקבוקי רולר עם PBS נוסף, העברתו ברצף מבקבוק לבקבוק. כאשר פתרון שטיפה כבר לא ברור (בדרך כלל לאחר שנהג לשטוף כ -5 בקבוקים), להוסיף אותו להשעית התא.
8. תאים גלולה על ידי צנטריפוגה ב XG 400 עבור 10 דקות.
9. בעדינות resuspend תאי PBS, לשלב אותם לתוך בקבוק חרוטי 250 מ"ל אחד, ולשמור על קרח עד עיבוד נוסף.

.3 מציאה בתיווך siRNA של יחידות משנה INO80 בתאים המבטאים נוסף מתויג דגל INO80 מקטע

כדי להשיג subcomplexes INO80 חסר מקטע בודד, השימוש FLAG-immunopurification לטהר מתחמי INO80 מתאי siRNA שטופלו או תאים ביציבות להביע shRNA. SiRNA "הפוך" פרוטוקול (קטן מפריע RNA) transfection מתואר כאן הוא מותאם לHEK293 תאים גדלו ב15 מנות סנטימטר. הפרוטוקול הוא למנה 15 סנטימטר אחד של תאים וshoULD לשנותם עד בהתאם בהתאם למספר התאים הדרושים. כדי להכין כמויות יוכימית שימושיות של מורכב INO80 מהתאים שטופל siRNA, יש בהיקף של עד תרבויות גדלו ב40 15 מנות סנטימטר; אלה יניבו כ 2 - 4 מ"ל של תא גלולה ארוז.

1. לגדל תאי HEK293 ביציבות להביע למקטע הרצוי של מתחם INO80 לconfluency הקרובה ב15 מנות סנטימטר.
2. הוספת נפח של של חיץ siRNA resuspension (20 מ"מ KCl, 6 מ"מ HEPES-pH 7.5, ו0.2 מ"מ MgCl ₂₎ מספיק כדי להכין את פתרון מניות 50 מיקרומטר של siRNA לצינור המכיל siRNA lyophilized. פיפטה הפתרון למעלה ולמטה כמה פעמים ודגירה על nutator ל30 דקות ב RT כדי להבטיח siRNA נמס לגמרי.
3. הכן קוקטייל transfection המכיל siRNAs ומגיב transfection. מערבבים 10 μl של פתרון מניות 50 מיקרומטר siRNA עם 32 μl Lipofectamine RNAiMAX ולהוסיף אותו ל4 מ"ל של Opti-MEM מופחת סרום בינוני עם ערבוב עדין מאוד; אלנמוכים כל ריאגנטים לאזן לRT לפני השימוש.
4. דגירה את התערובת על RT למשך 30 דקות.
5. הכן תאי FLP-In HEK293 ביציבות להביע מקטע INO80 הרצוי עבור transfection.
   1. במהלך הדגירה של שלב 3.4, לשטוף תאים ב15 מנות סנטימטר פעם אחת עם RT PBS.
   2. לאחר הסרת PBS, טיפול בתאים עם טריפסין 1 מ"ל רק עד שהם מתחילים להרים את הצלחת.
   3. מייד להוסיף 10 מ"ל של מדיום מלא (+ 5% FBS + 10% גלוטמין DMEM) לtrypsinized תאים ומערבבים בעדינות. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 למשך 5 דקות ב RT.
   4. Resuspend התא גלולה ב ~ בינוני מלא 4 מ"ל, ולספור את resuspension התא באמצעות haemocytometer.
   5. לדלל תאים עם מדיום מלא לריכוז של ~ 5.4 x 10 ⁶ מ"ל /.
6. לכל מנה 15 סנטימטר, להוסיף 15 מ"ל מדיום תרבות השלם ואחריו קוקטייל transfection 4 מ"ל. מערבולת בעדינות על מנת להבטיח את הקוקטייל הבינוני וtransfection הם Thoroughly מעורב. לבסוף, להוסיף אחד מ"ל של השעיה תא ושוב לערבל בעדינות לפיזור תאים באופן אחיד.
7. לאחר 60 שעות של תרבות ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור, להסיר בעדינות בינונית, תאים גלולים בקרח הקר PBS, ופנה מייד להכנת תמציות גרעיניות.

.4 הכנת תמציות גרעיניות

הליך זה שונה מהפרוטוקול של ¹³ Dignam וניתן לשנותם למעלה או למטה, תלוי בגודל של החל כדורי תא. בדרך כלל, 1 מ"ל של תשואות תא גלולה ארז 1 מ"ל של תמצית גרעינית סופית. כל המאגרים צריכים להיות קר כקרח, ויש לבצעו בכל הצעדים בחדר קר או בקרח, אם חדר קר מתאים אינו זמין.

1. בידוד של גרעינים:
   1. בעדינות להעביר תאים מתאימים בגודל (15 או 50 מ"ל) סיים את לימודיו צינור וספין חרוטי XG ב 1000 10 דקות ב 4 ° C.
   2. הסר את supernatant, ולמדוד את הנפח של pel התא ארוזבואו. 1 מ"ל של תאים ארוזים מתאים ל~ 3 x 10 ⁸ HEK293 תאים.
   3. הוסף 5 כרכים גדושים תא של הצפת (10 HEPES מ"מ, pH 7.9, 1.5 מ"מ MgCl _2, 10 מ"מ KCl וטרי הוסיף 1 מ"מ DTT, 200 PMSF מיקרומטר, ו1: 1,000 קוקטייל מעכבי פרוטאז). Resuspend התא גלולה ידי pipetting העדין.
   4. לדגור על קרח במשך בדיוק 10 דקות.
   5. גלולה התאים XG ב 1000 10 דקות ב 4 ° C, ולהסיר את supernatant.
   6. גודלו של התא גלולה צריך להגדיל עד פי 2 במהלך הדגירה בא המאגר
   7. Resuspend התאים בשני כרכי תא צפופים של חיץ, ולהעביר את ההשעיה התא לhomogenizer רקמות Dounce בגודל מתאימה. אם מתחיל עם פחות מ 2 מ"ל של תאים ארוזים, להשתמש homogenizer 7 מ"ל; ל2 - תאים ארוזים 4 מ"ל, להשתמש homogenizer 15 מ"ל; ול10 או יותר מ"ל של תאים ארוזים, להשתמש homogenizer 40 מ"ל.
   8. Homogenize ההשעיה התא עם העלי הזכוכית הרופף של האו"ם homogenizer Douncetil 90% מהתאים להכתים חיובי עם 1% trypan כחולים.
   9. להעביר את ההשעיה לצינור 45 מ"ל במהירות גבוהה צנטריפוגות ספין על 25,000 XG ל20 דקות ב 4 ° C בהרוטור JA-17 או דומה (ראה טבלה של חומרים / ציוד).
   10. מהגלולה הגרעינית, להסיר את supernatant, אשר מכיל חלבונים או חלבונים שלדלוף החוצה של הגרעין במהלך חלוקה cytosolic.
2. חילוץ גרעינים עם מלח:
   1. הוסף חוצץ C (20mm HEPES, pH 7.9, גליצרול 25%, 1.5 מ"מ MgCl _2, 0.2 mM EDTA, והוסיף טרי 1 מ"מ DTT, 200 PMSF מיקרומטר, ו1: 1,000 מעכבי פרוטאז קוקטייל) לגלולה הגרעינית; להשתמש 2.5 מ"ל הצפת C לכל 3 מ"ל של החל ארז נפח תא (~ 1 x 10 ⁹ תאים).
   2. באמצעות מוט זכוכית או פיפטה, לעקור את גלולה הגרעינית מהקיר של הצינור ולהעביר את התערובת כולה לhomogenizer Dounce בגודל מתאים.
   3. Resuspend הגרעינים על ידי שמאחד התערובת דואר עם שתי משיכות של העלי LOOSE.
   4. העברת החלק הגרעיני resuspended לתוך כוס מקוררת. בחר כוס כך שההשעיה ימלא את הכוס לפחות 0.5 סנטימטר עמוק.
   5. כדי לחלץ חלבונים גרעיניים מהכרומטין או מבנים בלתי מסיסים אחרים, להגדיל בהדרגה את ריכוז מלח של ההשעיה ל0.42 M NaCl על ידי תוספת dropwise של 5 M NaCl תוך ערבוב ההשעיה עם מוט פיפטה או זכוכית על קרח בעדינות; פעם אחת כל 5 M NaCl נוסף, הפתרון צריך להיות צמיג מאוד או כמו ג'ל. חשב את הנפח של 5 M NaCl צריך להביא הפתרון לריכוז סופי של 0.42 M NaCl על פי הנוסחא הבאה:
      
   6. להעביר בזהירות את ההשעיה צמיגה ל10 מ"ל צינורות פוליקרבונט ל70.1 הרוטור Ti סוג (או שווי ערך) בקבוקי פוליקרבונט או 70 מ"ל לo Ti סוג 45r הרוטור דומה (ראה טבלה של חומרים / ציוד). לאטום היטב עם parafilm אם באמצעות 10 צינורות מ"ל או עם הרכבה כובע אם באמצעות 70 מ"ל בקבוקים.
   7. לאט לאט רוק הצינורות האטומים על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמצעות nutator.
   8. ספין הדגימות בסוג 45 Ti או 70.1 הרוטור Ti ל30 דקות ב 120,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס.
   9. העבר את supernatant לצינור פלסטיק בודד או בקבוק. supernatant זה התמצית הגרעינית, והגלולה מכילה הכרומטין ופסולת גרעינית אחרת.
   10. מחלקים את התמצית הגרעינית לaliquots בגודל נוח, להקפיא אותו בחנקן נוזלי, ולאחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס.

.5 טיהור Immunoaffinity של INO80 האדם או INO80 Subcomplexes

1. להפשיר תמצית גרעינית קפואה, צינורות מקום המכילים את התמצית על צינורות benchtop או גלגול בין ידיים עד שהחומר הקפוא הופך סלארי. לאחר מכן למקם את הצינורות על קרח או בחדר הקר עד התמצית היא לגמרי לאגמגמתי.
2. העבר את התמצית מופשרת גרעינית לצינורות ultracentrifuge פוליקרבונט 10 מ"ל, והספין ב100,000 XG עבור 20 דקות ב 4 ° C בהרוטור Ti סוג 70.1 או שווה ערך כדי להסיר כל משקע שאולי נוצר במהלך מחזור ההפשרה הקפאה.
3. מעבירים את supernatant לצינור חרוטי 15 מ"ל. להוסיף קוקטייל DTT, PMSF, ומעכבי פרוטאז טרי לריכוזים סופיים של 1 מ"מ DTT, 200 PMSF מיקרומטר, ו1: קוקטייל 1,000 מעכבי פרוטאז.
4. כדי להכין agarose אנטי FLAG לimmunopurification, להעביר 200 μl של סלארי 50% מחרוזי agarose אנטי FLAG לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל באמצעות P200 או פיפטה הדומה עם קצה שממנו הסוף נותק עם אזמל נקי או סכין גילוח.
5. גלולה חרוזים על ידי צנטריפוגה בmicrocentrifuge המעבדתיים ב8,000 XG למשך 30 שניות. הסר את supernatant, ולשטוף את החרוזים על ידי resuspending את החרוזים 1 מ"ל של חיץ Lys450, וגלולת חרוזים ב8,000 XG למשך 30 שניות. שטוף את bEADS עוד פעמיים.
6. Resuspend חרוזים שטפו אנטי FLAG agarose בכ -100 μl של התמצית הגרעינית באמצעות P200 או פיפטה נפח מתכווננת הדומה עם קצה שממנו הסוף נותק עם אזמל נקי או סכין גילוח ו, תוך שימוש באותה העצה, העברה חרוזים resuspended לצינור חרוטי 15 מ"ל מכיל התמצית. חזור כמה פעמים עד שכל חרוזים הועברו לצינור 15 מ"ל.
7. דגירה את תערובת תמצית / חרוז ל4 שעות ב 4 ° C עם סיבוב איטי על הכתף מעבדה. אופציונאלי: כלול Benzonase בריכוז של 25 מ"ל / יחידות כדי להסיר את זיהום DNA.
8. לאסוף את agarose FLAG על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 למשך 5 דקות ב 4 ° C..
9. Resuspend ב10 מ"ל Lys450 לשטוף, דגירה 5 דקות ב 4 ° C עם הנדנדה עדינה על nutator. גלולה חרוזים ב1,000 XG למשך 5 דקות ב 4 ° C..
10. Resuspend ב100 - של Lys450 וחרוזים העברה 150 μl לצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. Continue לשטוף את צינור חרוטי 15 מ"ל עם 100 - של Lys450 150 μl עד שכל חרוזים הועברו לצינור microcentrifuge.
11. ספין למטה חרוזים ב8,000 XG למשך 30 שניות על 4 מעלות צלזיוס בmicrocentrifuge. לשטוף שלוש פעמים יותר עם ​​1 מ"ל Lys450 ופעם אחת עם חיץ EB100 1ml (10 HEPES מ"מ pH 7.9, גליצרול 10%, 100 mM NaCl, 1.5 מ"מ MgCl _2, 0.05% TritonX-100, והוסיפו טרי 1 מ"מ DTT, PMSF 200 מיקרומטר , ו1: 1,000 קוקטייל מעכבי פרוטאז).
12. לelute חלבונים קשורים, להוסיף למאגר EB100 200 μl מכיל 0.25 מ"ג / מ"ל ​​1x פפטיד FLAG. דגירה 30 דקות ב 4 ° C כל על nutator.
13. גלולה חרוזים ב8,000 XG למשך 30 שניות על 4 מעלות צלזיוס בmicrocentrifuge. מעבירים את supernatant, המכיל קומפלקס INO80 eluted, לצינור microcentrifuge טרי.
14. חזור על elution ארבע פעמים יותר, וברכה כל supernatants לתוך צינור אחד.
15. כדי להסיר כל חרוזים FLAG-agarose השיורי משבריר חלבון eluted,להעביר את eluate באמצעות טור ספין ריק.
16. לרכז את חלק חלבון eluted ~ פי 10 באמצעות מכשיר אולטרה צנטריפוגלי מסנן (50,000 הפסקת משקל מולקולרי).
17. כדי להסיר את הפפטיד הדגל, לעבור ברצף שבריר חלבון המרוכז באמצעות שתי עמודות desalting.
18. מחלקים את חלק החלבון המטוהר, desalted ל20 aliquots μl, הוקפא בחנקן נוזלי, ומאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
19. לנתח את ההרכב למקטע של INO80 או subcomplexes INO80 על ג'לים מוכתם כסף או על ידי מערבי סופג, ולהעריך הריכוזים שלהם על ידי מערבי סופג חצי כמותית באמצעות הכנות של יחידות משנה INO80 רקומביננטי של ריכוז ידוע כסטנדרטים.

תוצאות

איור 1 מציג תרשים זרימה המסכם את הנהלים המשמשים לייצור, לטהר, ולאפיין מתחמי הכרומטין INO80 תלוי ATP אנושיים שיפוץ.

כפי שמודגם באיורים 2 ו -3, נהלים אלה מאפשרים את הדור של שני subcomplexes INO80 הסוג וINO80 הפראי שאין תת יחידות שונות, ובכך מאפשרים ניתוחים ביוכימיים הבאים של התרומה של יחידות משנה חסרות אלה לפעילות האנזימטית של INO80. איור 2 מתאר שת...

דיון

מחקרים מבניים ותפקודיים של רב למקטע מתחמי שיפוץ הכרומטין יונקים מאאוקריוטים גבוהים כבר הקשו על ידי הקושי של הכנה ביוכימית כמויות שימושיות של מתחמים כגון המכילים יחידות משנה שעברו מוטציה או חסרי יחידות משנה מסוימות לגמרי. ישנם מספר של מכשולים טכניים: ראשית, מניפולציה גנטית בתאי יונקים הייתה מאתגרת מבחינה טכנית ודורש זמן רב. שלא כמו תאי שמרים, הגנום שניתן לערוך בקלות וממוקדת תוך שימוש בטכניקות recombineering, הגנום של היונקים הוא יותר מבחינה מבנית מורכב ופחות רגיש להתערבויות recombi...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Dualbecco's Modified Eagle	Medium Cellgro	10-013-CV
Glutamax-I (גלוטמין מיוצב)	Life Technologies	35050-079
סרום בקר עוברי	SAFC	12176C
FuGENE6 מגיב טרנספקציה	Promega	E2312
Hygromycin B, סטרילי ב-PBS	AG Scientific	H-1012-PBS
pcDNA5/FRT וקטור	Life Technologies	V6010-20
Flp-In HEK293 תאים	Life	Technologies R780-07
pOG44 Flp-Recombinase Expression	Vector Life Technologies	V600520
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	F2426
סרום עגל	SAFC	12138C
TARGETplus SMARTsiRNA בריכה	Dharmacon / Thermo Scientific	שונים
5x siRNA מאגר השעיה	מחדש Dharmacon / Thermo Scientific	#B-002000-UB-100
Lipofectamine RNAiMAX	Life Technologies	13778
Opti-MEM סרום מופחת	טכנולוגיות חיים בינוניים	51985-091
PBS	Cellgro	45000	VWR
TrypLE (trypsin)	Life Technologies	12604
1x FLAG Peptide	Sigma	F3290
Micro Bio-Spin Chromatography Column	Bio-Rad	737-5021
Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO)	Amicon	UFC805024	Fisher Scientific
Zeba Desalting Columns	Thermo Scientific	89882
נוגדן נגד FLAG M2, נוגדן	עכבר Sigma	F3165
Anti-FLAG M2, ארנב	Sigma	F7425
מעכב פרוטאז קוקטייל	Sigma	P8340
benzonase	Novagen	70664
ציוד
רוטור JS-4.2 ברוטור J6	Beckman-Coulter	339080
JA-17	בקמן-קולטר	369691
צינורות פוליקרבונט 10 מ"ל	בקמן-קולטר	355630
בקבוקי פוליקרבונט 70 מ"ל	בקמן-קולטר	355655
סוג 45 רוטור Ti	בקמן-קולטר	339160
סוג 70.1 רוטור Ti	בקמן-קולטר	342184
BD קליי אדמס נואטור מיקסר	BD דיאגנוסטיקה	15172-203	VWR
Glas-Col צינור/בקבוקון מסובב	Glas-Col	099A RD4512
PCR תרמי cycler PTC 200	MJ מחקר	PTC 200
רולר בקבוק אינקובטור	Bellco ביוטכנולוגיה	353348
Immobilon-FL העברת ממברנה 7 x 8.4	Millipore	IPFL07810
משומן 1.5 מ"ל מיקרוצנטריפוגה	צינורותקוסטאר	3207