הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גישה פשוטה לבצע מדידות הטיר באמצעות עצמית וולט-אמפר מונה עם תדר פלט ניתן לתיכנות

22.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60087

⸱

5 באוקטובר 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Interfaculty Institute of Biochemistry, University of Tübingen, 2Laboratory of Clinical Regenerative Medicine, Department of Neurosurgery, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 3Department of Pediatrics, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מדגימים כיצד להגדיר וולט-אמפר-מונה זול עם תדר פלט מיתכנת שניתן להשתמש בו עם המקל מסחרית זמין אלקטרודות עבור transepi, מדידות התנגדות חשמלית החשמל.

תקציר

שימוש בטרספפיתל/ההתנגדות החשמלית של שנות ה-80 לקביעת שליטה וחדירות במערכות מודל מבחנה. ברוב המקרים, אלקטרודות המקל משמשות כדי לקבוע את העכבה החשמלית בין התא העליון והתחתון של מערכת להוסיף מסנן התרבות התא המכיל monolayers הסלולר. קרום מסנן מאפשר לתאים לדבוק, הקיטוב, ואינטראקציה על ידי בניית צמתים הדוקים. טכניקה זו תוארה עם מגוון של קווי תאים שונים (למשל, תאים של מחסום הדם-מוח, מחסום נוזלי שדרתי דם, או מערכת העיכול והריאות). התקני המדידה העגלון ניתן להשיג בקלות מספקים שונים ציוד מעבדה. עם זאת, יש פתרונות חסכוניים יותר ומותאמים להתאמה אישית, אם אתה מקבל הרכבה עצמית מתאימה. המטרה הכוללת של פרסום זה היא להגדיר מכשיר אמין עם תדר פלט ניתן לתכנות, כי יכול לשמש עם המקל מסחרית המקלות זמין עבור מדידה הטיר.

מבוא

תאים אפיתל ואנדותל לתפקד כגבולות הסלולר, הפרדת הצדדים פסגה והצלעות של הגוף. אם הם מקושרים באמצעות צמתים הדוקים, החומר הפסיבי דיפוזיה דרך החללים הפרתאיים מוגבל1, והתוצאה היא היווצרות של מכשול חדיר בררני. כמה מערכות מחסום מלאכותי פותחו2 שימוש בתאי מיקרו-כלי (hbmec, מחסום דם-מוח3,4,5,6,7), מקלעת דמית תאים אפיתל (hibcpp/pcpec דם-שדרתי מחסום נוזלשדרה 8,9,10,11,12,13,14), המעי הגס אדנוקרצינומה תאים (caco-2, מודלים במערכת העיכול15), או קווי נשימה/מכתשי תא (מודליםריאתי16,17). מערכות אלו מורכבות בדרך כלל תאים הגדלים במונאולייר על ממברנות חדירות (כלומר, מערכות להוסיף מסנן) כדי לאפשר גישה לצדדים הקודקוד והבזלת צלעות. חשוב ששלמות מערכת המודל תתאים לתנאים הvivo. מכאן, טכניקות מספר פותחו כדי לנתח את תפקוד המכשול על ידי מדידת הפצת הפראותאי של תרכובות מעקב על פני שכבת התא. חומרים אלה כוללים הקרינה הדו, אלבומין מתויג בצבע, inulin מתויג FITC, או לצבוע-התווית דקטרנס2. עם זאת, צבעים כימיים יכולים להפוך תאים שמיש לניסויים נוספים. לניטור מערכות המכשול באופן בלתי פולשני, מדידת מערכת ההתנגדות החשמלית של הטראנס-מרחבי הרשת ניתן להשתמשב -2,18,19. בגלל מערכות האלקטרודות דו קוטבית מושפעים העכבה אלקטרודות האלקטרודה בממשק אלקטרודה-אלקטרוליט, מדידות הטארבלפולהם משמשים בדרך כלל כדי להתגבר על הגבלה זו20. הטכניקה התחתונה היא חישה 4-טרמינל (4T) שתוארה לראשונה בשנת 1861 על ידי ויליאם תומסון (לורד קלווין)21. בקיצור, הזרם מוזרק על-ידי זוג אלקטרודות הנושאות את הזרם הנוכחי, בעוד זוג אלקטרודות לחישה במתח השני משמש למדידת מדידת המתח20. כיום, כביכול אלקטרודות המקל מורכב מזוג אלקטרודות כפולות, כל אחד המכיל גלולה כסף/כסף-כלוריד למדידת מתח ואלקטרודות כסף עבור עובר הנוכחי2. העכבה החשמלית נמדדת בין פסגה לבין תא בזלת צלעות עם שכבת התא בין (איור 1). אות גל מרובע בתדר של בדרך כלל 12.5 Hz מוחל על האלקטרודות החיצוניות ואת הזרם הסירוגין המתקבל (AC) נמדד. בנוסף, הירידה הפוטנציאלית לאורך שכבת התא נמדדת על-ידי זוג האלקטרודה השני (הפנימי). העכבה החשמלית מחושבת לאחר מכן על פי חוק אוהם. ערכי העגלון מנורממים על-ידי הכפלת אזור משטח העכבה ושכבת התאים ומבוטאים בדרך כלל כ-Ω ∙ ס"מ2.

ישנן מערכות בהן תאים ואלקטרודות מסודרים בצורה מתוחכמת יותר, אך מבוססים גם על עקרון המדידה של 4T וניתן להשתמש בהם עם התקני מדידה זהים. מערכות אנדוhm, למשל, שבו מוכנס המסנן, מכילים תא וכובע עם זוג אלקטרודות קונצנטריים עם מבנה זהה כמו המקל אלקטרודה. צורת האלקטרודות מאפשרת זרימה אחידה יותר של צפיפות הזרם לאורך הקרום, ובכך מפחיתה את הווריאציה בין הקריאות. אפילו יותר מורכב (אבל גם יותר מדויק) הוא חדר Ussing, שבו שכבת התאים מפריד בין שני תאים מלאים בתמיסה של המצלצל22. החדר עצמו יכול להיות מתודלק בחמצן, CO2, או N2, ו מעורבב או שיושלם עם חומרים ניסיוניים. כאשר מתבצעת העברת יונים לרוחב שכבת התא, ניתן למדוד הבדל פוטנציאלי על-ידי שתי אלקטרודות לחישה במתח בסמוך לרקמה. מתח זה מבוטל על-ידי שני אלקטרודות נוכחיות הנושאות בסמוך לשכבת התא. הזרם הנמדד יעניק לאחר מכן את הובלת הרשת וההתנגדות הטרנססיפיתית, המשקפת את שלמות המכשול, ניתן לקבוע22. ניתן גם ליישם את מדידת העגלון על מערכות גוף-על-שבב המייצגות מודלים של רקמת מכשול23,24. מערכות אלה מחקות בתנאים vivo של התאים ולעתים קרובות מורכב ממספר סוגים של תאים, מוערמים אחד מעל השני בשכבות.

הפרוטוקול הבא מסביר כיצד להגדיר voltammeter חסכוני ואמין עם תדר פלט ניתן לתיכנות אשר מייצרת לא הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית לעומת מערכות מדידה זמין מסחרית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הרכבת מונה וולט-אמפר בסיסי למדידה העגלון

  1. הכינו מטען USB סטנדרטי כמו 5 מספק הכוח של ה-dc, כבל הרחבה USB, מיקרובקר שישמש כמחולל גל מרובע לתיכנות, שני מטרים סטנדרטיים שיכולים למדוד זרם חילופין ומתח כריבוע ממוצע שורש ( True-RMS), ארבעה כבלים עם אטמי בננה, כבל מאריך הטלפון עם מחבר RJ14 נקבה כולל שישה פינים עם ארבע חוטית הפנימי (6P4C), שני כבלים קצרים, מסוף ברק, 120 kΩ טרום המעבר, התיל לסיים ferrules, והלחמה lugs. הכלים הנדרשים הם חשפנית בידוד, כלי לחיצה, וברזל הלחמה.
  2. ראשית, חבר את הרחבת ה-USB ללוח המיקרו-בקר.
  3. להסיר את הבידוד של שני כבלים קצרים. הלחמה צד אחד לכל כבל ישירות לפינים 0 ו 2 של מיקרובקר או להלחמה lugs, אשר בתורו נחתכים על הפינים המתאימים. מקלקל את הקצוות האחרים לקצה החוט ומחבר אותם למסוף ברק כמתואר באיור 1.
  4. קשר את אטמי הבננה לריבוי מטרים. להתפשט ולקלקל את הקצה השני של כל אחד מארבעת הכבלים.
  5. חותכים את כבל מאריך הטלפון בשני חלקים לפרק ולקלקל את המנצחים של הצד המכיל את המחבר הנשי. בדוק את המשכיות המנצחים והפינים.
  6. ריבוי המטרים הראשון ישמש למדידת הזרם ב-μA (שים לב שמצב AC צריך להיות מוגדר במפורש). לחבר אותו בסדרה עם 120 kΩ pre-הנגד לפינים חמש ושישה של מחבר RJ14, המתאים לצמד האלקטרודה החיצונית של המקל אלקטרודה.
  7. לבסוף, לקשר את multimeter השני, אשר ישמשו כדי למדוד את ירידה מתח ההמרה ב-mV, דרך מסוף ברק לפינים שלושה וארבעה של מחבר RJ14, המתאים לצמד האלקטרודה הפנימי של המקל אלקטרודה.
  8. אם תרצה, טען את ההתקנה במארז.

2. תכנות המיקרובקר

  1. שנה את קוד המקור שסופק (קובץ קידוד משלים 1) לפי הצורך. בצורה הנתונה, סיכות 0 ו-2 יהיו מסורגים בין הקרקע ל-+5 וולט עם 40 אלפיות במחצית התנודה. לפיכך, אות גל מרובע עם משרעת של 5 V ותדר של כ 12.5 הרץ ייווצר. הערכים האמיתיים עשויים להיות שונים עקב חוסר הדיוק של פולט הזמן של המיקרו-בקר.
  2. חבר את המיקרו-בקר למחשב שולחני באמצעות יציאת USB והעלה את קוד המקור עם תוכנה תואמת25.

3. הקלטת אולוגרמות מתח (אופציה)

  1. מעקף סיכות חמש ושישה של מחבר RJ14 עם משקע 1 kΩ בדיקה ולהתחבר לטווח.
  2. , תבדקי את התדר. מתח השיא וצורת הגל דיגיטייז וייצא את הנתונים.
  3. במידת הצורך, הקלט את האולוגרמות מהתקן ייחוס (EVOM) ואת ה-voltammeter המורכב מעצמו לצורך השוואה.
    הערה: במקרה זה, הנתונים נרשמו עם היקף אחסון דיגיטלי HM 208. להיות מאוד בסיסי דיגיטלי מאוד, התמונה יכולה להיות אנלוגי פנימי (קפוא) אבל היה צריך להיות מותווים באמצעות האנלוגית PM 8143 X-Y מקליט. התמונה נסרקה לאחר מכן.

4. טיפוח התא ומדידת העגלון

  1. זרעים האדם דמית הרוח מקלעת הפפילומה (hibcpp) תאים על מסנן התרבות התא מוסיף בגודל הנקבובית של 3 יקרומטר ב dmem/F12 (ראה טבלת חומרים) המכיל 10% סרום עגל עוברי9. לגדל את התאים ב 37 ° c באווירה רוויה מים המכיל 5% CO2 כפי שמתואר על ידי ארוחת ערב ואח '9.
  2. כאשר המסננים להגיע העכבה של 70 Ω ∙ ס"מ2, לשנות את הסרום ללא Dמאמ/F12 ולהגדיר את נקודת הזמן כיום 0.
  3. לחבר את האלקטרודה לנמל RJ14 של voltammeter התאספו עצמית ולחבר את אספקת החשמל USB. הגדר את ריבוי המטרים למצב מתח AC (mV) ולמצב זרם חילופין (μA), בהתאמה.
    1. לחילופין, חבר את האלקטרודות להתקן הפניה זמין מסחרית והפעל לפי הוראות היצרן.
  4. לחטא את האלקטרודה ב 80% אתנול עבור 10 דקות ו equi, במדיום המתאים עבור 10 דקות נוספות.
  5. שים את האלקטרודה בשני התאים של מערכת הוספת מסנן של תרבות התא (החלק הארוך של האלקטרודה בתא התחתון ואת החלק הקצר ביותר בתא העליון) המכיל שכבת תא HIBCPP עד ערכי המדידה נשארים קבועים.
  6. עבור התקן התייחסות, שים לב העכבה ישירות או לחשב את העכבה על פי חוק אוהם (R = U/I) עבור voltammeter בהרכבה עצמית. שים לב לכך שזווית האלקטרודה משפיעה על המידות.
  7. חזור על מדידת העגלון (שלבים 3-6) מיום 0 עד יום 4.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להשוות את הפעולה של voltammeter בהרכבה עצמית עם עמיתו זמין מסחרית שלה, היתה הקלטה של משני המכשירים הוקלט.

כפי שמוצג באיור 2A, מכשיר העזר שנוצר אות גל מרובע עם משרעת של 80 mV ו זמן תנודות של 80 ms, אשר מתאים תדירות של 12.5 Hz, כאשר הפעלה על עומס עם kΩ 1 מבחן הבדיקה.

לעומת זאת, מיקרובקר של המכשיר עצמית התאספו החליף את מתח האספקה לאות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

לפני voltammeter ביצוע עצמי ניתן להשתמש בשגרה יומית, זה חיוני כדי לבדוק את המכשיר לתפקוד תקין. במקרה שלנו, חצי שעה של תנודות של 40 ms (12.5 Hz) היה מתוכנת, אבל הזמן תנודות יעיל התברר להיות 60 ms (16.7 Hz). חוסר דיוק זה של פולט הזמן של microcontroller לא היתה לגילוי השפעה על מדידות הטיר. ייתכן שיהיה עדיף לקבוע את התדר הממשי באמצעות הגדרת התדירות של אחד מהמטרים המרובים. אם נמצא סטייה כלשהי, ניתן לכוונן את קוד המקור בהתאם. יתרה מזאת, מומלץ מאוד לבדוק אם מעבר בדיקה או כיוונונים מוגדרים אחרים מעניקים תוצאות נכונות ומנובחנות. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי אינטרסים אחרים.

תודות

המחברים מודים להררמן ליגגאייר ולמרווין בנדה על העצות המומחים שלהם בתחום האלקטרוטכניקה והאינפורמטיקה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
120 kOhmציוד כללי (גנרי)
כבליציוד כללי (גנרי)
כבליםציוד כללי (גנרי)
צ'ופסטיק אלקטרודהMerck MillicellMERSSTX01
אלקטרודה צ'ופסטיק (אלטרנטיבית)WPI World Precision InstrumentsSTX2
כליכלי כללי
Digispark / ATtiny85AZ-Delivery Vertriebs GmbHDigispark Rev.3 Kickstarter
DMEM:F12Gibco (Thermo Fisher)31330038
סרום עגל עוברי (FCS)/סרום בקר עוברי (FBS)LifeTechnologies10270106
מוסיף מסנן 3µ m שקוףגריינר Bioone662631
HIBCPPהירושי אישיקאווה / הורסט שרוטן
חשפניתכלי כללי
מסוףציוד כללי (גנרי)
אוסצילוסקופHAMEGהיקף אחסון דיגיטלי HM 208
פלוטרPHILIPSPM 8143 מקליט XY
תוכנה Arduinohttps://www.arduino.ccArduino 1.8.9
מלחם ברזלכללי
זיזיציוד כללי (גנרי)
כבל טלפון עם מחברציוד כללי (גנרי)
נגד בדיקהMerck MillicellMERSSTX04
מולטימטר True-RMSVOLTCRAFTVC185
מטעןציוד כללי (גנרי)
כבלציוד כללי (גנרי)
וולטומטר למדידת TEERמכשירי דיוק עולמייםEVOM
וולטומטר למדידת TEER (אלטרנטיבית)Merck MillicellERS
טבעותציוד כללי (גנרי)
נגד תקע בננה אלקטרודה לחיצה בידוד ברק כלי הלחמה RJ14 (6P4C) USB מאריך USB קצה חוט

מקורות

  1. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30, 228-234 (2003).
  2. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).
  3. Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212, 173-179 (2013).
  4. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 19, 1872-1874 (2005).
  5. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160(2014).
  6. Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 30, 19-28 (2001).
  7. Muruganandam, A., Herx, L. M., Monette, R., Durkin, J. P., Stanimirovic, D. B. Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 11, 1187-1197 (1997).
  8. Ishiwata, I., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroids plexus papilloma cell line (HIBCPP). Human Cell. 18, 67-72 (2005).
  9. Dinner, S., et al. A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
  10. Schwerk, C., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in a novel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PLoS One. 7, e30069(2012).
  11. Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11, 323-336 (2009).
  12. Gath, U., Hakvoort, A., Wegener, J., Decker, S., Galla, H. J. Porcine choroid plexus cells in culture: expression of polarized phenotype, maintenance of barrier properties and apical secretion of CSF-components. European Journal of Cell Biology. 74, 68-78 (1997).
  13. Haselbach, M., Wegener, J., Decker, S., Engelbertz, C., Galla, H. J. Porcine Choroid plexus epithelial cells in culture: regulation of barrier properties and transport processes. Microscopy Research and Technique. 52, 137-152 (2001).
  14. Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10, 1473-1491 (2013).
  15. Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. Journal of Pharmaceutical Sciences. 89, 63-75 (2000).
  16. Mathia, N. R., et al. Permeability characteristics of calu-3 human bronchial epithelial cells: in vitro-in vivo correlation to predict lung absorption in rats. Journal of Drug Targeting. 10, 31-40 (2002).
  17. Fuchs, S., et al. Differentiation of human alveolar epithelial cells in primary culture: morphological characterization and synthesis of caveolin-1 and surfactant protein-C. Cell and Tissue Research. 311, 31-45 (2003).
  18. Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. The Journal of Cell Biology. 98, 1033-1041 (1984).
  19. Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
  20. Yeste, J., et al. Geometric correction factor for transepithelial electrical resistance measurements in Transwell and microfluidic cell cultures. Journal of Physics D Applied Physics. 49 (37), 3754(2016).
  21. Northrup, E. VI: The Measurement of Low Resistance. Methods of Measuring Electrical Resistance. , McGraw-Hill. 100-131 (1912).
  22. Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3 (Suppl 2), 123-126 (2004).
  23. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15, 145-150 (2013).
  24. Esch, M. B., et al. On chip porous polymer membranes for integration of gastrointestinal tract epithelium with microfluidic 'body-on-a-chip' devices. Biomedical Microdevices. 14, 895-906 (2012).
  25. Arduino IDE. Arduino Web Editor. , https://www.arduino.cc/en/Main/Software (2019).
  26. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 5(2013).
  27. Hufnagl, M. Time Resolved Transepithelial Impedance Spectroscopy Of Caco 2 Monolayers Relying on Lithographically Patterned Basolateral Electrode Cell Arrays. , University of Vienna. (2010).
  28. Guimerà, A., Gabriel, G., Parramon, D., Calderón, E., Villa, R. Portable 4 Wire Bioimpedance Meter with Bluetooth Link. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. International Federation of Medical and Biological Engineering Proceedings. Dössel, O., Schlegel, W. C. 25/7, Springer. Berlin, Heidelberg. (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TEERChopstickTranswellChoroid PlexusMicrocontroller
גישה פשוטה לבצע מדידות הטיר באמצעות עצמית וולט-אמפר מונה עם תדר פלט ניתן לתיכנות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.