הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פגיעה באיבר איסכמיה-רפרופוזיה על ידי הדמיית שינויים המודינמיים במודל השתלת כבד עכברוש

4.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61779

⸱

6 במרץ 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Intensive Care Unit, The Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, 2Department of hepatobiliary surgery, The Affiliated Ningbo Medical Center Lihuili Hospital of Medical School of Ningbo University, 3Department of transplantation, The Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, 4Digital Technology and Engineering college, Ningbo University of Finance & Economics

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מספק תיאור מפורט של איך לבנות מודל של בעלי חיים של השלב האנהפטי (איסכמיה בכבד) בחולדות כדי להקל על מחקר בסיסי לתוך פגיעה איסכמיה-reperfusion לאחר השתלת כבד.

תקציר

השתלת כבד אורתוטופית (OLT) בחולדות היא מודל חיה מנוסה ומוכח המשמש למחקרים טרום ניתוחיים, תוך ניתוחיים ולאחר הניתוח, כולל פגיעה בהשמדת איסכמיה (IRI) של איברים חוץ-רחמיים. מודל זה דורש ניסויים והתקנים רבים. משך השלב האנהפטי קשור קשר הדוק לזמן לפתח IRI לאחר ההשתלה. בניסוי זה, השתמשנו בשינויים המודינמיים כדי לגרום נזק לאיברים חוץ-פתטיים בחולדות וקבענו את זמן הסובלנות המרבי. הזמן עד לפגיעה החמורה ביותר באיברים השתנה עבור איברים שונים. שיטה זו יכולה בקלות להיות משוכפל והוא יכול לשמש גם כדי ללמוד IRI של איברים extrahepatic לאחר השתלת כבד.

מבוא

פגיעה בהפצרת איסכמיה (IRI) היא סיבוך נפוץ לאחר השתלת כבד. IRI כבד הוא תהליך פתולוגי מעורבים נזק לתאים בתיווך איסכמיה והידרדרות חריגה של רפרופורציה בכבד. IRI הכבד ואת התגובה החיסונית המולדת המקומית ניתן לחלק IRI חם וקר, על פי הבדלים בסביבה הקלינית1. IRI חם הוא המושרה על ידי פגיעה בתאי גזע, בדרך כלל כתוצאה של השתלת כבד, הלם, וטראומה2. קר IRI הוא סיבוך של השתלת כבד הנגרמת על ידי תאי אנדותל ומחזור הדם ההיקפי3. דוחות קליניים הראו כי IRI הכבד קשורה 10% של כשלים איברים מוקדמים ועלול להגביר את השכיחות של דחייה חריפה וכרונית4,5. בנוסף, IRI הכבד עשוי גם לגרום תסמונות תפקוד לקוי של איברים מרובים או תסמונת תגובה דלקתית מערכתית, עם תמותה גבוהה6. חולים עם מעורבות איברים extrahepatic נוטים להישאר זמן רב יותר בבית החולים, להוציא יותר כסף, ויש להם פרוגנוזה גרועה יותר7. התפתחות הסיבוכים קשורה קשר הדוק לאורך השלב האנהפטי של השתלת כבד8.

השתלת כבד אורתוטופית (OLT) בחולדות דווחה לראשונה על ידי הפרופסור האמריקאי לי בשנת 1973. הפעולה הניסיונית דימה את השלבים של השתלת כבד קלינית ואת anastomosis של כלי הדם ואת צינור המרה המשותף (CBD) באמצעות שיטת התפירה. ההליך קשה וגוזל זמן עם שיעור נמוך שלהצלחה 9. בשנת 1979, קמהדע ואח 'עשה שיפור משמעותי OLT בחולדות על ידי שימוש יצירתי "שתי חפתים שיטה" עבור anastomosis של וריד הפורטל כדי לשלוט בשלב האנהפטי בתוך 26 דקות10. באותה שנה הציע צימרמן את "שיטת סטנט המרה הבודדת". על בסיס עבודתו של לי, צימרמן השתמש בצינורות פוליאתילן כדי לאנוס ישירות את ה- CBD של התורם והמקבל, פישט את השחזור של CBD ושימר את תפקוד הסוגר, ושיטה זו הפכה לסטנדרט לשחזור מרה של דגמי OLT11. בשנת 1980, מיאטה ואח ' הציעו את 'שיטת שלושת החפתים' שבה וריד הפורטל (PV), וריד הווריד העל-חושי (SVC) והווריד הווריד התוך-הפטי (IVC) היו אנטומיים בשיטת האזיקים. עם זאת, קיים סיכון של עיוות של הצינורית עם שיטה זו, אשר יכול להוביל לחסימת רנודה נחותה12. בשנת 1983, "שיטת שני חפתים" הוצעה בשיטת האזיקים לאנסטומוזיס של PV ו- IVC, אך אימצה את שיטת התפר עבור SVC13. שיטה זו אומצה על ידי חוקרים ברחבי העולם כדי להקים מודלים OLT. מאז, צעדים anastomosis חפתים שופרו כדי לקצר את השלב האנהפטי ולשפר את שיעור ההישרדות של החולדות14. באופן דומה, שיטות משופרות משמשות בפרקטיקה קלינית כדי לקצר את השלב האנהפטי15. עם זאת, מחקר בסיסי לתוך IRI לאחר השתלת כבד הראה כי שיעור ההישרדות קשורה באופן הפוך למידת הפגיעה באיברים extrahepatic. לכן, דרוש מחקר נוסף, ויש צורך במודל פשוט וניתן לשחזור של בעלי חיים כדי לדמות IRI לאחר השתלת כבד.

בהתבסס על ההגדרה של השלב האנהפטי, הדמינו את השינויים המודינמיים בהשתלת כבד וכתוצאה מכך IRI של איברים extrahepatic בחולדות. בזאת, אנו מספקים תיאור מפורט של איך לבנות מודל בעלי חיים של השלב האנהפטי (איסכמיה בכבד) בחולדות כדי להקל על מחקר בסיסי לתוך IRI לאחר השתלת כבד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ועדת האתיקה של בעלי החיים אישרה את הניסוי של האוניברסיטה הרפואית גואנגשי (No20190920). כל בעלי החיים סופקו על ידי המרכז לניסויים בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית גואנגשי. השתמשנו בחולדות Sprague Dawley זכר SPF (200-250 גרם, 10-12 שבועות), נשמר תחת טמפרטורת החדר של 25 ± 2 מעלות צלזיוס ולחות של 50 ± 10%. האכלה הופסקה 24 שעות לפני הניתוח; עם זאת, סופקו מים.

הערה: מפעיל אחד יכול לבצע את כל הפעולות ללא בסיס מיקרוכירורגיה או מיקרוסקופ כירורגי.

1. מבצע

  1. לאחר שקילה, יש לה רדום את החולדות עם isoflurane (5%) באמצעות מכונת הרדמה לבעלי חיים.
  2. לאחר 1-2 דקות, בעדינות מהדקים את בהונות החולדה בפינצטה. אם החולדה אינה מגיבה לאחר צביטה, היא נכנסה למצב של הרדמה. השתמש משחה וטרינר על העיניים כדי למנוע יובש. השתמש מנורות חימום בעלי חיים כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החולדות ב 37-38 מעלות צלזיוס.
  3. לאחר חיטוי בטן (פתרון יוד povidone), לתקן את החולדה על שולחן ניתוח בעלי חיים. בצע חתך חציוני של 3 ס"מ מתחת לתהליך xiphoid באמצעות מלקחיים ומספריים.
  4. פתח את חלל הבטן, לחשוף את הכבד באמצעות מפשק, ולגייס את הרצועה hepatogastric. השתמש ספוגיות כותנה כדי להפוך את האונה האמצעית של הכבד בעדינות ולהפוך אותו כלפי מעלה כדי לחשוף את הפטיס פורטה. זהה את CBD, PV ו- HA.
  5. לדחוף את המעי הדק לכיוון חלל הבטן התחתון השמאלי באמצעות ספוגיות כותנה, לכסות אותו עם גזה רטובה, ולהעביר את הווריד הווריד התוך-הפטי לווריד הכליה הימני.
  6. לבודד את וריד הפורטל, עורק הכבד, ואת הווריד הווריד הווריד הנחות מעל וריד הכליה הימני עם עדשה תוך עינית ומלקחיים המסומנים בחוט משי 3-0, כל אחד עם קשר להחליק.
  7. חותכים לפתוח את העור השמאלי והימני בגפיים התחתונות ולחשוף את וריד הירך באמצעות מלקחיים עיניים. לאט להזריק הפרין משקל מולקולרי נמוך 625 IU/kg דרך וריד הירך כדי heparinize את כל הגוף.
  8. לייגייט וריד הפורטל, עורק הכבד, ו vena קאווה נחות מעל וריד הכליות הימני עם מספר 3-0 תפרים, שנמשך 45 דקות (איור 1). החלף את המעי הדק בחלל הבטן ולכסות אותו עם גזה. להפחית הרדמה שאיפה בתקופות אלה.
  9. לאחר 45 דקות, לשחרר את וריד הפורטל, עורק הכבד, ואת הווריד הווריד נחות מעל וריד הכליה הימני.
  10. לתפור את השריר והעור, שכבה אחר שכבה, ולסיים את ההרדמה בשאיפה. לספק משכך כאבים לאחר הניתוח באמצעות מורפיום תת עורי של 5 מ"ג / קילוגרם כל 4 שעות.
  11. שימו לב לחולדה עד שהיא מתעוררת וניזונים בטמפרטורה של 25 ± 2 מעלות צלזיוס ולחות של 50 ± 10%. מנורות חימום בעלי חיים נחוצות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עמידות החולדות לאיסכמיה בכבד
במודל זה של בעלי חיים, האתרים שבהם כלי הדם היו קשורים במהלך ההפעלה מוצגים באיור 1. החולדות חולקו באופן אקראי ל-5 קבוצות עבור איסכמיה למשך 15 דקות (קבוצת I15), 30 דקות (קבוצת I30), 45 דקות (קבוצת I45), 60 דקות (I60) וקבוצת Sham, עם 10 חולדות בכל קבוצה. שיעור ההישרדות של כל קבוצה נצפה 14 ימים לאחר הניתוח. כל החולדות שרדו בקבוצת I15, קבוצת I30 וקבוצת זיוף. שמונה שרדו במשך 14 ימים בקבוצת I45, ורק 2 שרדו בקבוצת I60. תוצאות אלו מצביעות על כך שהחולדו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

OLT בחולדות הוא מודל אידיאלי לחקר שימור איברים בהשתלת כבד, IRI, דחיית השתלות, סובלנות חיסונית, פתולוגיה ופרמקולוגיה של השתלות, הומוטרנספלנטציה ושנאת זרים. כיום, הוא נמצא בשימוש נרחב במחקר הניסיוני של השתלת כבד.

במהלך מחקרי פיילוט ניהלנו לראשונה הרדמה תוך-פרטית של נתרן פנטוברביטל ומצאנו כי הדבר הוביל לתמותה גבוהה לאחר הניתוח ולסובלנות קצרה לשינויים המודינמיים. לכן, השתמשנו בהרדמה בשאיפה בניסויים הבאים להתחלה מהירה של פעולה והדרה מהירה של מאפייני במבחנה. המעבר להרדמה בשאיפה שיפר באופן מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברי כתב היד הזה אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

ברצוננו להכיר בהצעות השימושיות שניתנו על ידי ד"ר וון-טאו לי וד"ר ג'י-הואה וו מבית החולים השני המסונפים של האוניברסיטה הרפואית גואנגשי. המחברים רוצים להודות לחברי הצוות שלנו על הערות ודיונים שימושיים. המחברים גם רוצים להודות לסוקרים ולעורכים האנונימיים של JoVE על הערותיהם. תודה מיוחדת צריכה ללכת להוריו של ד"ר יואן על תמיכתם המתמשכת ועידודם. העבודה נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע Ningbo (2014A610248).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4% תמיסת פרפורמלדהידשנחאי מקלין ביוכימיה ושות', בע"מתנור
שנחאי Binglin אלקטרוניקה טכנולוגיה ושות', בע"מBPG
אלנין אמינוטרנספראז (ALT) ערכתElabscience ביוטכנולוגיה ושות', בע"מE-BC-K235-S
אמוניהסינופארם ריאגנטים כימיים ושות' בע"מערכת
Elabscience ביוטכנולוגיה ושות', בע"מE-BC-K005-M
אתנול נטול מיםסינופארם ריאגנטים כימיים ושות' בע"מ100092183
בעלי חיים מכונת הרדמהשנזן Ruiwode Life Technology Co. LtdR640
aspartate aminotransferase (AST) ערכתRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.S03040
מנתח ביוכימי אוטומטי.SIEMENS AG FWB:SIE, NYSE:SI Co., Ltd.2400
ביוסיסטמס (כאשר נסרי)צ'נגדו Taimeng אלקטרוניקה ושות', בע"מBL-420F
צנטריפוגהBaiyang מכשיר רפואי ושות', בע"מBY-600A
כיסוי זכוכיתג'יאנגסו שיטאי ציוד ניסיוני ושות 'בע"מ10212432C
ערכת קריאטיניןRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.S03076
מכונת התייבשותהונגריה 3DHISTECH ושות', בע"ממסדרת Donatello 2
Hubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd.KH-BL1
קפוא מכונהווהאן ג'ונג'י אלקטרוניקה ושות', בע"מJB-L5
המטוקסילין-אאוזין פתרון צבעווהאן Saiwell ביוטכנולוגיה ושות', בע"מG1005
יעילות גבוהה שעוות פרפיןשנחאי huayong שעוות פרפין ושות', בע"מQ / YSQN40-91
חומצה הידרוכלוריתסינופארם ריאגנטים כימיים ושות' בע"מ10011018
עדשה תוך עינית (IOL) מלקחייםגואנגג'ואו גואנגמיי ציוד רפואי ושות', בע"מJTZRN
IsofluraneShenzhen Ruiwode Life Technology Co., Ltd—
מספריים מיקרו (כאשר נסתר)מפעל מכשירים כירורגיים בשנחאיWA1010
מחזיקי מחטיםמפעל מכשירים כירורגיים בשנחאיJ32010
מסטיק ניטרלישנחאי Huashen ציוד ריפוי ושות', בע"מ—
מיקרוסקופ אופטי רגילNikon Instrument Shanghai Co., LtdNikon Eclipse CI
מלקחיים עינייםמפעל מכשירים כירורגיים בשנחאיJ3CO30מלקחיים עיניים ישרים
מפעל מכשירים כירורגיים בשנחאיJD1060כיפוף
מספריים עינייםמפעל מכשירים כירורגיים בשנחאיJ1E0
פורס פתולוגישנחאי Leica Instrument Co., LtdRM2016
פיפטותDragon Laboratory Instruments Co., Ltd.
מחזיריםבייג'ינג Jinuotai טכנולוגיה פיתוח ושות', בע"מסורק JNT-KXQ
הונגריה 3DHISTECH ושות', בע"מPannoramic 250
שקופיותווהאן Saiwell ביוטכנולוגיה ושות', בע"מG6004
קסילןסינופארם ריאגנטים כימיים ושות' בע"מ1330-20-7
ייבוש אוויר P804536 עמילאז 10002118 מכונת הטבעה 7010101008

מקורות

  1. Dar, W. A., Sullivan, E., Byon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
  2. Qiao, P. F., Yao, L., Zhang, X. C., Li, G. D., Wu, D. Q. Heat shock pretreatment improves stem cell repair following ischemia-reperfusion injury via autophagy. World Journal of Gastroenterology. 21 (45), 12822-12834 (2015).
  3. Liu, Y., et al. Activation of YAP attenuates hepatic damage and fibrosis in liver ischemia-reperfusion injury. Journal of Hepatology. 71 (4), 719-730 (2019).
  4. Hirao, H., Dery, K. J., Kageyama, S., Nakamura, K., Kupiec-Weglinski, J. W. Heme Oxygenase-1 in liver transplant ischemia-reperfusion injury: From bench-to-bedside. Free Radical Biology and Medicine. 157, 75-82 (2020).
  5. Motiño, O., et al. Protective role of hepatocyte cyclooxygenase-2 expression against liver ischemia-reperfusion injury in mice. Hepatology. 70 (2), 650-665 (2019).
  6. Guo, W. A. The search for a magic bullet to fight multiple organ failure secondary to ischemia/reperfusion injury and abdominal compartment syndrome. Journal of Surgical Research. 184 (2), 792-793 (2013).
  7. Elham, M., Mahmoudi, M., Nassiri-Toosi, M., Baghfalaki, T., Zeraati, H. Post liver transplantation survival and related prognostic factors among adult recipients in tehran liver transplant center; 2002-2019. Archives of Iranian Medicine. 1 (23), 326-334 (2020).
  8. Kim, E. H., Ko, J. S., Gwak, M. S., Lee, S. K., Kim, G. S. Incidence and clinical significance of hyperfibrinolysis during living donor liver transplantation. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 29 (3), 322-326 (2018).
  9. Czigány, Z. Improving research practice in rat orthotopic and partial orthotopic liver transplantation: a review, recommendation, and publication guide. European Surgical Research. 55 (1-2), 119-138 (2015).
  10. Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28 (1), 47-50 (1979).
  11. Zimmermann, F. A., et al. Techniques for orthotopic liver transplantation in the rat and some studies of the immunologic responses to fully allogeneic liver grafts. Transplantation Proceedings. 11 (1), 571-577 (1979).
  12. Miyata, M., Fischer, J. H., Fuhs, M., Isselhard, W., Kasai, Y. A simple method for orthotopic liver transplantation in the rat. Cuff technique for three vascular anastomoses. Transplantation. 30 (5), 335-338 (1980).
  13. Kamada, N. A., Calne, R. Y. Surgical experience with five hundred thirty liver transplants in the rat. Surgery. 93 (1), 64-69 (1983).
  14. Yang, L. F., et al. A rat model of orthotopic liver transplantation using a novel magnetic anastomosis technique for suprahepatic vena cava reconstruction. Journal of Visualized Experiments. 19 (133), e56933(2018).
  15. Liu, L. X., He, C., Huang, T., Gu, J. Development of a new technique for reconstruction of hepatic artery during liver transplantation in sprague-dawley rat. PLoS One. 10 (12), 0145662(2015).
  16. Paller, M. S., Hoidal, J. R., Ferris, T. F. Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure In the rat. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1156-1164 (1984).
  17. Schmidt, J., Lewandrowsi, K., Warshaw, A. L., Compton, C. C., Rattner, D. W. Morphometric characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat. International Journal of Pancreatology. 12 (1), 41-51 (1992).
  18. Chui, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J., Gurd, F. N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Archives of Surgery. 101 (4), 478-483 (1970).
  19. Kozian, A., et al. One-lung ventilation induces hyperfusion and alveolar damage in the ventilated lung:an experimental study. British Journal of Anaesthesia. 100 (4), 549-559 (2008).
  20. Shimada, S., et al. Heavy water (D2O) containing preservation solution reduces hepatic cold preservation and reperfusion injury in an isolated perfused rat liver (IPRL) model. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1818(2019).
  21. Nakamura, K. Sirtuin 1 attenuates inflammation and hepatocellular damage in liver transplant ischemia/reperfusion: from mouse to human. Liver Transplantation. 23 (10), 1282-1293 (2017).
  22. Blaire, A., et al. Surgical Considerations of Hilar Cholangiocarcinoma. Surgical Oncology Clinics of North America. 28 (4), 601-617 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

פגיעה באיבר איסכמיה-רפרופוזיה על ידי הדמיית שינויים המודינמיים במודל השתלת כבד עכברוש
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.