פרוטוקול להערכת שינויים ברמות הנזק ל-DNA וביכולת תיקון ה-DNA שעלולים להיגרם על ידי הקרנה כרונית במינון נמוך in vivo בלימפוציטים של טחול עכבר, על ידי מדידת היסטון זרחני H2AX, מוצג סמן לשבירות דו-גדיליות של DNA, באמצעות זרימה ציטומטרית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מדידת נזק לדנ"א ותיקון בSplenocytes העכבר לאחר כרוני
במאמר זה
סיכום
תקציר
חשיפה לקרינה במינון נמוכה עלולה לייצר מגוון רחב של השפעות ביולוגיות שהם שונים בכמות ובאיכות מתופעות המיוצרות על ידי מינוני קרינה גבוהים. התמודדות עם שאלות הקשורות לבטיחות בריאות סביבתית, תעסוקתית וציבורית באופן ראוי ומוצדק מבחינה מדעית מסתמכת במידה רבה על היכולת למדוד במדויק את ההשפעות הביולוגיות של מזהמים במינון נמוכים, כגון חומרים מייננת קרינה וכימיקלים. נזק לדנ"א ותיקון הם הסימנים המוקדמים החשובים ביותר של סיכונים בריאותיים בשל השלכותיהם הפוטנציאליות לטווח ארוך, כגון סרטן. כאן אנו מתארים פרוטוקול ללמוד את ההשפעה של חשיפה כרונית בvivo למינונים נמוכים של קרינת β γ- ועל נזק לדנ"א ותיקון בתאי טחול עכבר. באמצעות סמן מקובל של DNA הפסקות גדיל פעמיים, H2AX היסטון phosphorylated נקרא γH2AX, אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש בו כדי להעריך לא רק את הרמות של נזק לדנ"א, אלא גם משניםביכולת תיקון DNA שהופק על ידי פוטנציאל מינון נמוך בחשיפות vivo. Cytometry זרימה מאפשרת מדידה מהירה, מדויקת ואמינה של γH2AX כותרת immunofluorescently במספר גדול של דגימות. תיקון הפסקה כפול גדיל DNA יכול להיות מוערך על ידי חשיפת splenocytes חילוץ למנה מאתגרת של 2 Gy לייצר כמות מספקת של DNA פורץ להפעלת תיקון ועל ידי המדידה המושרית (לאחר ההקרנה 1 שעה) ונזק לדנ"א שייר (24 שעות לאחר הקרנה). הנזק לדנ"א שיורי יהיה מעיד על תיקון חלקי והסיכון של חוסר יציבות גנומית לטווח ארוך וסרטן. בשילוב עם מבחני אחרים ונקודתי קצה שיכול בקלות להיות נמדדים בכך במחקרי vivo (למשל, סטיות כרומוזומליות, תדרי גרעינונים בreticulocytes מח עצם, ביטוי גנים, וכו '), גישה זו מאפשרת הערכה מדויקת וקונטקסטואלית של ההשפעות הביולוגיות לחצים רמה הנמוכה של.
מבוא
מחלוקת מהותית על ההשפעות המזיקות האפשריות של שני מינונים נמוכים או נמוכים מאוד של קרינה מייננת ופחד של הציבור של קרינה, מונע על ידי תמונות של ההפצצות האטומיות על הירושימה ונגסקי ותאונות כור גרעיני נדירות (שהוחמרה על ידי תקשורת המונים), הובילה למאוד רגולציה קפדנית הגנה מפני קרינה ותקנים שהם בעלות פוטנציאל לא מדעי מוצדקים. בשלושת העשורים האחרונים, דיווחים רבים תעדו שני חוסר מזיק ואת הנוכחות של השפעות ביולוגיות פוטנציאלי הנגרמות על ידי קרינה מועילות במינון נמוך 1-4. גורם הסיכון בריאותי קרינה העיקרי הוא ההסתברות של סרטן, המוערכת בהתבסס על מחקרים אפידמיולוגיים של ניצולי פצצה אטומיים שקיבלו מינון גבוה או בינוני של קרינה. א....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל נהלי הטיפול וטיפול העכבר צריכים לדבוק בכללים שנקבעו על ידי מחוקק התוכניות ו / או טיפול בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי החיים מקומית. כל השיטות שתוארו בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים באישור ועדת טיפול בבעלי החיים המקומית.
זהירות: כל העבודה עם רדיואקטיביות (כולל, אך לא מוגבלת לטיפול בטריטיום, γ-קרינה חיצונית, טיפול ברקמות בעלי החיים רדיואקטיבי, פסולת מצעים) צריך לדבוק בכללים שנקבעו על ידי הרשויות המחוקקת ו / או הגנה מפני קרינה ותבוצע על ידי מורשה כוח אדם במעבדה ו / או מתקן מוסמכים.
1. בעלי ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 2 מציג דוגמאות של cytometry זרימת הגרפים הצפויים לsplenocytes מוכנים תוך שימוש בשיטה שתוארה כאן. תאים מגודר ראשון המבוסס על <נפח בצד הפיזור אלקטרוני> עלילת פיזור (איור 2 א ו 2 ד; נפח אלקטרוני הוא שווה ערך לפיזור קדימה). היסטוגרמות יוד FL3 / propidium (איור 2 ו2E) לאשר חלוקת מחזור התא נורמלית. אומר אות γH2AX מחושבת באמצעות ערוץ FL1 מאשר גידול> פי 2 בדנ"א DSB ב2-Gy מוקרן תאים (איור 2F)
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול שהוצג במאמר זה הוא שימושי לניהול עכבר בקנה מידה גדול במחקרי vivo בוחנים את השפעות genotoxic של רמות נמוכות של חומרים כימיים ופיסיים שונים, כוללים קרינה מייננת. המתקן שלנו ייחודי ספציפי הפתוגן ללא בעלי החיים מצויד בirradiator GammaBeam 150 ואולם הקרנה ארוכה 30 מטר מאפשר ביצוע המחקרים ארוכים-חיים כרוכים בirradiations שיעור מינון נמוך או נמוך מאוד על מאות או אפילו אלפים של עכברים. ניתן להגדיר מתקני קרינה קטנים יותר לקרינה במינון נמוכה כרונית באוניברסיטה או בסביבת ב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי לא ידוע על אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
המחברים מבקשים להכיר בתרומתם של עמיתינו סנדרין רוש-לפבר ואריק גרגואר מהמכון להגנה מפני קרינה ובטיחות גרעינית (פריז, צרפת). עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המדע והטכנולוגיה של ממשלת קנדה במעבדות הגרעין הקנדיות (צ'וק ריבר, אונטריו, קנדה), קבוצת הבעלים של CANDU (טורונטו, אונטריו, קנדה), הוועדה הקנדית לבטיחות גרעינית ועל ידי המכון להגנה מפני רדיו ובטיחות גרעינית (פריז, צרפת).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| HTO: מים משולשים, [3H] | המתקבלים מקומית מכור גרעיני | פעילות מלאי 3.7 GBq/mL; ניתן להחליף ב-HTO מבית Perkin Elmer | |
| OBT: Alanine, L-[3-3H]: טריטיום קשור אורגנית (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: גליצין, [2-3H]: טריטיום פרקין | אלמר | NET004005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: פרולין, L-[2,3-3H]: טריטיום קשור אורגנית (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| מים משולשים, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | תחליף ל-HTO ממקור מקומי |
| GammaBeam 150 irradiator | Atomic Energy of Canada Limited | בייצור מקומי | במקור קרינת g אחר בעל פעילות נמוכה מספיק |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 עם L-גלוטמין ו-HEPES 500 מ"ל |
| סרום בקר עוברי | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| נוגדן נגד gH2AX, שיבוט JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 נוגדן נגד עכבר עז | Life Technologies (לשעבר Invitrogen) | A21121 | |
| פרופידיום יוד | סיגמא אולדריץ' | P4864-10 מ"ל | מ"ג / מ"ל |
| אלכוהול | P006-EAAN | בקבוקי 500 מ"ל צינורות אתנול | |
| מוחלט 1.5 מ"ל | מיקרוצנטריפוגה | 2682550 פישר סיינטיפיק | |
| צינורות 15 מ"ל | פישר סיינטיפיק | 05-539-5 | צינורות צנטריפוגה סטריליים מפוליפרופילן |
| חנקן נוזלי | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 מ"מ צינורות זכוכית לא מכוסים | Fisher Scientific | K60B1496126 | צינורות זכוכית בורוסיליקט חד פעמיים עם קצה רגיל |
| צלוחיות T25 | VWR | CA15708-120 | nunc tisue culture בקבוק 25 מ"ל (מס' ספק 156340) |
| מספריים | Fine Science Tools | 14068-12 | Wagner מספריים 12 ס"מ מלקחיים חדים/ |
| חדים, ישר | Fine Science Tools | 11008-13 | מלקחיים Semken 13 ס"מ, מלקחיים |
| ישרים, | מעוקלים Fine Science Tools | 11003-12 | מלקחיים בתבנית צרה 12 ס"מ, |
| צלחות פטרי מעוקלות 60 מ"מ | VWR | CA25382-100 | BD צלחת תרבית רקמות פלקון 60 x 15 מ"מ |
| מסנני תאים, 70 מ"מ | פישר סיינטיפיק | 08-771-2 | מסנני תאי פלקון 50/מארז |
| מתכון PBS: טבליה אחת מומסת ב -200 מ"ל מים נטולי יונים, התאימו את ה- pH ל -7.4 במידת הצורך. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | טבליות מלח חוצצות פוספט |
| מתכון TBS: להכנת מלאי | |||
| 30 גרם TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma hydrochloride |
| 88 גרם NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | נתרן כלורי |
| 2 גרם KCl | Fisher Scientific | P217-500 | אשלגן כלורי |
| ממיסים ב-1 ליטר מים נטולי יונים, התאימו את ה-pH ל-7.4 |
מקורות
- Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
- Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
