מבחני ביוכימיים לניתוח פעילויות של ATP תלוי הכרומטין שיפוץ אנזימים

סיכום

כאן אנו מתארים מבחנים ביוכימיים שניתן להשתמש בהם כדי לאפיין אנזימים לעיצוב מחדש של כרומטין תלויי ATP על יכולותיהם 1) לזרז החלקה של נוקלאוזום תלוי ATP, 2) לעסוק במצעי נוקלאוזום, ו-3) הידרוליזה של ATP באופן תלוי נוקלאוזום או DNA.

תקציר

חברים במשפחת SNF2 של ATPases מתפקדים לעתים קרובות כמרכיבים של קומפלקסים של שיפוץ כרומטין מרובי תת-יחידות המווסתים את הדינמיקה של הנוקלאוזומים ואת נגישות ה-DNA על ידי זירוז שיפוץ נוקלאוזומים תלוי ATP. ניתוח ביוכימי של התרומות של יחידות משנה בודדות של קומפלקסים כאלה לתגובת שיפוץ הכרומטין הרב-שלבית התלויה ב-ATP דורש שימוש במבחנים המנטרים את ייצור תוצרי התגובה ומודדים את היווצרותם של תוצרי ביניים לתגובה. פרוטוקול JOVE זה מתאר בדיקות המאפשרות למדוד את הפעילויות הביוכימיות של קומפלקסים או תת-קומפלקסים של שיפוץ כרומטין המכילים שילובים שונים של תת-יחידות. שיפוץ כרומטין נמדד באמצעות בדיקת הזזה של נוקלאוזום תלויה ב-ATP, המנטרת את תנועת הנוקלאוזום על מולקולת DNA בשיטה מבוססת בדיקת שינוי ניידות אלקטרופורטית (EMSA). פעילות קשירת נוקלאוזומים נמדדת על ידי ניטור היווצרות מחדש של מונונוקלאוזומים קשורים מורכבים בשיטה דומה מבוססת EMSA, ופעילות ATPase תלויה ב-DNA או נוקלאוזום נבדקת באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC) כדי למדוד את קצב ההמרה של ATP ל-ADP ופוספט בנוכחות DNA או נוקלאוזומים. באמצעות מבחנים אלה, ניתן לבחון את הפונקציות של יחידות משנה של קומפלקס שיפוץ כרומטין על ידי השוואת הפעילויות של הקומפלקס השלם לאלה שחסרות תת-יחידה אחת או יותר. קומפלקס שיפוץ הכרומטין האנושי INO80 משמש כדוגמה; עם זאת, ניתן להתאים את השיטות המתוארות כאן למחקר של מתחמי שיפוץ כרומטין אחרים.

מבוא

מתחמי שיפוץ הכרומטין משפחת SNF2 כוללים מקטע ATPase מרכזי כמו ^SNF2-1,2. פונקציה מסוימת כמו SNF2-ATPases כאנזימים למקטע אחד, בעוד שאחרים לתפקד כמקטע קטליטי של מתחמים רב למקטע גדולים יותר. הבהרת המנגנונים המולקולריים שבאמצעותו כל אחד מיחידות המשנה של הכרומטין מתחמי שיפוץ לתרום לפעילויות שלהם דורש את היכולת לבצע מבחני ביוכימיים שלנתח את תהליך שיפוץ.

שיפוץ הנוקלאוזום תלוי ATP על ידי מורכב INO80 האנושי ואנזימי הכרומטין שיפוץ אחרים יכול להיות שחזה כתהליך רב שלבים שמתחיל בכריכה של אנזים שיפוץ לnucleosomes, ואחרי הפעלה של דנ"א ו / או ATPase הנוקלאוזום תלוי, טרנסלוקציה של אנזים שיפוץ על DNA nucleosomal, ומיצוב מחדש סופו של הדבר nucleosomes ^1,2. הבנת הפרטים המולקולריים של r תהליך שיפוץ הכרומטין תלוי ATPequires נתיחה של תגובת שיפוץ לשלבים הבודדים שלה והגדרתה של תרומתם של יחידות משנה נפרדות של מתחם שיפוץ הכרומטין לכל צעד של התגובה. ניתוח מסוג זה דורש היכולת לנתח שיפוץ הנוקלאוזום ופעילויות אחרות באמצעות מצעים מולקולריים מוגדרים במבחנה.

בפרוטוקול יופיטר קודם, שתארנו תהליכים המשמשים ליצירת מתחמי INO80 שיפוץ הכרומטין וsubcomplexes עם יצירות למקטע מוגדרים ^3. כאן, אנו מציגים שלושה מבחני ביוכימיים שיאפשר ניתוח כמותי של הנוקלאוזום המחייב, דנ"א וATPase מופעל הנוקלאוזום, ופעילויות שיפוץ הנוקלאוזום הקשורים למתחמים כאלה.

פרוטוקול

מבחני Remodeling הנוקלאוזום .1 תלוי ATP

כדי למדוד ATP תלוי פעילויות הנוקלאוזום שיפוץ, immunopurified INO80 או subcomplexes INO80 מודגרת עם ATP ומצע mononucleosomal, המכיל הנוקלאוזום יחיד ממוקם בקצה אחד של קטע DNA 216-BP, שכותרתו-P ^32. תוצרי התגובה לאחר מכן נתון לאלקטרופורזה בג'ל פולי-acrylamide ילידים.

1. על מנת ליצור את, בר ³² שכותרתו P '601' DNA, להגביר מpGEM-3Z-601 ⁴ שבר 216 נ"ב DNA המכיל 601 רצף מיצוב הנוקלאוזום מיקום סוף, באמצעות oligonucleotides 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG ו5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG כ קדימה ולאחור פריימרים.
   1. הגדר את תגובת PCR 100 μl כפי שמתואר בטבלה 1.
   2. לבצע PCR התגובות בCycler תרמית באמצעות התכנית הבאה: 1 דקות ב96 מעלות צלזיוס, followeד על ידי 45 שניות על 94 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב57 ° C, 60 שניות ב72 מעלות צלזיוס במשך 30 מחזורים; כלה ב7 דקות ב72 מעלות צלזיוס.
   3. לאחר תגובת PCR נגמרה, להסיר את נוקלאוטידים מאוגדים על ידי העברת תוצרי התגובה פעמיים באמצעות עמודות ספין nuclease חינם.
   4. לרוץ 5 μl של מוצר PCR המטוהר בagarose ג'ל 1.2% כדי לאשר שתגובת PCR שנוצרה קטע DNA נ"ב הרצוי ~ 216.
   5. לדלל 5 μl של מוצר PCR המטוהר פי 20, ולמדוד את ריכוז DNA באמצעות ספקטרופוטומטר UV. התשואה הממוצעת היא ~ 40 ng / μl.
   6. מדוד את הרדיואקטיביות של 1 μl של מוצר PCR המטוהר במונה נצנץ. להעריך את יעילות התיוג על ידי חישוב עותקים לדקה / ng. תגובת תיוג מוצלחת צפויה להניב ~ 15,000 עותקים לדקה / ng של 601 קטע DNA.
2. העבר את nucleosomes תא הלה על DNA 601 שכותרתו באמצעות שיטת דילול סדרתי ^5.
   1. לערבב 2 pmol של³² קטע DNA 601 עם כותרת P 6 מיקרוגרם של nucleosomes הלה (שהוכן כמתואר ⁵⁾ ב50 μl של מאגר המכיל 1.0 M NaCl, 10 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.1 מ"מ PMSF, ו1 מ"מ DTT ולדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
   2. רצף לדלל את התערובת ל0.8 M, 0.6 M, ו0.4 M NaCl על ידי דילול עם 12.5 μl, 20.8 μl, ו41.6 μl, בהתאמה, של 10 מ"מ טריס-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.1 מ"מ PMSF, ו 1 מ"מ DTT, עם דגירה 30 דקות ב30 מעלות צלזיוס לאחר כל דילול.
   3. יתר על כן לדלל את התערובת ל0.2 M ולאחר מכן ל0.1 M NaCl על ידי תוספת של 125 μl ולאחר מכן 250 μl מאותו המאגר המכיל 0.1% Nonidet P-40, גליצרול 20%, ו200 מיקרוגרם / מ"ל ​​BSA, עם דגירה 30 דקות ב30 מעלות צלזיוס בין שני דילולים הסופיים. אחסן את מצע mononucleosome ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים.
3. לבצע תגובות הנוקלאוזום הזזה ATP תלויות בנפח כולל של 10 μl. המחשבהרכיבי ction מפורטים בטבלה 2. מאז ריכוז NaCl האופטימלי לפעילות שיפוץ הנוקלאוזום INO80 הוא ~ 50 mM NaCl (תוצאות לא פורסמו), להתאים את הריכוז הכולל של NaCl בכל תגובה ל50 מ"מ, תוך לקיחה בחשבון את כמות NaCl הכלולה ב הכנות של nucleosomes ואנזים.
   1. לפני שיתחיל בלהגדיר את מבחני, להטיל ג'לי פולי-acrylamide ילידים (18 x 16 סנטימטר). כדי להכין ג'ל יחיד המכיל 5% acrylamide (acrylamide: bisacrylamide 37.5: 1), TBE 0.5x (45 borate מ"מ טריס, 1 mM EDTA), 0.01% persulfate אמוניום (APS), ו0.001% N, N, N', -tetramethylethylenediamine N'(TEMED), לערבב את החומרים המפורטים בטבלה 3. אפשר ג'ל לפלמר לפחות שעה 2 ב RT.
   2. בינתיים, לכל תגובה שיש לבצע, לשלב בצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge מראש צונן siliconized ~ 20 ננומטר INO80 או subcomplex INO80 (שהוכן כמתואר ³⁾ עם סכום של חיץ EB100 ( לוח 4) מספיק כדי לתת נפח של 4.75 μl. מייד מחדש להקפיא כל שברים המכיל INO80 שנותרו בקרח יבש אבקה או חנקן נוזלי.
   3. הגדר את קוקטייל הורים עם שאר החומרים, גמלון בפקטור של "X" (כאשר X = מספר כולל של תגובות +3). הסכום של כל מרכיב הנחוץ לתגובת 10 μl בודדת מופיע בטבלה 5; המתכון צריך להיות בקנה מידה גדול בהתאם למספר של תגובות שיש לבצע. מערבבים היטב על ידי הקשה על הצינור או על ידי pipetting למעלה ולמטה עם Pipetman ולסובב את הצינור לכמה שניות בmicrocentrifuge המעבדתיים.
   4. לוותר 5.25 μl של קוקטייל האדון לכל אחד מצינורות התגובה הוקמו בצעד 1.3.2. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. התחל את התגובות על ידי העברת צינורות תגובה לאמבטית גוש חום C 30 מעלות או מים ודגירה עבור שעה 2.
   5. בינתיים, להכין את 'הסרת לערבב' קוקטייל המכיל DNA מתחרהוnucleosomes, גמלון בפקטור של X (X = מספר הכולל של תגובות + 4). הסכום של כל מרכיב הדרוש כדי להכין 1.5 μl הסרת תערובת לתגובה יחידה מופיע בלוח 6; המתכון צריך להיות בקנה מידה גדול בהתאם למספר מבחני שיש לבצע.
   6. לסיים תגובות על ידי הוספת 1.5 μl של תמהיל הסרת. מערבבים היטב, ספין למטה, ולדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות נוספות.
   7. בינתיים, לפני לרוץ ג'ל polyacrylamide הילידים ביחידת אלקטרופורזה אנכית ב100 V ל30 דקות ב 4 ° C, באמצעות TBE 0.5x כחיץ פועל עם בר ומערבב מגנטי בתוך החדר התחתון כדי לשמור על זרימת דם למאגר קבועה.
   8. כדי לטעון את המדגם, להוסיף 2.5 μl של טעינת צבע המכיל 3x TBE, גליצרול 30%, 0.25% כחול bromophenol, ו0.25% Cyanol FF קסילן. מערבבים היטב, ספין בקצרה הדגימות, ולהעמיס אותו על ג'ל באמצעות עצות לטעינה.
   9. הפעל את הג'ל על 200 V ל4.5 שעות על 4 מעלות צלזיוס עם זרימת חיץ.
   10. כדי לזהות את האות, להעביר את הג'ל לערימה של שני גיליונות של נייר סינון. לעטוף את נייר הסינון עם ג'ל על גבי באמצעות ניילון נצמד ברור, ולאחר מכן לחשוף אותו למסך זרחן האחסון ב 4 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי.
   11. סרוק את המסך עם מערכת סורק הדמיה איזוטופ ולנתח את הנתונים באמצעות תוכנה מתאימה.

2 מבחני כריכת Mononucleosome

לassay הזיקה המחייבת של מורכב INO80 ניתנו לmononucleosomes, לבצע Shift electrophoretic ניידות Assay (Emsa) באמצעות מצע mononucleosomal שנוצר בשלב 1.2.

1. הגדר את תגובת תערובות לכריכה מבחני כפי שתואר עבור מבחני שיפוץ הנוקלאוזום אבל להשמיט ATP ותמהיל הסרת מהתגובות; לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
2. הוסף 2.5 μl של טעינת צבע לכל תערובת תגובה, ותחול על ג'ל polyacrylamide ילידים המכיל 3.5 acrylamide% (acrylamide: bis 31), 1% גליצרול, TBE 0.5x, APS 0.01%, ו0.001% TEMED: 7.5.
3. באמצעות TBE 0.5x כחיץ פועל, הפעל את הג'ל על 200 V ל2.5 שעה על 4 מעלות צלזיוס עם זרימת חיץ ולחשוף למסך זרחן האחסון.

.3 דנ"א והנוקלאוזום תלוי מבחני ATPase

לבצע מבחני ATPase בתערובות תגובת 5 μl מכילות 20 מ"מ טריס-HCl (pH 7.5), 60 mM NaCl, 6.6 מ"מ MgCl _2, 0.8 mM EDTA, 0.015% Nonidet P-40, גליצרול 2.5%, 0.1 מ"ג / מ"ל BSA, 1 מ"מ DTT, 0.1 מ"מ PMSF, 2 מ"מ ATP, 2 μCi של [P ³² α-] ATP (3,000 Ci / mmol). עבור כל מורכב INO80 או כמות מורכבת INO80 להיות assayed הקים שלוש תגובות מקבילות, חיץ EB100 מכיל אחד למדוד דנ"א או הנוקלאוזום עצמאי ATPase, אחד מכיל סגורות פלסמיד דנ"א העגול (נ"ב 5,000, ~ 30 ננומטר) כדי למדוד דנ"א ATPase תלוי, ואחד המכיל oligonucleosomes הלה (~ 185 ננומטר) כדי למדוד ATPase הנוקלאוזום תלוי. הגדר את כל התגובות על קרח.

1. עבור כל תגובה, לשלב 10-50 ננומטר של subcomplexes INO80 או INO80 immunopurified עם סכום של חיץ EB100 מספיק כדי לתת נפח של 2.2 μl ב1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge משומן מראש צונן. מייד מחדש להקפיא כל שברים המכיל INO80 בקרח יבש אבקה או חנקן נוזלי.
2. הגדר את הקוקטייל שני. הסכום של כל מרכיב הנחוץ לתגובה יחידה מופיע בלוח 7. בהיקף של עד המתכון לפי קנה מידה על ידי גורם של 3 (X + 2) +1, כאשר X = מספר הכנות INO80 להיות assayed.
3. כדי להכין מאגר המכיל 'משנה הקוקטיילים' בלבד, DNA, או nucleosomes, לוותר 2.5 (X + 2) μl של קוקטייל האב לשלושה צינורות נפרדים. הוספת 0.3 (X + 2) μl של שתי EB100, DNA הסגור המעגלי פלסמיד (1.5 מיקרוגרם / μl), או (1.5 מיקרוגרם / μl) oligonucleosomes הלה ומערבבים היטב.
4. לוותר 2.8 μl של תת הקוקטייל המתאים לצינורות תגובה המכיל אנזים שהוקמו בstep 3.1. פיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לערבב; למנוע החדרת בועות.
5. כדי להתחיל את תגובות, להעביר את צינורות תגובה לגוש חום C 30 מעלות.
6. לאחר 5, 15, 30, ו60 דקות של דגירה, לזהות 0.5 μl של כל תערובת תגובה על כרומטוגרפיה שכבה דקה polyethyleneimine תאית צלחת (TLC) (20 x 10 סנטימטר) בקו ישר לפחות 1.5 ס"מ מהקצה התחתון . מייד לחזור צינורות תגובה לגוש חום C 30 מעלות ניתן לקחת נקודות זמן כל כך רבות מצינור אחד. אחרי שהבחנתי ב, לייבש את צלחות TLC באמצעות מכת מייבש.
7. העבר את צלחות TLC לתא זכוכית המכיל מספיק פוספט 0.375 M אשלגן (pH 3.5) כדי לאפשר 0.5 סנטימטר תחתית צלחת TLC להיות שקוע בפתרון.
8. כסה את התא, ולפתח עד החלק הקדמי של השלב הנוזלי מגיע העליון של צלחות TLC. מיידי לייבש את הצלחות באמצעות מכת מייבש ביסודיות.
9. לחשוף את צלחות TLC המיובשים למסך זרחני אחסון ב RT.סרוק את המסך עם מערכת סורק הדמיה איזוטופ ולקבוע את סכום מצע ATP רדיואקטיבי לבין מוצר ADP.
10. כדי לחשב את הסכום של ATP הידרוליזה, להכפיל את ATP% הידרוליזה על ידי הכמות של הווה ATP בתערובת התגובה החל שימוש בנוסחה הבאה: ATP pmol הידרוליזה ATP pmol = 10 במתחילים x תגובה [ADP / (ATP + ADP)]

תוצאות

הנתונים מראים תוצאות נציג של מבחני ביוכימיים משמשים כדי לאפיין פעילויות INO80, כוללים הנוקלאוזום הזזה (איור 1) ומחייב (איור 2) מבחני ודנ"א או מבחני הנוקלאוזום תלוי ATPase (איור 3).

הניסוי שמוצג באיור 1 משווה את היכולת של מתחמי INO80 שלמים מטוהר באמצעות FLAG-Ies2 או FLAG-INO80E ושל INO80 subcomplexes מטוהר או דרך FLAG-Ino80ΔN או Ino80ΔNΔHSA ל...

דיון

כדי להבטיח ששיפוץ הנוקלאוזום ופעילויות ATPase שאנו רואים במבחנים תלויים בפעילות הקטליטית של מתחמי INO80, ולא על זיהום ו / או אנזימי ATPase שיפוץ, אנו הנוקלאוזום באופן שגרתי assay שיפוץ ופעילות ATPase של גרסאות כקטליזאטור פעילים של מתחמי INO80, מטוהר ב במקביל עם הסוג בר INO80 תוך שימוש באותו ההליך. גם תגובת ביקורת שלילית חסרת ATP צריכה להתבצע כאשר מנסים לאמוד את פעילות שיפוץ הנוקלאוזום כדי לבדוק את קיומו של זיהום ATP ו / או פעולות שיפוץ ATP-עצמאיות, אשר עלול לסבך את הפרשנות של ניסו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קוקטייל מעכב פרוטאז	Sigma	P8340
10x מאגר תגובת PCR	רוש מדע יישומי
רוש טאק DNA פולימראז	רוש מדע יישומי
NucAway עמודי ספין ללא נוקלאז'	חתול אמביון	# AM10070
ATP אולטרה-טהור	USB/Affymetrix	77241 25 UM
סרום בקר אלבומין	סיגמא	A9418
40% אקרילאמיד/ביס 37.5:1	אמרסקו	0254-500 מ"ל
DNA של זרע סלמון סוניק	GE Healthcare	27-4565-01
10% אמוניום פרסולפט (APS)	Thermo Scientific	17874
בנזונאז	חתול נובגן	. מס' 70664
dCTP, [α-32P]- 6,000 Ci/mmol	PerkinElmer	BLU013Z250UC
PCR מחזורי תרמי PTC 200	MJ Research	PTC 200
יחידת אלקטרופורזה אנכית Hoefer		SE600X-15-1.5
צינורות מיקרוצנטריפוגה משומנים 1.5 מ"ל	Costar	3207
מסך זרחן אחסון	דינמיקה מולקולרית	63-0034-79
נייר סינון 3 מ"מ	Whatman	28458-005	VWR
טייפון זרחןImager	GE Healthcare	8600
ImageQuant תוכנה	GE Healthcare	ver2003.02
TLC לוחות זכוכית, PEI-Cellulose F	Millipore	5725-7
Immobilon-FL ממברנת העברה 7 x 8.4	Millipore	IPFL07810
מד סקר לשימוש כללי עם חלון קצה או פנקייק GM (Geiger-Mueller) בדיקה	Biodex	דגם 14C