Exon דילוג ישירות מיותצינורות שהתקבלו מתאי שתן אנושיים

סיכום

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור מודל יעיל של שריר ניוון שרירים Duchenne באמצעות MYOD1-המרה בתאי השתן כדי להעריך את השיקום של mrna הדיסטרופין ואת רמות החלבון לאחר דילוג קפיצה.

תקציר

ניוון שרירים duchenne (DMD), מחלת שרירים מתקדמת וקטלנית, נגרמת על ידי מוטציות בגנים Dmd כי התוצאה העדר של חלבון הדיסטרופין. עד היום, השלמנו מחקר ראשון ביוזמת החוקרת במרכז הלאומי לנוירולוגיה ופסיכיאטריה על בסיס הזרקה מערכתית של מחלת האוליונואותים והדס אשר נוטה exon-53 דילוג. לטיפול יעיל של DMD, בדיקות חוץ גופית עם myoblasts נגזר מהחולים DMD למסך תרופות להעריך את הזכאות למטופל לפני התחייבות ניסויים קליניים הוא חשב חיוני. לאחרונה, אנו דיווחו תא חדש MYOD1-המרה של שתן (udc) מטופלים עם המעכב מתילייסטון מעכבי (3-deazaneplanocin a הידרוכלוריד), כמודל הסלולר של dmd. UDC חדש אוטוולוגי עשוי להראות פניאוסקופיה של מחלת הפנוטיפים ספציפיים של DMD, המוביל ליישום של רפואה מדויקת במגוון של מחלות הקשורות שרירים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור מודל יעיל של תאי שריר DMD באמצעות MYOD1-udcs המרה יחד עם הפוכה הטרנססקריפט פולימראז התגובה שרשרת (RT-PCR), מערבי לחסום, ואימונוציטוטוכימיה כדי להעריך את השיקום של mrna הדיסטרופין ואת רמות החלבון לאחר לדלג דילוג.

מבוא

ניוון שרירים duchenne (DMD), מחלת שרירים מתקדמת, קטלנית, נגרמת על ידי מוטציות משמרת מסגרת ב- Dmd גן כי התוצאה העדר חלבון הדיסטרופין¹. מניעת טיפול מבוסס-הגאות מדלגת על תרפיה מבטיחה להיות מבטיח עבור DMD. טיפול זה מבוסס על ההמרה של DMD הפנוטיפ ביותר של בקר מתון ניוון שרירים כמו הפנוטיפ על ידי שינוי טרום mRNA שחבור לשחזר את מסגרת הקריאה Dmd ². השלמנו לאחרונה מחקר הראשון של האדם המבוסס על חוזרות ונשנות של הממשל החוזר של זרחניות oliglllllllllllllllllllllle (pmo), אשר יכול לגרום אקסון 53 דילוג ב dmd, והפגינו פרופיל בטיחות מעולה,³יעילות מבטיחה 000010964,

עם זאת, כדי לפתח טיפולים חסכוניים ויעילים למחלה, בדיקות חוץ גופית שימוש בתאי שריר העיקרי שהתקבלו מחולים DMD חיוניים לסינון סמים ואימות זכאות החולה לפני התחייבות ניסויים קליניים, כמו גם בסמנים המשקפים את היעילות של מדלג על טיפולים במהלך ניסויים אנושיים⁴. לאחרונה, אנו דיווחו על טכנולוגיה הרומן כדי לפתח מטופלים ספציפיים MYOD1המרה תאים שמקורם בשתן (udcs)^5,6 כמודל הראשי של מחוז myoblast⁷. כך, כדי ליצור את myoblasts, רק אוסף של שתן מחולים נדרש ולא הליך פולשני נדרש. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור מודל יעיל של שריר DMD באמצעות MYOD1המרה udcs מטופלים עם 3-deazaneplanocin הידרוכלוריד כדי להעריך את הדיסטרופין משוחזר mrna ו חלבון לאחר דילוג להקפיץ.

פרוטוקול

ועדת האתיקה של המרכז הלאומי לנוירולוגיה ופסיכיאטריה אישרה את המחקר (מזהה אישור: A2017-018, A2018-029). כל האנשים נתנו הסכמה מושכלת לפני מתן שתן. כל הניסויים נערכו תחת ההנחיות והתקנות הרלוונטיות.

1. בידוד ותרבות ראשית של UDCs

הערה: udcs היו מבודדים על פי פרוטוקול שפורסם בעבר^8,9,10 עם כמה שינויים.

1. איסוף דגימות שתן במהלך micturition ספונטנית בבקבוקי פלסטיק מעוקר.
   הערה: אין צורך בעיקור של פתח השופכה החיצוני. מידסטרים שתן רצוי כדי להפחית את הסיכון של זיהום נגיפי. אם זמן המניה לפני ההליך הבא הוא > 1 h, יש להעביר דגימות שתן ל-4 ° צ' כדי לשמר את הכדאיות של התא. עם זאת, יש להימנע מטמפרטורה של < 4 ° צ' מכיוון שעלולים להופיע מאיצים לא מסיסים.
2. צנטריפוגה את דגימת השתן כולה ב 400 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
3. . משאיר 1 מ ג בשפופרת
4. השהה מחדש את כדורי בנפרד 1 mL של שתן ולאחר מכן לאסוף אותם בצינור 50 mL אחת.
5. הוסף 10 מ ל של מאגר כביסה המורכב 99 mL של PBS ללא סידן ומגנזיום, 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S), 0.5 μg/mL אמפוריטיצין B, ו צנטריפוגה את הדגימות ב 200 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
6. משאיר 0.2 mL. בצינור הקירור
7. השהה מחדש את כדורי התא ב 4.5 mL של המדיום הראשי מורכב מתערובת 1:1 של גלוקוז גבוה בינונית משתנה הנשר של מדיום (DMEM) בלי סודיום פירובט ו-F-12 מזון מזינים של Ham שיושלם עם גורם גידול באפידרמיס האנושי רקומביננטי (EGF), אינסולין, הידרוקורטיזון, אדרנלין, T3, העברת, 10% טטרציקלין-סרום העוברי בחינם (FBS), 1% P/S, ו 0.5 μg/mL אמפוריטיצין B.
8. הזרע את התאים בשלוש בארות של טין מצופה שש צלחות היטב (נפח כולל של כל טוב, 1.5 mL). מחולל תרבות ב 37 ° צ' ו 5% CO₂ עבור 24 שעות.
9. הוסף 1.5 mL של המדיום הראשי מדי יום עבור 3 הימים הבאים.
10. ביום 4, להחליף את המדיום עם 1.5 mL של גידול בינוני שיושלם עם EGF אדם רקומביננטי, אינסולין, הידרוקורטיזון, אדרנלין, T3, transferrin, 15% טטרציקלין-FBS חינם, 0.5% L-אלנין-L-גלוטמין, 0.5% חומצות אמינו לא חיוניות, ו 2.5 ng/mL פיברופיצוץ פקטור גידול-בסיסי (bFGF), רקומביננטי האדם הנגזר טסיות גורם גידול (PDGF), EGF, ו 1% P/S.
11. . לשנות את אמצעי הגדילה כל יום
    הערה: מושבות UDC מופיעות בתוך שבוע.
12. כאשר התרבות UDC הופך 80 על 90% confluent, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם PBS, לפצל את כל התאים באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA והזרע ב 3000-5000 תאים/ס"מ² אל המנה החדשה טין מצופה 60 מ"מ (מעבר 1).
    הערה: ניתן לאחסן את UDCs בחנקן נוזלי. UDCs מחולקים בדרך כלל ב 60 לפחות 70% השטף ב-60 מ"מ צלחת התרבות לתוך שלוש צינורות מלאי.

2. בניית ויראלי

1. ההגביר את אזור הקידוד של MYOD1 (NM_002478 .4) פלמיד על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR).
   הערה: התערובת לMYOD1 הגברה ותנאים עבור הציקלייר התרמי מוצגים בטבלה 1 ובטבלה 2, בהתאמה.
2. לזהות להקה אחת של כ 1,000 בגודל bp על ידי 0.7% agarose ג'ל אלקטרופורזה באמצעות 1 μL של מוצר ה-PCR המוגבר כדי לוודא שרצף MYOD1 מוגבר בהצלחה.
3. נקו את מוצר ה-PCR בעזרת ערכת הניקוי וקבעו את הריכוז שלו בעזרת ספקטרוסקופיה.
4. מודדת את התערובת כפי שמוצג בטבלה 3 ב 37 ° c לילה כדי לעכל וקטור הretroviral יעיל עם מערכת ט-on ו-גן עמיד בפני אנזימים הגבלה אזורים ממוקדים באתר שיבוט מרובים.
5. לזהות להקה אחת על ידי 0.7% agarose ג'ל אלקטרופורזה באמצעות 1 μL של המוצר מתעכל כדי לאשר כי וקטור retroviral יעיל היה מתעכל בהצלחה.
6. נקה את המוצר מתעכל באמצעות לנקות את ערכת ולקבוע את הריכוז שלה על ידי ספקטרוסקופיה.
7. כדי לשכפל את הקטע MYOD1 מוגבר (מופק על ידי שלבים 2.1-2.3) לתוך וקטור retroviral יעיל מתעכל (המיוצר על ידי שלבים 2.4-2.6), לבצע תגובת שיבוט ב-fusion. הגדר את התגובה כפי שמוצג בטבלה 4, מגדיר את התגובה עבור 15 דקות ב 50 ° c, ולאחר מכן מקום על הקרח.
8. בצע טרנספורמציה באמצעות התאים המוסמכים של E. coli לפי הוראות היצרן (טבלת חומרים).
9. בחר את התאים המוסמכים השתנה על ידי culturing על צלחת תרבות LB המורכב 10 g/L bacto טריטונים, 5 g/L bacto תמצית שמרים, 5 g/L הרוג, 15 g/L bacto אגר, ו 50 mg/L אמפיצילין.
10. להרים את המושבה הנבחרת ואת התרבות ליברות בינונית תרבות ללא bacto אגר ב 200 rpm ב 37 ° c לילה.
11. לטהר את הווקטורים הMYOD1-שנוספו באמצעות ערכת טיהורפלבאמצע (טבלת חומרים) וככמת באמצעות ספקטרוסקופיה.
12. ודא כי MYOD1 מוכנס כראוי לתוך וקטור retroviral יעיל ידי רצף ישיר של מוצר ה-PCR מוגבר על ידי המטרה התחל והפוכה בהתאמה משני הצדדים על פני רצף MYOD1 שנוספו.
    הערה: ניתן להבחין ברצף MYOD1 בין רצפים וקטוריים מבוססי כששיבוט ההיתוך מצליח.
13. עבור ייצור retroviral יעיל, הזרע את התאים האריזות ב 50,000 תאים/cm² על 10 ס מ מצופה קולגן לוחות ותרבות ב dmem עם 10% fbs מחולל לחות ב 37 ° צ' ו 5% CO₂ עבור 24 h.
14. כאשר התאים האריזות מתרבים 80% שליטה, לערבב 30 μg של MYOD1וקטורים retroviral יעיל שנוספו, 30 μg של וקטורים אריזה, ומגיב העברה המכיל פפטיד תאים (טבלה של חומרים) על ידי vortexing, ו דגירה אותם עבור 10 דקות.
15. הוסיפו את התערובת המועבדתית למדיום של תאי אריזה ומחולל תרבות ב37 ° c ו-5% CO₂.
    הערה: ציפוי קולגן הכרחי. החצייה יכולה להיות טובה יותר ב -24 שעות או יותר לאחר זריעה, מכיוון שאריזת תאים מתנתק בקלות מלוחית התרבות.
16. לאחר 4 שעות או לילה, לשנות את המדיום לגידול טרי בינוני.
17. לאסוף את supernatant ויראלי ולהחליף עם בינוני טרי ב 24 ו 48 h לאחר הזיהום ולשלב את סופרנטאנט.
18. כדי לרכז את supernatant ויראלי, לערבב אותו עם מרכז מגיב ו דגירה ב 37 ° c לילה, ואז צנטריפוגה ב 1,500 x g עבור 45 min ב 4 ° c.
19. לסנן את הרטרו וירוס על ידי מסנן pvdf עם נקבוביות 0.45 יקרומטר.
20. בדוק את סיכוייו של וקטור retroviral יעיל באמצעות ערכת PCR כמותי מערכת ציקלer תרמית על פי הוראות היצרן.
21. הפרד את הסופר הנגיפי לתוך מניות קטנות ומפצל אותם ב-80 ° c.

3. זיהום עם MYOD1-retroviral וקטור udcs

1. הזרע את UDCs ב 3000-5000 תאים/cm² על טין מצופה 60 mm צלחת.
2. לאחר 24 שעות של זריעה, להדביק את הרטרו המוברג (שלב 2.21) בריבוי של זיהום של 200 על ידי הוספת hexadime, ברומיד בריכוז של 8 μg/mL.
3. לאחר מחולל הדגירה של 24 שעות על 37 ° c ו-5% CO₂, להחליף את בינונית התרבות עם בינוני גדילה טריים המכיל 1 μg/mL puromycin כדי לבחור את התאים הMYOD1-התמרה. . לשנות את המדיום כל יום
   הערה: בעת בחירה עבור תאים MYOD1, 1 Μg/mL puromycin משמש בדרך כלל לבחירה. יש לקבוע את המינון המתאים. השתמש בצלחת המכילה תאים בלתי מבוקר ובחר את המינון שהורג את כל התאים בתוך 3-5 ימים. MYOD1-תאים חיוביים יש לבחור בתוך 7-10 ימים לאחר הוספת puromycin. ניתן לאחסן את ה- MYOD1dc בחנקן נוזלי.

4. הבידול היוגניים של MYOD1-התמרה-בקרי מקור מטופלים עם 3-deazanein הידרוכלוריד (DZNep)

הערה: לאחרונה, זה כבר דווח כי DZNep, מתילסטון היפואז מעכבי, יכול לקדם באופן משמעותי את הביטוי של מיוגנאין, אחד הגורמים הרגולטורים שריר מאוחר, וגם להוביל בידול שפופרת⁷.

1. צלחת MYOD1-התמרה dc בארות מצופה קולגן בצפיפות של 3.5 x 10⁴ תאים/cm². מחולל תרבות ב-37 ° c ו-5% CO₂.
2. לאחר 24 שעות, לשנות את מדיום הצמיחה כדי בידול בינוני מורכב הסוכר גבוה הגלוקוז עם L-alanine-L-גלוטמין, 5% סרום סוסים, התוספת שלה, 1 μg/mL דוקסיציקלין, ו 5 μM DZNep.
   הערה: הפתרון 10 מ"מ DZNep ניתן לאחסן ב-80 ° c עבור 3 חודשים. להשתמש במקפיא להפשיר ולהימנע חוזרות ההפשרה מחזורים. שני MYOD1 מופעל על ידי דוקסיציקלין ו DZNep לדכא התפשטות ולקדם את הבידול מיוגניים של udcs. לכן, מומלץ כי דוקסיציקלין ו DZNep נוספו לאחר אינדוקציה של בידול מיוגני. DZNep מקדמת בידול מיוגני של MYOD1-udcs באופן תלוי-מינון. מצד שני, זה מראה על רעילות. ציטובית בריכוז גבוה לכן, לקבוע את הריכוז המתאים של DZNep, החל 1-10 μM בהתאם להשפעות שלה על בידול מיוגני וזמינות הסלולר.
3. לאחר 3 ימים, לשנות את המדיום בידול מדיום בידול טרי ללא DZNep. ואז, לשנות את המדיום כל 3 ימים.
   הערה: מיזוג של UDCs זה לזה והטופס מיוכן בתוך 1 עד 2 שבועות לאחר בידול.

5. exon דילוג ב- MYOD1המרה udcs

הערה: כאן, שלושה פרוטוקולים מתוארים כדי להעריך אקסון דילוג בתאי החולה-נגזר: 1) הפוכה הטרנססקריפט פולימראז תגובת שרשרת (RT-PCR) של הדיסטרופין mrna; 2) למחצה של אות חלבון הדיסטרופין משוחזר על ידי אבן חשופה מערבית; ו-3) למחצה של הדיסטרופין משוחזר של אות שוחזר על ידי אימונולוצינטוכימיה. כל השיטות יכולות לזהות מדלג בצורה תלוית-מינון.

1. הערכה של האקסון מדלג על יעילות על-ידי RT-PCR
   1. כדי להפוך את ה- MYOD1מחלת החלבון (aso) לתוך ה-udcs המרה של מטופלים ביום 7 לאחר בידול, לערבב ASO, מגיב העברה (טבלת חומרים), ובידול בינונית לריכוז הסופי של 1-10 מעלות μm. תרבות לחות על 37 ° c ו 5% CO₂.
   2. לאחר 72 h של דגירה עם ASO, לשנות את המדיום בינוני בידול טרי ללא אסו.
   3. החל מ 3-7 ימים לאחר הוצאת ה-ASO, הסר בידול בינוני ושטוף 1x עם PBS. הוסף מאגר פירוק תאים, לאחר UDCs והקציר הכולל RNA באמצעות ערכת החילוץ RNA.
   4. למדוד את הריכוז RNA עם ספקטרוסקופיה.
   5. לשלב את הריאגנטים הנדרש עבור תגובה אחת RT-PCR בצינורות PCR לפי שולחן 5.
   6. הניחו את צינורות ה-PCR עם התערובת בציקליית התרמוטראה. , הפעל את הציקלהתרמי. לפי שולחן 6
   7. לבצע אלקטרופורזה שבב ולחשב את האקסון מדלג על יעילות באמצעות ריכוז מולרי מתחת.
      Exon מדלגת על היעילות (100%)
      הערה: אחסן את מוצר ה-PCR במקרר ב-4 ° c לאחסון לטווח קצר או 20 ° c לאחסון לטווח ארוך.
2. זיהוי של הדיסטרופין לאחר דילוג על ידי בסיס מערבי
   1. מעבר ל-ASO ותרבות MYOD1-udcs לפי שלבים 5.1.1 ו5.1.2.
   2. . להחליף את המדיום כל 3 ימים
   3. לאחר 2 שבועות של בידול, לחלץ את החלבון הכולל מתאים מתורבת באמצעות radioimmunoprecipitation מאגר (ריפה) המכיל מעכבי פרוטאז.
   4. Sonicate lysates על קרח וצנטריפוגה ב 14,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c.
   5. לאסוף את סופרנטנט ולקבוע ריכוזי חלבון באמצעות ערכת שיטת החלבון BCA.
   6. הוסף 15 μg של חלבון מוחלט בצינור 0.5 mL ולדלל על ידי הוספת מאגר ריפה המכיל מעכבי פרוטאז לנפח הכולל של 10 μL. לרוץ 15 μg של חלבון מוחלט למסלול.
   7. הוסף מאגר לדוגמה, הפחתת הסוכן והמים האחרים כפי שמוצג בטבלה 7. הספרות הסלולרית מייעלות. ב-70 ° c במשך 10 דקות
   8. להכין את מאגר אצטט-tris פועל המכיל 8.95 g/L tricine, 6.06 g/L טריס בסיס, 1.0 g/L נתרן dodecyl סולפט (SDS).
   9. לטעון את המדגם (20 μL) אל טריס-אצטט 3 על 8% ג'ל ולבצע אלקטרופורזה ב 150 V עבור 75 דקות.
   10. הכן את מאגר הכתמים ללא מתנול.
   11. להשרות את קרום PVDF עבור 20 s ב מתנול ולאחר מכן במאגר לחסום עד השימוש (לפחות 10 דקות). חותכים את קרום PVDF לגודל של 6 x 8 ס מ באמצעות ג'לים מיני ו 8 x 12 ס מ באמצעות ג'לים midi.
   12. חותכים את הניירות לחסום בגודל זהה לזה של קרום PVDF ולהשרות את אלה במאגר לחסום עד השימוש.
   13. לאחר האלקטרופורזה, חותכים את הג לאותו גודל של קרום PVDF ומשרים את הג'ל במים מזוקקים.
   14. מניחים את הניירות הבלושים, קרום PVDF, ו ג'ל על מנגנון העברה חצי יבש (איור 1). העברה ב 4 mA/cm² עבור 30 דקות.
   15. שטפו את הממברנה 2x עם מים מזוקקים.
   16. להכין אנטי הדיסטרופין (1:500) ו anti-α-טובולין (1:1200) נוגדן כמו נוגדנים העיקרי.
   17. הכינו את הנוגדן האנטי-עכבר מצועם (1:100) כנוגדן משני.
   18. מודיית את הקרומים עם נוגדנים העיקרי, לשטוף עם מאגר לשטוף, ולאחר מכן דגירה עם הנוגדן המשני באמצעות מכשיר אוטומטי עיבוד מערבי (טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר.
       הערה: אנטי-α-טובולין נוגדן משמש בדרך כלל כבקרת טעינה. פתרונות הנוגדן העיקריים המעורבים, כולל 1:500 נגד הדיסטרופין ו 1:1200 anti-α-טובולין נוגדנים לעבוד היטב כאשר תגובת הנוגדן מבוצעת בו זמנית.
   19. שטפו את הקרום במים מזוקקים.
   20. לזהות את החלבונים באמצעות זיהוי כימול מגיב המכשיר מצמידים חיוב (CCD) מצלמה מבוססי imager.
   21. נתח את הנתונים באמצעות תוכנה מתאימה.
3. זיהוי של הדיסטרופין לאחר דילוג על ידי אימונוציטוטוכימיה
   1. מתכנת באופן ישיר את ה-UDCs לתוך מיופופרות ב-96 לוחית מצופה קולגן על פי שלבים 4.1-4.3.
   2. העברה של ה-ASO והתרבות MYOD1-udcs בהתאם לשלבים 5.1.2 ו5.1.3.
   3. לאחר 2 שבועות של בידול, לשטוף את התאים עם PBS ולתקן אותם ב 4% פאראפורמלדהיד עבור 10 דקות ב 4 ° c.
   4. חדירות MYOD1-udcs ב 0.1% nonionic ניקוי עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר ולחסום את אלה עם 10% סרום עז עבור 15 דקות ב 37 ° c.
   5. מודיית את התאים עם נוגדן העיקרי לילה ב 4 ° c.
   6. לשטוף את התאים עם PBS ו המדגירה אלה עם הנוגדן המשני עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: כאן, עכבר נגד הדיסטרופין (1:30) משמש כנוגדן העיקרי, אנטי עכבר IgG משמש את הנוגדן המשני, ו Hoechst (1:10000) משמש לצביעת גרעינים.
   7. תמונה לוחות באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט ולהשתמש מנתח כדי לחצי לכמת את האות הניאון באופן אוטומטי בכל טוב תחת באותו מצב.

תוצאות

נוכל לאסוף את האוקרי-משכל. בקלות ולא באופן פולשני UDCs הקימו מושבות בתוך שבוע לאחר תחילת תרבות התא העיקרי הבחנו יכולת ההתרבות מסומן. התרבות של UDCs היה פשוט, זיהום חיידקי או פטרייתי היה נדיר כאשר ההליך בוצע כראוי.

איור 2 מציג את הדמויות הייצוגיות לעומת זאת של מושבת ה-udc שבוע לאחר התרבות הראשית (איור 2א) ו- MYOD1-udc שבוע לאחר בידול (איור 2ב). איור 3 מציג את גילוי מוצלח של הדילוג אקסון ב udcs שהתקבלו מ-dmd חולים על ידי RT-PCR. איור 3מראה RT-PCR ניתוח של הדיסטרופין לאחר antisense הטיפול האנטי-והשפל ב dznep מטופלים MYOD1-udcs נגזר של גבר בן 6 עם אקסון 45-54 מחיקה ב dmd גן. מסגרת הקריאה הפתוחה שוחזרה באמצעות הקפיצה 44. ביום 14 בעקבות בידול, אנו אישר את האינדוקציה של אקסון לדלג בצורה תלוית מינון (איור 3ב). הלהקות העליונות מציינות מוצרים מקומיים, והלהקות הנמוכות יותר מציינות מוצרים שהמערכת דילגה עליהם מ44 שחזרו על מסגרת הקריאה הפתוחה.

איור 4 מציג את הזיהוי המוצלח של הדיסטרופין לאחר דילוג אקסון ב udcs שהתקבלו מ-dmd חולים על ידי המערב בצורה תלוית מינון. גילינו גם את הביטוי הדיסטרופין המשוחזר באמצעות אימונולוצינטוכימיה (איור 5). מדדנו את עוצמות הדיסטרופין עם מיקרוסקופ פלורסנט 1 שבוע לאחר ה96 החושים האנטי הגיוניות (ASO) על צלחת היטב (איור 5א). אותות פלורסנט גבוהים בהרבה נצפו ב- MYOD1-udcs שטופלו ב-aso מאשר ב- MYOD1-udcs שטופלו בבקרת aso (איור 5B).

תוצאות אלה מרמזות על כך שהחדש שלנו יכול להעריך אקסון מדלגת ביעילות ב- MYOD1-udcs שהתקבלו מ-dmd חולים ב-mrna וברמת החלבון.

איור 1: ייצוג סכמטי של מחסנית ההעברה לאבן חשופה מערבית למחצה. שני מסמכים שספוגים במאגר הכתמים הונחו בטרמינל השלילי, ושני ניירות שספוגים במאגר היו מוערמים על גבי זה. הג, אשר נספג במאגר, הונח בעדינות על קרום PVDF. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תמונות מייצגות של UDCs. (A) תמונת חדות פאזה של udcs שבוע לאחר התרבות הראשית. סרגל קנה מידה = 200 μm. שיבוץ: תמונה מוגדלת של האזור במלבן הלבן. (ב) תמונת חדות פאזה של MYOD1-udcs שבוע לאחר בידול. סרגל קנה מידה = 50 μm. דמות זו שונתה מתוך טקיזאווה ואח '⁷. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הערכה מוצלחת של הדילוג על האקסון בתאים שמקורם בשתן (UDCs) שהתקבלו מ-DMD חולים על ידי RT-PCR. (א) RT-PCR ניתוח של הדיסטרופין לאחר הטיפול נגד ההיגיון התרופה ב 3-deazaneplanocin הידרוכלוריד (dznep)-מטופלים MYOD1-udcs נגזר ניוון שרירים duchenne (dmd) החולה עם אקסון 45-54 מחיקה. DZNep מטופלים MYOD1-udcs טופלו גם עם השליטה antisense ב 1-10 μm ריכוז כפקדים. הלהקות העליונות היו בלתי מתויקות (Ex 45-54 מחיקה) שנשארה מחוץ למסגרת הקריאה. הלהקות הנמוכות יותר היו מוצרים 44 שהמערכת דילגה עליהם (לשעבר 44-54 מחיקה ו-Ex 44 שהמערכת דילגה עליהם) ששחזר את מסגרת הקריאה הפתוחה. (ב) דילוג על היעילות המחושבת כ 44 (התעתיק הנוכחי שהמערכת דילגה עליו)/(מקורי + אקסון 44-התעתיק המחושב [מסומן בחצים]) x 100% באמצעות מערכת אלקטרופורזה בשבב זעיר. בכיוון אחד של ANOVA ואחריו הבדיקה הפוסט-הוק של Bonferroni שימש כדי להשוות את מדלג היעילות (n = 3 עבור כל קבוצה, * * * * P < 0.0001). הנתונים מבוטאים כממוצע ± SEM. דמות זו שונתה מתוך טקיזאווה ואח '⁷. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: הערכה מוצלחת של הדילוג על האקסון בתאים שמקורם בשתן (UDCs) מ-DMD חולים על ידי אבן חשופה מערבית. (א) הנציג המערבי כתם עבור הדיסטרופין ב dznep מטופלים MYOD1-udcs מהמטופל dmd עם אקסון 45-54 מחיקה לאחר אקסון 44 דילוג. לאיתור הדיסטרופין, אנטי הדיסטרופין (נגד C-terminal) נעשה שימוש. (ב) עוצמות התנועה היחסיות של הלהקות מנורמלות לביטוי α-טובולין הושוו בתאים שמקורם בחולים עם ובלי טיפול אנטי-מונותי באמצעות ביצוע ANOVA חד כיוון ואחריו בדיקת ההודעה הפוסט הוק של Bonferroni (n = 3 עבור כל קבוצה, * * P < 0.01, * * * p < 0.001, דמות זו שונתה מתוך טקיזאווה ואח '⁷. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: החום מפות של אימונוציטוכימיה עבור הדיסטרופין לאחר antisense הטיפול האנטי-והשפל ב dznep מטופלים MYOD1-udcs שהתקבלו מחולה dmd עם אקסון 45-54 מחיקה. (A) מחיקה של אקסון 45-54 שוחזר את מסגרת הקריאה הפתוחה בהתבסס על דילוג אקסון של אקסון 44. (ב) עוצמת האות היתה בשימוש במיקרוסקופ פלורסנט לאחר 1 שבוע של אנטי-היגיון בשיטת ה96. בכיוון אחד ANOVA ואחריו הבדיקה הפוסט הוק של Bonferroni שימש השוואה (n = 3-4 עבור כל קבוצה, * * * * P < 0.0001). דמות זו שונתה מתוך טקיזאווה ואח '⁷. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ריאגנט	אמצעי אחסון	ריכוז סופי
2x PCR בכורה	12.5 מיקרומטר	1x
פריימר קדימה	5 כפול	0.2 μM
פריימר הפוכה	5 כפול	0.2 μM
תבנית	80
מים מזוקקים מעוקרים	עד 25 μL
נפח כולל לכל תגובה	25 μL

טבלה 1: תערובת לMYOD1 הגברה על-ידי RT-PCR.

98 ° c	עשרה מנות
55 ° c	עשרה מנות	} 35 מחזורים
72 ° c	עשרה מנות

שולחן 2: התנאים עבור הציקלייר תרמית עבור MYOD1 הגברה.

ריאגנט	אמצעי אחסון
מאגר 10x K	2 מיקרומטר
וקטור רטרונגיפי (500 ng/μL)	2 מיקרומטר
אנזים הגבלה 1 (2-ל -15 יו)	1 ליטר
אנזים הגבלה 2 (2-15 יו ')	1 ליטר
מים מזוקקים מעוקרים	14 μL
נפח כולל	20 μL

שולחן 3: תערובת לצינור לעכל וקטור הנגיף.

ריאגנט	אמצעי אחסון
קטע MYOD1 מזוקק	100
וקטור כפוף מתעכל	100
5x אנזימים מראשות הבמה	4 מיקרומטר
מים מזוקקים מעוקרים	עד 20 μL
נפח כולל	20 μL

שולחן 4: תערובת לתגובת שיבוט בהיתוך.

פתרון	אמצעי אחסון/היענות (μL)	ריכוז סופי
מים בחינם	שתנה	-
מאגר חד-PCR משלב אחד	4	1x
שילוב dNTP (המכיל 10 מ"מ של כל dNTP)	0.8	400 מ"מ של כל dNTP
פריימר קדימה (10 ממ)	1.2	0.6 ממ '
פריימר הפוך (10 מ"מ)	1.2	0.6 ממ '
שילוב אנזים חד-PCR	0.8	-
מעכב RNase (אופציונלי)	שתנה	5/10 יחידות/תגובות
תבנית RNA	50-400 מטרים
נפח כולל	20

שולחן 5: תרכובות הכרחי לתגובה אחת של הצעד היחיד RT-PCR.

1 מחזור	תעתיק הפוך	30 דקות	50 ° c
1 מחזור	שלב ההפעלה הראשונית של ה-PCR	15 דקות	95 ° c
1 מחזור	דנטורציה	1 דקות	94 ° c
	ריפוי	1 דקות	60 ° c
	סיומת	1 דקות	72 ° c
1 מחזור	הארכה סופית	7 דקות	72 ° c
החזיק		∞	4 מעלות צלזיוס

שולחן 6: מצב של ציקלאה תרמי לשלב אחד RT-PCR.

ריאגנט	אמצעי אחסון
חלבון (15 μg)	10 מיקרומטר
מאגר לדוגמה (4x)	5 מיקרומטר
הפחתת הסוכן (10x)	2 מיקרומטר
מים בדימוס	3 מיקרומטר
נפח כולל	20 μL

שולחן 7: הכנת דגימות עבור סודיום dodecyl סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל לג (SDS-עמוד).

דיון

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט של דילוג אקסון ב- MYOD1המרה udcs שהתקבלו מ-dmd חולים. באמצעות מערכת השיטה, הוקרן רצפי החושים אופטימלית ביעילות. אנו מניחים כי UDCs המרה MYOD1יכול להיות שימושי עבור החקירה של פתופסיולוגיה של המחלה.

הערכת דילוג אקסון באמצעות החולים נגזר תאים ברמת mrna היא הכרחית להקרנה תרופות חדשות והערכת זכאות למטופל לפני התחייבות ניסויים קליניים. החישוב של האקסון דילוג היעילות ניתן להעריך רק ברמת mRNA.

הערכה של אקסון דילוג ברמת החלבון חשוב גם מכיוון שחזור הדיסטרופין חשוב כמו ביואריקר פונדקאית כדי לנבא את היתרונות של בדילוג אקסון. עד כה, הקרנת ההקרנה של אנטי הגיוני רצפי הגאות מבוצעת לעתים קרובות באמצעות קווי השריר הראשי או שורות התאים המוכאיים כולל בתאי התמס האדם (RD) תאים, אבל אנחנו לא יכולים למדוד את ההתאוששות של רמות הדיסטרופין באמצעות קווי תא שריר או תא RD קווי כי הם מבטאים את זה חלבון ב אנחנו יכולים בבירור לזהות את השחזור של הדיסטרופין ב-DMD החולה נגזר MYOD1-udcs באופן תלוי במינון. בתוך הכדאיות החדשה שלנו, אנו מחשיבים כי הערכת החלבון המשוחזר על ידי הכתמים המערביים מעולה בקוונפיבביליות. מצד שני, הערכה על ידי אימונוציטוכימיה באמצעות 96 צלחות היטב היא אידיאלית לסינון תרכובות מועמד רבים בו זמנית.

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור שריר DMD מודל יעיל באמצעות MYOD1-udcs המרה יחד עם RT-PCR, בלוק המערבי, ואימונוציטוטוכימיה להעריך את הדיסטרופין המשוחזר ב-mrna ורמות החלבון לאחר דילוג להקפיץ. ניתן לאסוף את UDCs באופן בלתי פולשני ובקלות. לכן, אנו מניחים כי החדש לחלוטין בשיטת החוץ הגופית ניתן להחיל על מגוון רחב של מחקרים בסיסיים וטרנסלבותית ללא קשר לסוג של הפרעות שרירים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1% P/S תמיסת תרמו מיוצב	Thermo Fisher	15070-063	תרבית תאים
אמפוטריצין B	Sigma Aldrich	A2942
אנטי-דיסטרופין	Abcam	ab15277	כתם מערבי (WB)
אנטי-דיסטרופין	Leica	NCL-DYS1	אימונוציטוכימיה (ICC)
נגד עכברים IgG, Dylight 488	Vector Laboratories	DK-2488	ICC
Anti-α-tubulin	Sigma	T6199	Western bot and ICC
BZ-X800	KEYENCE	BZ-800	מיקרוסקופ פלורסנט
CELLBANKER	ZENOAQ	CB011	מלאי תאים בחנקן נוזלי
ChemiDoc MP Imaging System	Bio-Rad	170-8280J1	WB
CloneAmp HiFi PCR premix	Clontech	639298	ייצור רטרו-ויראלי
קוקטייל מעכב פרוטאז cOmplete			מיצוי חלבון 4693116001 עבור WB
E.coli DH5 ואלפא; תאים מוכשרים	TAKARA	9057
ECL פריים מערבי איתור כתמים מגיב	GE בריאות	RPN2232	WB
EGF	Peprotech	AF-100-15	תרבית תאים
Endo-Porter	GeneTools	2922498000	ASO transfection
נייר מסנן כתם עבה במיוחד	Bio-Rad	1703965	WB
EzFastBlot HMW	Atto	AE-1460	WB
גורם גדילה פיברובלסטים-בסיסי	Sigma-Aldrich	F0291	תרבית תאים
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050-061	תרבית תאים
GP2-293 תאי אריזה	Clontech	631458	ייצור רטרו-ויראלי
Ham's F-12 תערובת חומרים מזינים	Thermo Fisher Scientific	11765-054	תרבית תאים
גלוקוז גבוה DMEM עם GlutaMAX-I	Thermo Fisher Scientific	10569-010	תרבית
תאים DMEM גלוקוז גבוה ללא נתרן פירובט	GE Healthcare	SH30022.01	תרבית תאים
HiSpeed ערכת טיהור פלסמיד	QIAGEN	12643	ייצור רטרו-ויראלי
היסטופין כתם פשוט MAX	PO NICHIREI BIOSCIENCE INC.	424151	WB
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570	ICC
Human PDGF-AB	Peprotech	100-00AB-10UG	תרבית תאים
iBind Flex Solution Thermo	Fisher Scientific	SLF2020	WB
iBind Flex Western Device	Thermo Fisher Scientific	SLF2000	WB (מכשיר אוטומטי לעיבוד מסטרן)
ממברנת העברת Immobilon-P (PVDF)	MERCK	IPVH304F0
WB In-Fusion HD ערכת שיבוט	Clontech	639648	ייצור רטרו-ויראלי
ITS תוסף מדיה נוזלית	Sigma-Aldrich	I3146	תרבית תאים
MILTEX HV 0.45 μ m filter	MERCK	SLHV033RS	ייצור רטרו-ויראלי
MultiNA	SHIMADZU	MCE-202	אלקטרופורזה של שבב
MYOD1 (GFP-tagged)	ORIGENE	RG209108	ייצור רטרו-ויראלי
NanoDrop	Thermo Fisher	ND-ONE-W	ספקטרופוטומטר
חומצות אמינו לא חיוניות	Thermo Fisher	11140-050	תרבית תאים
ערכת ניקוי ג'ל ו-PCR NucleoSpin	Clontech	740986.20	ניקוי PCR NuPAGE
3-8% Tris-Acetate ג'ל חלבון	Invitrogen	EA03785BOX	WB
NuPAGE נוגד חמצון	Invitrogen	NP0005	WB
NuPAGE LDS מאגר מדגם	Invitrogen	NP0007
WB NuPAGE חומר להפחתת דגימה	Invitrogen	NP0009	WB
NuPAGE Tris-Acetate SDS מאגר ריצה	Invitrogen	LA0041	WB
צעד אחד שחפת ירוק PrimeScript RT-PCR ערכת	TAKARA	RR066A	בדיקת טיטר של וקטור רטרו-ויראלי
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190-250	תרבית תאים
Pierce BCA ערכת בדיקת חלבון	Thermo Scientific	23227
WB זיהום פוליברן / טרנספקציה מגיב	Sigma-Aldrich	TR-1003	זיהום רטרו-ויראלי
pRetroX-TetOne-Puro וקטור	Clontech	634307	Retroviral vecor
Puromycin	Clontech		631305 תרבית תאים
QIAGEN OneStep RT-PCR ערכת	Qiagen	210212	PCR
REGM ערכת כדורים	Lonza	CC-3190	חומר למדיום גידול של UDCs
REGM SingleQuots	Lonza	CC-4127	חומר למדיום ראשוני של UDCs
סט טיטר רטרו-וירוס	TAKARA	6166	בדיקת טיטר של וקטור רטרו-ויראלי
רכז רטרו-X	Clontech	631455	ייצור רטרו-ויראלי
מאגר RIPA	Thermo Fisher Scientific	89901	ערכת
WB RNeasy	Qiagen	74104	מיצוי RNA עבור PCR
סרום בקר עוברי נטול טטרציקלין	Clontech	631106	תרבית תאים
Triton-X	MP Biomedicals	9002-93-1	ICC
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25300054	תרבית תאים
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001	WB
Xfect מגיב טרנספקציה	Clontech	631317	טרנספקציה של פלסמידים לתאי אריזה