הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדידת נזק לדנ"א ותיקון בSplenocytes העכבר לאחר כרוני

10.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52912

⸱

3 ביולי 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Radiological Protection Research and Instrumentation, Canadian Nuclear Laboratories

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול להערכת שינויים ברמות הנזק ל-DNA וביכולת תיקון ה-DNA שעלולים להיגרם על ידי הקרנה כרונית במינון נמוך in vivo בלימפוציטים של טחול עכבר, על ידי מדידת היסטון זרחני H2AX, מוצג סמן לשבירות דו-גדיליות של DNA, באמצעות זרימה ציטומטרית.

תקציר

חשיפה לקרינה במינון נמוכה עלולה לייצר מגוון רחב של השפעות ביולוגיות שהם שונים בכמות ובאיכות מתופעות המיוצרות על ידי מינוני קרינה גבוהים. התמודדות עם שאלות הקשורות לבטיחות בריאות סביבתית, תעסוקתית וציבורית באופן ראוי ומוצדק מבחינה מדעית מסתמכת במידה רבה על היכולת למדוד במדויק את ההשפעות הביולוגיות של מזהמים במינון נמוכים, כגון חומרים מייננת קרינה וכימיקלים. נזק לדנ"א ותיקון הם הסימנים המוקדמים החשובים ביותר של סיכונים בריאותיים בשל השלכותיהם הפוטנציאליות לטווח ארוך, כגון סרטן. כאן אנו מתארים פרוטוקול ללמוד את ההשפעה של חשיפה כרונית בvivo למינונים נמוכים של קרינת β γ- ועל נזק לדנ"א ותיקון בתאי טחול עכבר. באמצעות סמן מקובל של DNA הפסקות גדיל פעמיים, H2AX היסטון phosphorylated נקרא γH2AX, אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש בו כדי להעריך לא רק את הרמות של נזק לדנ"א, אלא גם משניםביכולת תיקון DNA שהופק על ידי פוטנציאל מינון נמוך בחשיפות vivo. Cytometry זרימה מאפשרת מדידה מהירה, מדויקת ואמינה של γH2AX כותרת immunofluorescently במספר גדול של דגימות. תיקון הפסקה כפול גדיל DNA יכול להיות מוערך על ידי חשיפת splenocytes חילוץ למנה מאתגרת של 2 Gy לייצר כמות מספקת של DNA פורץ להפעלת תיקון ועל ידי המדידה המושרית (לאחר ההקרנה 1 שעה) ונזק לדנ"א שייר (24 שעות לאחר הקרנה). הנזק לדנ"א שיורי יהיה מעיד על תיקון חלקי והסיכון של חוסר יציבות גנומית לטווח ארוך וסרטן. בשילוב עם מבחני אחרים ונקודתי קצה שיכול בקלות להיות נמדדים בכך במחקרי vivo (למשל, סטיות כרומוזומליות, תדרי גרעינונים בreticulocytes מח עצם, ביטוי גנים, וכו '), גישה זו מאפשרת הערכה מדויקת וקונטקסטואלית של ההשפעות הביולוגיות לחצים רמה הנמוכה של.

מבוא

מחלוקת מהותית על ההשפעות המזיקות האפשריות של שני מינונים נמוכים או נמוכים מאוד של קרינה מייננת ופחד של הציבור של קרינה, מונע על ידי תמונות של ההפצצות האטומיות על הירושימה ונגסקי ותאונות כור גרעיני נדירות (שהוחמרה על ידי תקשורת המונים), הובילה למאוד רגולציה קפדנית הגנה מפני קרינה ותקנים שהם בעלות פוטנציאל לא מדעי מוצדקים. בשלושת העשורים האחרונים, דיווחים רבים תעדו שני חוסר מזיק ואת הנוכחות של השפעות ביולוגיות פוטנציאלי הנגרמות על ידי קרינה מועילות במינון נמוך 1-4. גורם הסיכון בריאותי קרינה העיקרי הוא ההסתברות של סרטן, המוערכת בהתבסס על מחקרים אפידמיולוגיים של ניצולי פצצה אטומיים שקיבלו מינון גבוה או בינוני של קרינה. אקסטרפולציה ליניארית של נתונים אלה (מה שנקרא ליניארי-אין-סף או מודל LNT) משמשת להערכת סיכונים של סרטן במינונים נמוכים. עם זאת, גישה זו לא קיבלה קבלה מדעית ברחבי העולםוהוא דנו בכבדות 5.

ניכר כי מחקרים נוספים נדרשים כדי להבהיר סוגיה זו ואולי לשפר את הסטנדרטים להגנה מפני קרינה. מחקרים כאלה צריכים לערב טיפולים כרוניים (הקירוב הטוב ביותר של חשיפות סביבתיות ותעסוקתיות), במודלים של בעלי החיים vivo (הטובים ביותר עבור אקסטרפולציה אפקטים לאדם) ונקודתי קצה כגון שיעורי נזק לדנ"א, תיקון DNA וmutagenesis. זה ידוע שה- DNA הוא היעד העיקרי לפגיעת השפעות קרינה ולא שלמים או אי-תיקון עלול להוביל להתפתחות הסרטן וmutagenesis 6.

הפסקות DNA פעמיים גדיל (DSB) הן אחד מהסוגים מזיקים ביותר של נגעי DNA ועלולות להוביל למוות של תאים ויצירת הגידולים 7. זהו, אם כן, חשוב להיות מסוגל אמין ומדויק למדידת הרמה של DSB לאחר חשיפה לקרינה במינון נמוכה ו / או גורמי לחץ אחרים, כגון מזהמים כימיים. אחד מהסמנים הרגישים והספציפיים ביותרשל DNA DSB הוא H2AX היסטון פוספורילציה, נקרא γH2AX 8, עדיין סמנים ושיטות אחרים כבר הציעו 9,10. ההערכה היא כי אלפי מולקולות H2AX, בקרבת DSB מושרה, מעורבים בהיווצרות γH2AX מאפשרת זיהוי של DSB הבודד על ידי תיוג immunofluorescent עם הנוגדן ומיקרוסקופ פלואורסצנטי אנטי γH2AX 11. התגובה היא מהירה מאוד, והגיע המקסימלית שלה בין 30 ל -60 דקות. ראיות לכך שγH2AX מאפשר תיקון של דנ"א DSB ידי משיכת גורמי תיקון אחרים לאתרים של הפסקות ועל ידי שינוי מבנה הכרומטין לעגן קצות DNA השבורים ולספק גישה לחלבונים אחרים תיקון (ביקורת ב -12). עם השלמת התיקון של דנ"א DSB, γH2AX מקבל דה-פוספורילציה ו / או עובר השפלה, ומולקולות H2AX מסונתזים חדש להחליף γH2AX באזורים שנפגעו מהכרומטין 10. ניטור היווצרות ואובדן γH2AX יכול,לכן, לספק הערכה מדויקת של קינטיקה תיקון DNA DSB. גישה זו נעשתה שימוש כדי ללמוד תיקון DSB בשורות תאי גידול שונים אנושיות מוקרנים עם מינונים גבוהים של קרינה ושיעורה ורמות DSB שייר הוכח לתאם עם radiosensitivity 13-15.

אנחנו שונה הגישה הניסויית הזה וליישם אותו למחקר עכבר in vivo לבחון את ההשפעות של מינונים נמוכים של γ- הכרוני וβ-קרינה ברמות ה- DNA DSB ותיקון (איור 1). ראשית, אנחנו מדגימים שיטה לביצוע חשיפה כרונית ארוך טווח של עכברים לβ-קרינה הנפלטת באמצעות טריטיום (מימן-3) בצורה של המים tritiated (HTO) או כטריטיום מחויב אורגני (OBT) מומס במי שתייה . שתי הצורות צפויות לצבור ו / או להפיץ בצורה שונה בגוף ולכן, לייצר השפעות ביולוגיות שונות. שני צורות הן סכנות פוטנציאליות בתעשיית גרעין. טיפול זההקביל לחשיפה כרונית לקרינת γ-בשיעור מינון שווה ערך כדי לאפשר השוואה נכונה של שני סוגי הקרינה, שהוא חיוני להערכת היעילות הביולוגית היחסית שלהם. Beta-קרינה מורכבת מאלקטרונים, מה שהופך את שונה מאוד מγ-הקרינה, הפוטונים באנרגיה גבוהים. בשל הבדל זה, Β-קרינה מייצגת סכנה בריאותית בעיקר פנימית ועלולה לייצר השפעות ביולוגיות שונות בהשוואה לγ-קרינה. סיבוך זה הביא מחלוקות משמעותיות על פני הרגולציה של חשיפה לβ-קרינה הנפלטת על ידי HTO. לפיכך, רמות רגולציה של HTO במי שתייה לציבור משתנות מקרל 100 / L באירופה 75,000 בקרל / L באוסטרליה. זהו, אם כן, חשוב להשוות השפעות ביולוגיות של HTO למינונים מקבילים של γ-קרינה. שנית, שיעור ה- DNA DSB נמדד בsplenocytes המבודד עם השלמת חשיפות כרוניות באמצעות כותרת immunofluorescently γH2AX לזהותאד על ידי cytometry זרימה. זה מאפשר ההערכה של מידת נזק שנגרם על ידי ה- DNA in vivo החשיפות. עם זאת, זה הגיוני לצפות שחשיפות כגון רמה נמוכה לא יכולות לייצר כל שיעורי זיהוי של ה- DNA DSB; במקום זאת, כמה שינויים נסתרים / ניתן לצפות תגובות שמשפיעות על היכולת של התאים כדי לתקן נזק ל- DNA. שינויים אלה, אם מצאו, יכולים להיות גם גירוי (ייצור אפקט מועיל) או מעכב (ייצור אפקט מזיק). הפרוטוקול המוצע מאפשר חושף שינויים כאלה על ידי מאתגרים splenocytes חילוץ עם מינון גבוה של קרינה שמייצר כמות משמעותית של נזק (למשל, 2 Gy ייצור כ -50 DNA DSB לכל תא או 3 -. עלייה של 5 לקפל בסך הכל רמת γH2AX) . בהמשך לכך, ההיווצרות ואובדן γH2AX, המשקף את הייזום והשלמת תיקון DSB, מנוטרת על ידי cytometry זרימה. בדרך זו, לא רק בסיס ורמות מושרה טיפול של ה- DNA DSB ניתן למדוד, אבלגם השפעתה הפוטנציאלית על היכולת של התאים להגיב ונזק לדנ"א תיקון הנגרם על ידי רמות לחץ גבוהות בהרבה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל נהלי הטיפול וטיפול העכבר צריכים לדבוק בכללים שנקבעו על ידי מחוקק התוכניות ו / או טיפול בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי החיים מקומית. כל השיטות שתוארו בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים באישור ועדת טיפול בבעלי החיים המקומית.

זהירות: כל העבודה עם רדיואקטיביות (כולל, אך לא מוגבלת לטיפול בטריטיום, γ-קרינה חיצונית, טיפול ברקמות בעלי החיים רדיואקטיבי, פסולת מצעים) צריך לדבוק בכללים שנקבעו על ידי הרשויות המחוקקת ו / או הגנה מפני קרינה ותבוצע על ידי מורשה כוח אדם במעבדה ו / או מתקן מוסמכים.

1. בעלי החיים עבודה

  1. בעלי החיים קיבוץ
    1. אם עכברים מגיעים מארגון חיצוני, להתאקלם חיות לפחות 10 ימים במתקן בעלי החיים. אם המחקר כולל קבוצות טיפול מרובות, להבטיח כי ספק בעלי החיים ניתן לשלוח אלבעלי החיים l כיצווה אחת.
    2. באופן אקראי להקצות עכברים לקבוצות טיפול של 10 עכברים לכל קבוצה. אם משתמש בעכברי זכרים של זן C57BL / 6, יש לי ספק החיה מראש לארגן אקראי של C57BL זכרים / 6 צעירים מאוד במתקן שלהם כדי למתן בעיות תוקפנות.
  2. חשיפה כרונית של עכברים β-קרינה פנימית ל
    1. הכן ריכוזי עבודה של טריטיום (10 kBq / L וMBq 1 / L) במי שתיית עכבר על ידי דילול המניות המקוריות של HTO וOBT (תערובת של פרולין tritiated, אלאנין וחומצות אמינו גליצין) פתרונות.
    2. לאמת את הריכוזים הסופיים של טריטיום במי השתייה על ידי מדידת רדיואקטיביות באמצעות מונה נצנץ נוזלי. התאם ריכוזים, במידת צורך.
    3. לטפל בבעלי חיים לחודש אחד על ידי מתן כרצונך גישה למים טריטיום. אם מים טיפול מקבלים נמוכים בתקופה של השבועיים, להוסיף עוד מים. אחרת, לשנות בקבוקים בשבועות.
    4. דמה-מוקרנת התייחס שליטהעכברים זהים. שמור אותם בחדר "נקי" נפרד או על מדף נפרד "נקי" תחת לחץ אוויר חיובי כדי למנוע טריטיום זיהום צולב מהאוויר.
  3. חשיפה כרונית של עכברים γ-קרינה חיצונית ל
    הערה: γ-קרינת מתקן / ציוד ישתנה בהתאם למיקום.
  4. שימוש בשיטות זמינות של dosimetry, לקבוע את המרחקים ממקור γ-קרינה שיש לי שדות קרינת הפקת שיעורי מינון הרצויים. ודא ההומוגניות של שדות קרינה באזורי כיסוי כלובי חיות.
    הערה: 1.7 μGy / h הוא שווה ערך לשיעור מינון המיוצר על ידי 1 MBq / טריטיום L בגוף.
  5. לחשוף עכברים על ידי הצבת כלובי עכבר במרחקים שנקבעו בשלב 1.3.1 לחודש אחד. למזער הפרעה יומית של γ-קרינה 30 דקות. השתמש מד מינון thermoluminescence למדוד מינונים נקלטו כולל.

2. קורבנות ודגימה

  1. הכן מכשירי ניתוח סטרילי, צלחות פטרי 60 מ"מ עם מסננות הוכנסו 70 מיקרון תא, 15 מיליליטר וצינורות 1.5 מיליליטר, תקשורת RPMI בתוספת סרום 5% שור עוברי (FBS) ומקום כל בתוך ארון בטיחות ביולוגי. הבטחת סטריליות של העבודה היא קריטית.
  2. לוותר 5 מיליליטר של תקשורת RPMI לכל צלחת פטרי 60 מ"מ.
  3. להקריב עכברים באמצעות שיטה שאושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי החיים המקומית. נקע בצוואר הרחם הוא בחירה טובה עבור עבודת splenocyte המתוארת בפרוטוקול זה. עם זאת, אם דגימות דם למבחנים אחרים (לדוגמא, לmFISH, הגרעינון בלוק cytochalasin או מבחני genetoxicity הנפוץ אחרים) נדרשות, להשתמש לנקב פנים-לב לאחר הרדמה עם isoflurane.
  4. מניחים את החיה שכיבתה על גב, עם הראש והצביע ממך. לרסס את העכבר למטה עם 70% אתנול. בעזרת מלקחיים, לתפוס את עור anteriorly לפתיחת השופכה ולעשות חתך קטן עם מספריים באזור החיץ הנקבי.
    1. מחתך זה, לחתוך לאורך קו האמצע הגחון לחלל החזה, להיות זהיר, כדי לחתוך רק את העור ולא קיר השריר מתחת. לנתח את העור מקו האמצע.
    2. לתפוס את דופן הבטן עם מלקחיים ולחתוך לאורך הציר החציוני של קיר השרירים לפתוח את חלל הבטן.
  5. בלו הטחול על ידי בקלילות תופס אותו עם מלקחיים סטריליות ומשייכתו בעדינות על זה תוך צמצום מרחק בו זמנית רקמת חיבור במספריים.
  6. חותכי חתיכה קטנה של הטחול (כ 1/10 של הטחול) והמקום בצינור 1.5 מיליליטר. Snap להקפיא בחנקן נוזלי לאחסון שלאחר מכן ב -80 ° C למבחנים משלימים.
  7. מניחים את שארית הטחול לתוך מסננת תא בתוך צלחת פטרי 60 מ"מ עם 5 מיליליטר של תקשורת RPMI-לוותר מראש.
  8. המשך לעכבר הבא.
    יכולים להיות כל הזמן טחולים חולץ ב -60 מנות מ"מ עם תקשורת (עד 2 שעות) בעוד שאר העכברים להקריב את: הערהאד. בהתאם למספר האנשים שהשתתפו, בין 5 ל 15 עכברים יכולים להיות מעובד ביום אחד.

3. הכנת תרבויות Splenocyte

  1. Homogenize הטחול על ידי מיותר בתוך מסננת תא עם מלקחיים סטרילי עם קצה מעוגל.
  2. הסר את מסננת התא ולאסוף את ההשעיה התא המסוננת מצלחת 60 מ"מ לתוך צינור 15 מיליליטר.
  3. יש לשטוף את מסננת התא עם 5 מיליליטר של תקשורת כדי לאסוף את שארית התאים.
  4. צינורות צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על RT.
  5. supernatant ולמזוג מחדש להשעות גלולה ב 10 מיליליטר של RPMI.
  6. צינורות צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על RT.
  7. supernatant ולמזוג מחדש להשעות גלולה ב 5 מיליליטר של RPMI.
  8. העברה 4 מיליליטר של השעיה תא לתוך בקבוק 25 מיליליטר תרבות רקמות ולהסיר לחממת CO 2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 80% לחות)

4. מאתגרי הקרנה ותיקון

  1. העבר אתנותר 1 מיליליטר של השעיה תא מהצעד 3.8 לתוך צינור 1.5 מיליליטר על קרח וצנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. הנזק לדנ"א שנמדד במדגם זה מייצג שני נזק הנגרם הטיפול וt = 0 נתוני נקודה לבניית עקומת תיקון DNA.
  2. בזהירות לשאוב supernatant באמצעות משאבת ואקום. בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של חיץ TBS (20 מ"מ טריס pH 7.4, 150 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl).
  3. צינורות צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בזהירות לשאוב supernatant באמצעות משאבת ואקום. בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 300 μl של TBS.
  4. תוך ערבוב במערבולת במהירות נמוכה, להוסיף 700 μl של -20 אתנול 100% מעלות צלזיוס. סגור את המכסה ולהפוך כמה פעמים כדי לערבב.
  5. אחסן את הדגימות ב -20 ° C. Splenocytes הקבוע באתנול ניתן לאחסן ב -20 ° C לפחות 12 חודשים ללא כל אובדן מורגש באות γH2AX.
  6. מכשיר את תרבויות splenocyte מצעד 3.8 עם γ-רד מאתגר מינון iation של 2 Gy ב≥ שיעור מינון 200 mGy / דקות באמצעות מכשיר הקרנה זמין.
    הערה: המטרה של קרינה זו היא לגרום לDNA DSB לאתגר את מכונות התיקון. גם צילומי רנטגן יכול לשמש למטרה זו.
  7. מייד להחזיר את התרבויות לחממת CO 2.
  8. שעה 1 לאחר הקרנת Gy 2 המאתגרת, להסיר את התרבויות מן החממה לארון בטיחות ביולוגית. לאסוף aliquot מדגם מייצג, בעדינות מחדש להשעות תאים באמצעות pipettor והעברה 1 מיליליטר של ההשעיה תא צינור 1.5 מיליליטר על קרח. להחזיר את תרביות תאים לחממת CO 2.
  9. צינורות צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בזהירות לשאוב supernatant באמצעות משאבת ואקום. בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של TBS.
  10. חזור על שלבים 4.3-4.5.
  11. 24 שעות לאחר 2 γ-הקרנת Gy, הקציר המאתגר ולתקן ב= מדגם 24 שעות כמתואר בשלב 4.8-4.10.
ייתכנו "> 5. תיוג Immunofluorescent עם אנטי-γH2AX נוגדן

הערה: בדרך כלל, 15-30 דגימות ליום יכולות להיות מתויגות immunofluorescently וassayed ידי cytometry זרימה בטווח אחת. כדי להבטיח השוואה מדויקת בין קבוצות טיפול, כולל מדגם (ים) מכל קבוצה. ראית גם התייחסות 16 לפרטים נוספים.

  1. הכן ערכת שכותרת של צינורות למספר הדגימות להיות מעובד ומניחים על קרח. השתמש 12 x 75 מ"מ צינורות זכוכית הסירו את מכסה. עקרות אינה נדרשות לעבודה זו. כולל דגימה אחת נוספת היסטורית שליטה לתיוג עם נוגדנים משני בלבד ("2 Ab רק"). השתמש מדגם שליטה היסטורי זה בכל cytometry זרימה לרוץ בתוך מחקר.
  2. הוסף 0.5 מיליליטר של TBS קר כקרח על צינור אחד.
  3. הסר splenocytes קבוע מ-20 ° C, מערבולת במשך 5 שניות ולהעביר aliquot 0.5 מיליליטר לצינורות מוכנים עם כפות. מניחים את שארית דגימות בחזרה לאחסון -20 ° C ולשמור כמדגם גיבוי.
  4. splenocytes צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של קר כקרח TBS המכיל 1% FBS
  5. תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של חיץ TST (0.05% X-100, 2% FBS טריטון ב TBS). דגירה של 20 דקות על קרח.
  6. תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 200 μl של נוגדן אנטי γH2AX העיקרי בדילול 1: 150 במאגר TST. השתמש 200 μl של TST ל" 2 Ab רק "מדגם השליטה.
  7. צינורות עמדה על שייקר מסתובב בזווית של 45 - 60 מעלות ולנער תמורת 1.5 שעות ב 300 XG ב RT.
  8. בעוד צינורות דוגרים, להכין נפח מספיק (200 μl / מדגם) של הנוגדנים משני אנטי העכבר העז מצומדות עם Alexa-488 בדילול 1: 200 במאגר TST.
    הערה: כל העבודה שיש בי Alexa-488נוגדן מצומדת (שלבים 5.10-5.16 להלן) צריך להיעשות בתנאי אור עמומים וצריכה להיות מוגן דגימות שכותרתו מאור על ידי עטיפת צינורות בנייר אלומיניום.
  9. ברגע שהדגירה 1.5 שעות הושלמה, להוסיף 1 מיליליטר של TBS קר כקרח המכיל 2% FBS על צינור אחד וצנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של TBS המכיל 2% FBS.
  10. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 200 μl של פתרון נוגדנים משני מהשלב 5.8.
  11. דגירה הדגימות על פלטפורמה רועדת עבור שעה 1 כמו בשלב 5.7.
  12. הוסף 1 מיליליטר של TBS קר כקרח המכיל 1% FBS.
  13. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של TBS קר כקרח.
  14. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 0.5 מיליליטר של TBS המכיל 50 מיקרוגרם / מיליליטריודיד propidium.
  15. דגירה של 5 דקות על RT המוגנים מפני אור.
  16. ניתוח דגימות על cytometer זרימה באמצעות פרוטוקולי מכשיר ספציפי 16. קראו לפחות 10,000 תאים לדגימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 2 מציג דוגמאות של cytometry זרימת הגרפים הצפויים לsplenocytes מוכנים תוך שימוש בשיטה שתוארה כאן. תאים מגודר ראשון המבוסס על <נפח בצד הפיזור אלקטרוני> עלילת פיזור (איור 2 א ו 2 ד; נפח אלקטרוני הוא שווה ערך לפיזור קדימה). היסטוגרמות יוד FL3 / propidium (איור 2 ו2E) לאשר חלוקת מחזור התא נורמלית. אומר אות γH2AX מחושבת באמצעות ערוץ FL1 מאשר גידול> פי 2 בדנ"א DSB ב2-Gy מוקרן תאים (איור 2F)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול שהוצג במאמר זה הוא שימושי לניהול עכבר בקנה מידה גדול במחקרי vivo בוחנים את השפעות genotoxic של רמות נמוכות של חומרים כימיים ופיסיים שונים, כוללים קרינה מייננת. המתקן שלנו ייחודי ספציפי הפתוגן ללא בעלי החיים מצויד בirradiator GammaBeam 150 ואולם הקרנה ארוכה 30 מטר מאפשר ביצוע המחקרים ארוכים-חיים כרוכים בirradiations שיעור מינון נמוך או נמוך מאוד על מאות או אפילו אלפים של עכברים. ניתן להגדיר מתקני קרינה קטנים יותר לקרינה במינון נמוכה כרונית באוניברסיטה או בסביבת ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי לא ידוע על אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

המחברים מבקשים להכיר בתרומתם של עמיתינו סנדרין רוש-לפבר ואריק גרגואר מהמכון להגנה מפני קרינה ובטיחות גרעינית (פריז, צרפת). עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המדע והטכנולוגיה של ממשלת קנדה במעבדות הגרעין הקנדיות (צ'וק ריבר, אונטריו, קנדה), קבוצת הבעלים של CANDU (טורונטו, אונטריו, קנדה), הוועדה הקנדית לבטיחות גרעינית ועל ידי המכון להגנה מפני רדיו ובטיחות גרעינית (פריז, צרפת).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
HTO: מים משולשים, [3H]המתקבלים מקומית מכור גרעיני פעילות מלאי 3.7 GBq/mL;  ניתן להחליף ב-HTO מבית Perkin Elmer
OBT: Alanine, L-[3-3H]: טריטיום קשור אורגנית (OBT)Perkin ElmerNET348005MC1 mCi/ml (185 MBq)
OBT: גליצין, [2-3H]: טריטיום פרקיןאלמרNET004005MC1 mCi/ml (185 MBq)
OBT: פרולין, L-[2,3-3H]: טריטיום קשור אורגנית (OBT)Perkin ElmerNET323005MC1 mCi/ml (185 MBq)
מים משולשים, [3H] (HTO)Perkin ElmerNET001B005MCתחליף ל-HTO ממקור מקומי   
GammaBeam 150 irradiatorAtomic Energy of Canada Limitedבייצור מקומיבמקור קרינת g אחר בעל פעילות נמוכה מספיק 
Tween-20Sigma AldrichP1379-500ML
RPMIScientificSH3025501Hyclone RPMI 1640 עם L-גלוטמין ו-HEPES 500 מ"ל
סרום בקר עובריSigma AldrichF1051-100ML
נוגדן נגד gH2AX, שיבוט JBW301Millipore05-636
Alexa fluor-488 נוגדן נגד עכבר עזLife Technologies (לשעבר Invitrogen)A21121
פרופידיום יודסיגמא אולדריץ'P4864-10 מ"למ"ג / מ"ל
אלכוהולP006-EAANבקבוקי 500 מ"ל צינורות אתנול
מוחלט 1.5 מ"למיקרוצנטריפוגה2682550 פישר סיינטיפיק
צינורות 15 מ"לפישר סיינטיפיק05-539-5צינורות צנטריפוגה סטריליים מפוליפרופילן
חנקן נוזליLindeP110403
12 x 75 מ"מ צינורות זכוכית לא מכוסיםFisher ScientificK60B1496126צינורות זכוכית בורוסיליקט חד פעמיים עם קצה רגיל
צלוחיות T25VWRCA15708-120nunc tisue culture בקבוק 25 מ"ל (מס' ספק 156340)
מספרייםFine Science Tools14068-12Wagner מספריים 12 ס"מ מלקחיים חדים/
חדים, ישרFine Science Tools11008-13מלקחיים Semken 13 ס"מ, מלקחיים
ישרים,מעוקלים Fine Science Tools11003-12מלקחיים בתבנית צרה 12 ס"מ,
צלחות פטרי מעוקלות 60 מ"מVWRCA25382-100BD צלחת תרבית רקמות פלקון 60 x 15 מ"מ
מסנני תאים, 70 מ"מפישר סיינטיפיק08-771-2מסנני תאי פלקון 50/מארז
מתכון PBS: טבליה אחת מומסת ב -200 מ"ל מים נטולי יונים, התאימו את ה- pH ל -7.4 במידת הצורך.Sigma AldrichP4417-100TABטבליות מלח חוצצות פוספט
מתכון TBS: להכנת מלאי
30 גרם TRIS HClSigma AldrichT3253-1KGTrizma hydrochloride
88 גרם NaClFisher ScientificS271-500נתרן כלורי
2 גרם KClFisher ScientificP217-500אשלגן כלורי
ממיסים ב-1 ליטר מים נטולי יונים, התאימו את ה-pH ל-7.4
קשור אורגנית ניתן להחליף את 1 מסחרי צינורות 10x

מקורות

  1. Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
  2. Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).
  3. Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism). Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).
  4. Mitchel, R. E. The dose window for radiation-induced protective adaptive responses. Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).
  5. Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data. Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).
  6. Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection. Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).
  7. Jackson, S. P. Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).
  8. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  9. Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).
  10. Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
  11. Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).
  12. Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. Focus on histone variant H2AX: to be or not to be. FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).
  13. Taneja, N., et al. Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy. J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).
  14. Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide. Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).
  15. Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4(2010).
  16. Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice. Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).
  17. Runge, R., et al. Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R). Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).
  18. Jucha, A., et al. FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci. Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).
  19. Garty, G., et al. The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage. Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).
  20. Kovalchuk, I. P., et al. Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice. Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).
  21. Rube, C. E., et al. DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy. DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).
  22. Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. Induction of stress genes by low doses of gamma rays. Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

תיקון נזקי DNAציטומטריה של זרימהGamma H2AXקרינה במינון נמוךשבירי גדילים כפוליםאתגר קרינהסימון אימונופלואורסצנטיבידוד תאים
מדידת נזק לדנ"א ותיקון בSplenocytes העכבר לאחר כרוני
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.