מדידות הכינון פונקציונלי ופעילות הערוץ של מטוהרים wildtype וחלבון CFTR Mutant

Paul D. W. Eckford; Canhui Li; Christine E. Bear

doi:10.3791/52427

מאמר שיטה

מדידות הכינון פונקציונלי ופעילות הערוץ של מטוהרים wildtype וחלבון CFTR Mutant

11.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52427

⸱

9 במרץ 2015

Paul D. W. Eckford¹ , Canhui Li¹ , Christine E. Bear¹^,²^,³

¹Programme in Molecular Structure and Function, Hospital for Sick Children, ²Department of Biochemistry, University of Toronto, ³Department of Physiology, University of Toronto

במאמר זה

סיכום

שתואר כאן הוא הליך מהיר ויעיל לכינון מחדש פונקציונלי של מטוהר wild-type וחלבון CFTR מוטציה המשמרת את פעילות לערוץ כלוריד הזה, שהוא פגום בסיסטיק פיברוזיס. זרימת יודיד מproteoliposomes מחדש בתיווכו של CFTR מאפשרת לימודים של פעילות ערוץ ואת ההשפעות של מולקולות קטנות.

תקציר

סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני מוליכות הרגולטור (CFTR) הוא חבר יוצרי ערוץ ייחודי של ATP כריכת קלטת superfamily (ABC) של מובילים. פעילות ערוץ זירחון וכלוריד התלוי נוקלאוטיד של CFTR נחקרה לעתים קרובות במערכות תא כולו וכערוצים בודדים בתיקוני קרום נכרתו. מוטציות הגורם לסיסטיק פיברוזיס רבים הוכחו לשנות פעילות זו. בעוד מספר קטן של פרוטוקולי טיהור פורסמו, שיטה מהירה לשיקום שומרת פעילות ערוץ ושיטה מתאימה ללימוד פעילות ערוץ אוכלוסייה במערכת מטוהרת היו חסרה. שיטות כאן מהירות מתוארות לטיהור וכינון מחדש תפקודי של חלבון CFTR באורך המלא לproteoliposomes של הרכב שומנים בדם מוגדר ששומר על פעילות כערוץ הליד מוסדר. שיטה זו הכינון מחדש יחד עם assay מבוסס שטף רומן של פעילות ערוץ היא מערכת מתאימה ללומד את מאפייני אוכלוסייה של ערוץ CFTR סוג בר ומוטציות הגורמות למחל F508del- וG551D-CFTR. באופן ספציפי, יש לו את השיטה שירות בלימוד ההשפעות הישירות של זירחון, נוקלאוטידים ומולקולות קטנות כגון potentiators ומעכבים על פעילות ערוץ CFTR. השיטות גם נתונים למחקר של ערוצים / מובילי קרום אחרים למצעי anionic.

מבוא

תחבורת כלוריד פני ממברנות הפסגה של תאי האפיתל ברקמות כגון בלוטות ריאות, מעי, הלבלב וזיעה מתווכת בעיקר על ידי סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני מוליכות הרגולטור (CFTR), ATP- וחבר-מוסדר זירחון של ABC (ATP- כריכת subfamily הקלטת) C של חלבונים בממברנה (הנסקרת ב ^1). כמו חברים אחרים של תת-משפחת Abcc, CFTR הוא חלבון גדול, רב-פורש נפרד קרום שקושר ATP בשני אתרי קישור נוקלאוטיד נוצרו בממשק של תחומים מחייב נוקלאוטיד (NBDs), בם יש לי פעילות ATPase צנועה באחת אתר. עם זאת, בניגוד לחברים תת-משפחת Abcc אחרים, CFTR התפתח כערוץ Cl מוסדר ייחודי ולא כטרנספורטר המומס פעיל.

מו....