נוהל להכנת ההכנות הפנים של העורק הראשי עורקים אבי העורקים מתואר. הכנות כאלה, כאשר מוכתמים immunofluorescently עם נוגדנים ספציפיים, מאפשרים לנו ללמוד לוקליזציה של חלבונים זיהוי של סוגי תאים בתוך הקיר כולו כלי הדם על ידי מיקרוסקופיה confocal.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
חלקים של רקמות מוטבע פרפין משמשים באופן שגרתי לחקר היסטולוגיה רקמות היסטופתולוגיה. עם זאת, קשה לקבוע מה מורפולוגיה רקמת תלת מימדי הוא מן הסעיפים האלה. בנוסף, קטעים של רקמות שנבדקו לא יכול להכיל את האזור בתוך הרקמה הדרושה לצורך המחקר המתמשך. הגבלה זו מעכבת מחקרים היסטופאתולוגיים של כלי הדם מאז לפתח נגעים וסקולריים באופן ממוקד. זה דורש שיטה המאפשרת לנו לסקור שטח רחב של קיר כלי הדם, מפני השטח שלו לאזורים עמוקים יותר. הר שלם בפנים הכנה של כלי הדם ממלא דרישה זו. במאמר זה, נוכל להדגים כיצד לעשות ההכנות פנים של אבי העורקים בעורק ואת עורק הצוואר כדי כתם immunofluorescently עבור מיקרוסקופיה confocal וסוגים אחרים של הדמיה מבוססי פלואורסצנטי.
מבוא
עבור מחקרים היסטופתולוגיים על ידי מיקרוסקופ אור, שלוש חתיכות ממדי של רקמות ביולוגיות מעובדות באופן שגרתי עבור emaffment פרפין ואחריו חתך מכתים. מדגם רקמה כי כבר מוטבע paraffin עשוי להיות כמה מילימטרים בכל שלושת הממדים. עם זאת, לצורך מיקרוסקופ אור, זה חייב להיות מחולק הראשון, כך האור יכול לעבור ולאחר מכן מוכתמים כך בסעיף דק תשואות בניגוד מספיק הדמיה. בגלל דגימות מחולקים הם בדרך כלל 5-10 מיקרומטר עובי, אחד רואה רק חלק קטן מאוד של הדגימה כולה בשני ממדים בכל פעם. ניתן לאסוף סעיפים עוקבים, לאחר הדמיה כל סעיף בנפרד, לבצע שחזור ממוחשב בסיוע של תמונות 3D, אבל זו עבודה מייגעת אכן. Histopathology של כלי הדם, במיוחד לחקר הפתוגנזה של טרשת ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקולים לעורקים חלקיקים עכבר חלקית קשירת ובידוד של אבי העורקים העכבר ועורק הראש עבור הפנים immunostaining הם מאושרים על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IBT 2014-9231).
1. משמאל חלקית עורק הלב הראשי קשירת
- הכן את שטח כירורגי על ידי הנחת 12 אינץ 'x 14 אינץ' כרית חימום על השולחן לכסות את הפנקס ואת שולחן הדף עם וילון כירורגי גדול ונקי. התאם את הזרוע של הדום לעמוד כך שדה stereomicroscope של נוף הוא באזור המרכז של כרית חימום.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תמונה טיפוסית הפנים immunofluorescence של האנדותל מוצג באיור 3 . תמונה זו מראה קטע אופטי אחד של אבי העורקים של העכבר נלקח ליד פתיחתו של עורק בין דודי (אזור ביצה כהה גדול). אבי העורקים היו מוכתמים פעמיים עם אנטי VE-cadherin (ירוק) ואנטי-VCAM-1 (דלקת תא הידבקות מולקולה -1) (אדום). כל תא האנדותל מתואר עם מכתים ליניארי ירוק בצומת adherens. בשל חוסר אחידות קטין של הדגימה, כמה צמתים adherens נמצאים מחוץ זה קטע אופטי. אנטי VCAM-1 מכתים חז.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאשר הטיפול בכלי הדם העכבר, חשוב לזכור כי האנדותל הוא שביר וכי כל כוח מכני מוגזם יפגע בתאי אנדותל. לדוגמה, תאים אנדותל לשבור או לנתק מן הקיר כלי אם כלי הוא perfused חזק מדי, אשר יכול לקרות בקלות כאשר vasculature הוא perfused באמצעות מזרק מופעל ביד.
כדי לקבל לחץ זלוף מתמיד, אנו משתמשים במערכת זלוף הכבידה עם לחץ מים 120 ס"מ מים. נמסר כי הלחץ העורקי הממוצע של עכבר, אשר נבדל על ידי זן, נע בין 130 ל 170 ס"מ .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
פעילות המחקר של המחברים נתמכים על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות לד"ר אייב (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.9% תמיסת הזרקת נתרן כלורי USP 500 מ"ל שקית | פישר סיינטיפיק | NC9788429 | |
| 12 בארות פישר | סיינטיפיק | 12556005 | |
| 6-0 תפר ויקריל מצופה | Ethicon | J833G | |
| AF488 עז נגד חולדות IgG | Life Technologies | A11006 | |
| AF546 עיזים נגד ארנב IgG | Life Technologies | A11035 | |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 | |
| Anti-VCAM-1 (H-276) ארנב פוליקלונלי IgG | סנטה קרוז ביוטכנולוגיה | Sc-8304 | |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 | |
| עטיפת חיטוי. 24 אינץ' x 24 אינץ' | Cardinal Health | 4024 | |
| מחזירים קהיםרוחב 2.5 מ"מ | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| קפרופן (רימדיל) , | zoetis | NADA#141-199 | |
| פילינג כלורהקסידין, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC | |
| ספוגי גזה Curity 2 x 2 | Cardinal Health | KC2146 | |
| 12 x 14 | Fisher Scientific | NC0667724 | |
| מלקחיים דקים במיוחד Fine Graefe | Science Tools | 11152-10 | |
| מספריים | איריסFine Science Tools | 14090-11 | |
| זכוכית כיסוי מיקרו 22 מ"מ x 50 מ"מ | VWR | 48393059 | |
| מיקרוסקופ שקופיות | פישר סיינטיפיק | 12-550-18 | |
| סרום עיזים רגיל | Equitech-Bio | GS05 | |
| תמיסת פרפורמלדהיד 4% ב-PBS | סנטה קרוז ביוטכנולוגיה | SC-281692 | |
| צלחות פטרי 100 מ"מ x 15 מ"מ | פישר Scientific | FB0875713 | |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 | |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 | |
| Puritan Mini כותנה עם קצה אפליקטורים | VWR | 82004-050 | |
| מחזיק מחט עם ידית עגולה | כלי מדע עדינים | 12076-12 | |
| תפר משי 6/0 | מדע משובח כלים | 18020-60 | |
| מספריים אביביים | ROBOZ | RS-5601 | |
| מספריים פזילה | כלים מדעיים עדינים | 14075-09 | |
| מלקחיים סופר אחיזה | כלים מדעיים עדינים | 00649-11 | |
| חבישה שקופה | קרדינל בריאות | TD-26C | |
| טריטון X-1000 | פישר AC327371000 |
מקורות
- Jelev, L., Surchev, L. A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations. J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).
- Neill, J. F. The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis. Ann Surg....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
