מטבולומיקה ממוקדת על תאים ראשוניים נדירים

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למדידה מדויקת ואמינה של מטבוליטים בסוגי תאים נדירים. שיפורים טכניים, כולל נוזל מעטפת שונה למיון תאים ויצירת דגימות ריקות רלוונטיות, מאפשרים כימות מקיף של מטבוליטים עם קלט של 5000 תאים בלבד לדגימה.

תקציר

תפקוד התאים תלוי באופן קריטי בחילוף החומרים, וניתן לחקור את תפקוד הרשתות המטבוליות הבסיסיות על ידי מדידת מתווכים של מולקולות קטנות. עם זאת, השגת מדידות מדויקות ואמינות של חילוף החומרים בתאים, במיוחד בסוגי תאים נדירים כמו תאי גזע המטופויטיים, דרשה באופן מסורתי איגום תאים מבעלי חיים מרובים. פרוטוקול מאפשר כעת לחוקרים למדוד מטבוליטים בסוגי תאים נדירים באמצעות עכבר אחד בלבד בכל דגימה, תוך יצירת מספר עותקים משוכפלים עבור סוגי תאים נפוצים יותר. זה מקטין את מספר בעלי החיים הדרושים לפרויקט נתון. הפרוטוקול המוצג כאן כולל מספר הבדלים מרכזיים על פני פרוטוקולים מטאבולומיים מסורתיים, כגון שימוש ב- NaCl 5 גרם / L כנוזל מעטפת, מיון ישירות לאצטוניטריל, ושימוש בכימות ממוקד תוך שימוש קפדני בתקנים פנימיים, המאפשרים מדידות מדויקות ומקיפות יותר של חילוף החומרים התאי. למרות הזמן הנדרש לבידוד תאים בודדים, צביעה פלואורסצנטית ומיון, הפרוטוקול יכול לשמר במידה רבה הבדלים בין סוגי תאים וטיפולים תרופתיים.

מבוא

חילוף חומרים הוא תהליך ביולוגי חיוני המתרחש בכל התאים החיים. תהליכים מטבוליים כוללים רשת עצומה של תגובות ביוכימיות המווסתות ומחוברות זו לזו, ומאפשרות לתאים לייצר אנרגיה ולסנתז ביומולקולות חיוניות¹. כדי להבין את תפקודן של רשתות מטבוליות, חוקרים מודדים את רמות המתווכים של מולקולות קטנות בתוך התאים. מתווכים אלה משמשים אינדיקטורים חשובים לפעילות מטבולית ויכולים לחשוף תובנות קריטיות לגבי תפקוד התאים.

ספקטרומטריית מסה (MS) היא הבחירה הפופולרית ביותר לזיהוי ספציפי של מטבוליטים בדגימות מורכבות ^1,2. לתהודה מגנטית גרעינית (NMR) יש יתרונות בכימות מוחלט של תרכובות והבהרת מבנה, אך טרשת נפוצה יכולה לעתים קרובות לפתור רכיבים נוספים בתערובות מורכבות כגון נוזלים ביולוגיים או תמציות תאים. לעתים קרובות יותר, טרשת נפוצה משולבת עם הפרדה קודמת של התרכובת על ידי אלקטרופורזה נימית (CE), כרומטוגרפיית גז (GC), או כרומטוגרפיה נוזלית (LC)³. הבחירה בפלטפורמת ההפרדה מונעת בעיקר על ידי מגוון המטבוליטים של המטרה וסוג הדגימה, ובסביבה בעולם האמיתי, על ידי זמינות המכונות והמומחיות. לכל שלוש פלטפורמות ההפרדה יש טווח רחב וחופף של מטבוליטים מתאימים אך מגבלות שונות. בקצרה, CE יכול רק להפריד מולקולות טעונות ודורש מומחיות רבה כדי ליישם ניתוח חזק של מספר רב של דגימות⁴. GC מוגבל למולקולות קטנות ואפולריות מספיק כדי להתאדות לפני פירוק³. בהתחשב בכל עמודות LC זמין מסחרית, כל שני מטבוליטים ניתן להפריד על ידי טכנולוגיה זו⁵. עם זאת, שיטות LC רבות מציגות פחות כוח פתרון מאשר שיטות CE או GC באורך דומה.

הכמות האופיינית של חומר מוצא למדידות מטבולומיות היא בדרך כלל בטווח של 5 x 10⁵ עד 5 x 10⁷ תאים לדגימה, 5-50 מ"ג של רקמה רטובה, או 5-50 מיקרוליטר של נוזל גוף⁶. עם זאת, זה יכול להיות מאתגר להשיג כמויות כאלה של חומר מוצא כאשר עובדים עם תאים ראשוניים של סוגי תאים נדירים, כגון למשל תאי גזע hematopoietic (HSC) או תאים סרטניים במחזור. תאים אלה נמצאים לעתים קרובות במספרים נמוכים מאוד ולא ניתן לטפח אותם מבלי לפגוע בתכונות תאיות קריטיות.

HSCs ותאי אב רב-פוטנטיים (MPPs) הם התאים הכי פחות ממוינים של המערכת ההמטופויטית ומייצרים ברציפות תאי דם חדשים לאורך חיי האורגניזם. הרגולציה של hematopoiesis הוא בעל רלוונטיות קלינית בתנאים כגון לוקמיה ואנמיה. למרות חשיבותם, HSCs ו-MPPs הם בין התאים הנדירים ביותר במערכת ההמטופויטית. מעכבר יחיד, בדרך כלל, ניתן לבודד כ- 5000 HSCs ^7,8,9. מכיוון ששיטות מטבולומיות מסורתיות דורשות יותר חומר קלט, איגום תאים מעכברים מרובים היה נחוץ לעתים קרובות כדי לנתח סוגי תאים נדירים^10,11.

כאן שאפנו לפתח פרוטוקול המאפשר מדידה של מטבוליטים ב-5,000 תאים בלבד לדגימה, כדי לאפשר הפקת נתונים מטאבולומיים מ-HSCs של עכבר בודד¹². יחד עם זאת, שיטה זו מאפשרת ליצור שכפולים מרובים מעכבר יחיד עבור סוגי תאים שופעים יותר כמו לימפוציטים. גישה זו מפחיתה את מספר בעלי החיים הדרושים לפרויקט נתון, ובכך תורמת ל"3R" (הפחתה, החלפה, עידון) של ניסויים בבעלי חיים.

מטבוליטים בתאים יכולים להיות בעלי שיעורי תחלופה גבוהים מאוד, לעתים קרובות בסדר גודל של שניות¹³. עם זאת, הכנת דגימות למיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) יכולה להימשך שעות, ומיון FACS עצמו יכול להימשך דקות עד שעות, מה שמוביל לשינויים פוטנציאליים במטבוליזם עקב תנאים לא פיזיולוגיים. לחלק מהריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה (כגון חיץ ליזה של אמוניום-כלוריד-אשלגן [ACK]) יכולות להיות השפעות דומות. תנאים אלה יכולים לגרום לעקה תאית ולהשפיע על רמות ויחסים של מטבוליטים בתוך התאים, מה שמוביל למדידות לא מדויקות או מוטות של חילוף החומרים התאי 14,15,16. השינויים המטבוליים עקב הכנת הדגימה מכונים לעיתים ממצאי מיון. פרוטוקולי עיכול ארוכים וריאגנטים קשים שעשויים להידרש כדי לייצר תרחיפים חד-תאיים מרקמות קשות או קשות עלולים להחמיר בעיה זו. השינויים שיכולים להתרחש תלויים ככל הנראה בסוג התא ובמצב העיבוד. טבעם המדויק של השינויים נותר לא ידוע, שכן לא ניתן למדוד את המצב המטבולי של התאים הבלתי מופרעים ברקמה החיה.

הפרוטוקול המוצג כאן כולל מספר הבדלים מרכזיים בהשוואה לשיטות מסורתיות, כלומר השימוש ב-NaCl 5 גרם/ליטר כנוזל נדן, מיון ישירות למאגר מיצוי, הזרקת נפחי דגימה גדולים על ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית של אינטראקציה הידרופילית (HILIC-MS), ושימוש בכימות ממוקד, שימוש קפדני בתקנים פנימיים ובבקרות רקע (איור 1). לפרוטוקול זה יש פוטנציאל לשמר הבדלים בין סוגי תאים ובין טיפול תרופתי לבקרת רכב במידה רבה¹². אפילו עבור תאים בתרבית, הוא משתווה לטובה לגישות חלופיות, כגון צנטריפוגה מבוססת יותר והסרה ידנית של סופרנטנט. עם זאת, מכיוון שמיון ממצאים עדיין עשוי להתרחש, יש לפרש את הנתונים בזהירות. למרות מגבלה זו, הפרוטוקול מייצג שיפור משמעותי בתחום האפיון המטבולי, ומאפשר מדידות מדויקות ומקיפות יותר של חילוף החומרים התאי בתאים ראשוניים נדירים¹².

היכולת למדוד באופן יציב פרופילים מטבוליים רחבים בתאים ראשוניים נדירים פותחת את הדלת לניסויים חדשים במחקר ביו-רפואי המערבים תאים אלה. לדוגמה, רגולציה מתווכת מטבולית ב- HSCs הוכחה כמשפיעה על יכולת התחדשות עצמית רדומה, עם השלכות על אנמיה ולוקמיה^11,17. בתאי גידול שמקורם בחולה, הבדלים בביטוי גנים מטבוליים בין הגידול לתאים סמוכים הוכחו^18,19. פרוטוקול זה מאפשר כעת לחוקרים לחקור הבדלים אלה באופן שיטתי ברמה המטבולית, הנחשבת בדרך כלל קרובה יותר לפנוטיפ התאי מאשר ביטוי גנים.

פרוטוקול

גידול וגידול של כל העכברים המשמשים לפרוטוקול זה נערכו במתקן קונבנציונלי לבעלי חיים במכון מקס פלנק לאימונוביולוגיה ואפיגנטיקה (MPI-IE) על פי תקנות הרשויות המקומיות (Regierungspräsidium Freiburg). עכברים הומתו באמצעות_CO2 ונקע צוואר הרחם על ידי צוות שהוכשר על ידי FELASA B בעקבות הנחיות ותקנות שאושרו על ידי הוועדה לרווחת בעלי חיים של MPI-IE והרשויות המקומיות. לא בוצעו ניסויים בבעלי חיים, ועכברים נותרו ללא נטל בריאותי.

הערה: לשיטות אנליטיות רגישות מאוד כגון שיטת LC-MS המשמשת בפרוטוקול זה יש פוטנציאל לזהות אפילו זיהומים קלים מאוד בדגימה. לכן, יש חשיבות עליונה למזער זיהומים כאלה. האמצעי החשוב ביותר הוא ללבוש כפפות נקיות בכל פעם שנוגעים בכל דבר שבא במגע עם הדגימות. זה כולל, למשל, הכנת חוצצים ונוזל נדן, תיוג של צינורות דגימה, וניקוי ציוד מעבדה. יתר על כן, יש להשתמש בכלי מעבדה חד פעמיים במידת האפשר. יש לשטוף את כלי הזכוכית בממיסים בדרגת LC-MS לפני השימוש. סביבת עבודה נקייה מסייעת עוד יותר להפחית זיהומים.

1. הכנות כלליות

1. הכן תמיסת מלאי סטנדרטית פנימית: הכן 6 מ"ג/מ"ל כלורו-פנילאלנין (CLF) ו-6 מ"ג/מ"ל חומצה אמינוטרפתלית (ATA) ב-30% v/v 2-פרופנול במים טהורים במיוחד.
2. הכנת מאגר מתלה FACS: הוסף 0.9 גרם NaCl, 99.5 מ"ל מים טהורים במיוחד ו-0.5 מ"ל של תמיסת מלאי סטנדרטית פנימית. מצננים מראש ל-4°C.
3. הכינו נוזל מעטפת: במיכל נוזל מעטפת, המיסו 30 גרם NaCl ב-6 ליטר מים שעברו דה-יוניזציה והתחברו לממיין תאים.
   הערה: ריכוז NaCl בנוזל הנדן עבר אופטימיזציה כדי לאפשר הסטה של טיפות במיון שהוא חזק כמו בעת שימוש PBS כנוזל נדן ובו זמנית כדי למזער השפעות שליליות על זיהוי מטבוליטים על ידי LC-MS¹². ריכוזים נמוכים יותר של NaCl מועילים לזיהוי מטבוליטים אך פוגעים במיון החזק של תאים.

2. בידוד תאי B ו-T מהטחול

1. קירור מראש של 90 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) לכל עכבר במקרר או על קרח עד 4°C. מצננים מראש צנטריפוגה ל-4°C.
2. בידוד הטחול
   הערה: חיוני ביותר לעבוד מהר, על קרח ועם מאגרים קרים (4°C) במהלך בידוד התאים ושלבי הצביעה הבאים. אחרת, הפרופיל המטבולי של התאים עשוי להשתנות במידה ניכרת.
   1. הכן 1.5 מ"ל של PBS בצינור תגובה של 2 מ"ל על קרח.
   2. יש להרדים עכבר C57BL6/J בהתאם להנחיות ולשיטות שאושרו על ידי הרשויות המקומיות.
   3. לעקר פרווה עם 70% אתנול.
   4. פתח את הבטן עם מספריים והסר את הטחול באמצעות מלקחיים עדינים מבלי לקרוע את האיבר. מיד מניחים את הטחול ב PBS קר (4 ° C).
3. יצירת מתלה חד-תאי
   1. הניחו מסננת תאים בגודל 70 מיקרומטר על צינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל והרטיבו אותה עם PBS. מעבירים את הטחול דרך הרשת באמצעות משענת האגודל של בוכנה מזרק ו 30 מ"ל של PBS קר (4 ° C)
   2. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant.
   3. יש להשהות מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של חיץ ליזה ACK ולדגור למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT; 20°C).
   4. הוסף 50 מ"ל של PBS קר (4 ° C). צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant.
4. צביעת FACS
   1. הכינו את קוקטייל הנוגדנים ב-500 מיקרוליטר PBS קר (4°C) לעכבר: CD3-PE (1:200), B220-A647 (1:200).
   2. השהה מחדש את גלולת התא בקוקטייל הנוגדנים. מעבירים לצינור FACS של 5 מ"ל. יש לדגור במשך 30 דקות ב-4°C צלזיוס בחושך.
   3. הוסף 3 מ"ל של PBS קר (4 ° C). צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant.
   4. השהה מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של חיץ השעיה FACS קר (4 ° C). סנן את התאים דרך שפופרת FACS עם מכסה מסנן. התאים מוכנים למיון מבוסס ציטומטריה של זרימה.

3. בידוד HSCs ו-MPPs ממח עצם

1. לנתח ולבודד את מח העצם.
   הערה: זה קריטי ביותר לעבוד מהר ולשמור על עצמות מבודדות ואת התאים קרים (4 ° C) במהלך כל ההליך כדי לאפשר תוצאות מדויקות. יתר על כן, כדי למזער אותות רקע, לעבוד ולהשתמש בחלל נקי וציוד מעבדה.
   1. המתת עכברים על פי הנחיות ושיטות שאושרו על ידי הרשויות המקומיות.
   2. רססו 70% אתנול על החלק התחתון של העכברים.
   3. לנתח את הרגליים ואת עמוד השדרה באמצעות מספריים. בצע חתך בגב והרחב את החתך סביב הבטן. מקלפים את העור מהגפיים האחוריות.
   4. לקרוע או לחתוך את הגפיים האחוריות, ולוודא שהרגליים מכילות את השוקה, עצם הירך ומפרק הירך.
   5. קחו את המספריים וגזרו אותם קרוב לצד עמוד השדרה עד להסרה מלאה.
   6. פזרו את הרגליים והקוצים ל-6 צלחות המכילות PBS קר (4°C) ושמרו את הצלחות על קרח.
   7. נקו את עצם הירך, השוקה, מפרק הירך והחוליות של רקמות רכות באמצעות אזמל ומספריים.
   8. למחוץ את העצמות לנקות עם טיט ו pestle ב 5 מ"ל של PBS קר (4 ° C).
   9. סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מ"ל.
   10. חזור על שלבים 3.1.8-3.1.9 עד שהעצמות נראות לבנות לחלוטין.
2. ליזה של אריתרוציטים:
   1. צנטריפוגה את תרחיף התא שנקטף ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ו להשליך את supernatant.
   2. השהה מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של חיץ ACK קר (4 ° C). דוגרים במשך 5 דקות על קרח.
   3. הוסף PBS קר (4 ° C) כדי לעצור את התגובה (אופציונלי).
   4. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהשליך את supernatant.
3. הידלדלות השושלת:
   הערה: כדי להעשיר תאים שליליים בשושלת (Lin-), נעשה שימוש בערכת בחירה שלילית עבור תאי CD4.
   1. הכינו את החרוזים המגנטיים:
      1. הוסף 500 μL של חרוזים לתוך 2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה. מניחים את הצינורות על מגנט ומשליכים את הסופרנטנט.
      2. לשטוף את החרוזים עם 1 מ"ל של PBS קר (4 ° C) ולהשליך את supernatant.
      3. הוסף 500 μL של PBS קר (4 ° C) ולשמור על החרוזים קרים (4 ° C).
   2. לדגור על התאים עם 500 μL של קוקטייל השושלת (50 μL של נוגדנים שסופקו על ידי הערכה + 450 μL של PBS) במשך 25 דקות (רועד, 4 ° C) בחושך.
   3. לשטוף את התאים עם PBS קר (4 ° C).
   4. צנטריפוגה את הצינור ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ו להשליך את supernatant.
   5. להשהות מחדש את התאים ב 1000 μL של PBS קר (4 ° C) ולהעביר את תרחיף התא לתמיסת החרוזים.
   6. דגירה במשך 15 דקות על גלגל מסתובב ב 4 ° C.
   7. הניחו את הצינורות על מגנט והמתינו עד שהתמיסה תתבהר. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור FACS טרי.
   8. לשטוף את החרוזים עם 500 μL של PBS.
   9. הניחו את הצינורות על מגנט והמתינו עד שהתמיסה תתבהר.
   10. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור FACS הטרי.
   11. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהשליך את supernatant.
4. צביעה עבור FACS
   1. הכינו 300 מיקרוליטר תערובת נוגדנים לעכבר ב-PBS קר (4°C).
   2. תערובת נוגדנים לתאי גזע / אב: HSCs: CD4 (1:1000)/ CD8a (1:1000)/ B220 (1:1000)/ Ter119 (1:500)/ Gr-1(1:1000)/ CD11b - PeCy7 (1:1000), c-Kit - PE(1:1000), Sca1 - APC-Cy7 (1:500), CD48 - BV421 (1:1000), CD150 - BV605 (1:300)
   3. לדגור על התאים במשך 40 דקות בחושך ב 4 ° C.
   4. לשטוף עם 1 מ"ל של PBS קר (4 ° C). צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהשליך את supernatant.
   5. השהה מחדש את כדורית התא ב-1 מ"ל של מאגר השעיית FACS וסנן את התאים דרך צינור FACS עם מכסה מסנן.

4. מיון FACS

1. הגדר את סדרן התאים.
   1. הכנס קצה פייה של 70 מיקרומטר. הפעל לייזרים של 405 ננומטר, 488 ננומטר, 561 ננומטר ו- 633 ננומטר.
   2. הגדר את מצב מיון ל- 4 Way Purity: מסיכת תפוקה 0, מסיכת טוהר 32, מסיכת פאזה 0
   3. הגדר את תדר הירידה ל- 90,400 הרץ, והתאם את המשרעת ואת עיכוב הירידה בהתאם להוראות היצרן. הגדר את מתח הצלחת ל- 5000 V.
   4. הגדירו שערי מיון בהתאם להוראות היצרן.
      1. עבור כל סוגי התאים, תחילה, בחר תאים בודדים בהתבסס על פיזור קדימה ואות פיזור צדדי, ולאחר מכן בחר בהתבסס על צביעה ספציפית לסוג התא.
      2. עבור תאי B, בחר את האוכלוסייה AF647-positive, PE-negative population.
      3. עבור תאי T, בחר את האוכלוסייה החיובית ל-PE, AF647-שלילית.
      4. עבור HSCs, בחר את PE-Cy7-נמוך, PE-חיובי, APC-Cy7-חיובי, BV605-חיובי, BV421-שלילי.
      5. עבור MPPs, בחר את PE-Cy7-נמוך, PE-חיובי, APC-Cy7-חיובי, BV421-חיובי, BV605-שלילי, אוכלוסייה.
      6. לדגימות פסולת, בחר אירועים קטנים מכדי לייצג תאים שלמים בהתבסס על פיזור קדימה ואות פיזור צדדי. תרשימי FACS טיפוסיים שמראים את אסטרטגיות ה-gating האלה מוצגות באיור 2 ובאיור 3.
   5. התאם את קצב הזרימה כדי לקבל פחות מ- 15,000 אירועים/שנייה.
2. הכנת צלחת איסוף
   1. הכינו תמיסת מלאי תמצית שמרים: השהה מחדש 1 aliquot של ¹³C תמצית שמרים ב 7.5 מ"ל של אולטרה טהור H₂O ו 2.5 מ"ל של מתנול.
   2. הכנת מאגר מיצוי: הוסף 10 μL של ¹³C תמיסת מלאי תמצית שמרים ל 10 מ"ל של אצטוניטריל וערבב.
   3. הכנת צלחת איסוף: הוסף 25 μL של חיץ החילוץ לכל באר של צלחת PCR 96 באר שתשמש לאיסוף הדגימה. כדי למזער אידוי, לכסות בארות עם מכסי PCR (פסים לחתוך סינגלים).
3. בצע את מיון התא.
   1. פתח את בארות האיסוף לפי הצורך כדי לאסוף תאים ממוינים וסגור אותם בהקדם האפשרי כדי למזער אידוי.
4. אם לא ניתן למדוד דגימות באופן מיידי, אחסנו אותן במיכלים אטומים בטמפרטורה של -80°C למשך מספר ימים. לאחר ההפשרה, סוניק את הדגימות במשך 5 דקות כדי להבטיח השעיה מלאה של מטבוליטים.

5. מדידת LC-QQQ-MS

1. הכינו ממיסים LC
   1. הכנת תמיסת ציר חומצה מדרונית (100 מ"מ): יש להמיס 17.6 מ"ג חומצה מדרונית ב-1 מ"ל של H₂O טהור במיוחד.
   2. הכנת חיץ A: ממיסים 1.92 גרם של אמוניום פחמתי ב-1 ליטר של H₂O טהור במיוחד, ומוסיפים 50 מיקרוליטר של תמיסת ציר חומצה מדרונית.
   3. הכינו חיץ B: ערבבו 50 מ"ל של חיץ עם 450 מ"ל של אצטוניטריל.
   4. הכינו תערובת בדיקת LC: ערבבו 1 חל"מ כל אחד של לאוצין, איזולאוצין, AMP, ADP ו-ATP ב-80:20 אצטוניטריל: אולטרה-טהור H₂O.
      הערה: ניתן לאחסן את מלאי החומצה המדרונית בטמפרטורה של -20°C למשך מספר חודשים; ניתן לשמור מאגרים אחרים ב- RT למשך יומיים.
2. שיטת LC-QQQ-MS
   1. מטב הגדרות טרשת נפוצה ספציפיות לתרכובת (למשל, אנרגיית התנגשות) בהתאם להוראות היצרן. עבור מכשירים מסדרת Agilent 6495, השתמש בהגדרות בטבלה משלימה 1.
   2. מטב הגדרות MS ספציפיות למקור בהתאם להוראות היצרן. עבור מכשירים עם מקור ESI מחומם JetStream, השתמש בפרמטרים הבאים: טמפרטורת גז: 240 °C, זרימת גז: 15 L/min, נבולייזר: 50 psi, נדן טמפרטורת גז: 400 °C, זרימת גז נדן: 11 L/min, מתח נימי: 2000 V, מתח זרבובית: 300 V.
   3. מטב את ההגדרות של אופטיקת העברת יונים בהתאם להוראות היצרן. עבור מכשירי Agilent עם אופטיקת יונים iFunnel, השתמש בפרמטרים הבאים: RF חיובי בלחץ גבוה: 110 V, RF שלילי בלחץ גבוה: 90 V, RF חיובי בלחץ נמוך: 80 V, RF שלילי בלחץ נמוך: 60 V.
   4. תכנת את שיפוע LC: 0 דקות, 95% B, 150 מיקרוליטר/דקה; 18 דקות, 55% B, 150 מיקרוליטר/דקה; 19 דקות, 30% B, 150 מיקרוליטר/דקה; 21.5 דקות, 30% B, 150 מיקרוליטר/דקה; 22 דקות, 95% B, 150 מיקרוליטר/דקה; 22.7 דקות, 95% B, 200 מיקרוליטר/דקה, 23.5 דקות, 95% B, 400 מיקרוליטר/דקה; זמן עצירה 28 דקות טמפרטורת עמודה: 35 °C.
3. הגדר מכשיר LC-MS.
   1. חבר את העמודה הכרומטוגרפית בתא העמודות מבוקר הטמפרטורה.
   2. חבר את המאגרים ונקה את כל הקווים.
   3. הפעל לפחות 4 דוגמאות ריקות או דוגמאות מאגר כדי לאזן את העמודה.
4. הפעל תמהיל בדיקות LC כדי לבדוק ביצועים כרומטוגרפיים. ודא שהקריטריונים הבאים מתקיימים. אם לא, נקה או פתור בעיות במכשיר לפני הפעלת הדגימות.
   1. ודא כי לחץ הגב ההתחלתי הוא <150 בר ולחץ הגב המרבי הוא <400 בר.
   2. ודא שזמני השמירה הם בחלון של ±1 דקות באופן הבא: איזולאוצין 6.0 דקות, לאוצין 6.4 דקות, AMP 9.5 דקות, ADP 11.2 דקות ו-ATP 12.7 דקות.
   3. ודא שהעמק בין לאוצין לאיזולאוצין במעבר +132->86 הוא < 20% מגובה השיא.
   4. ודא שההבדל בזמן השמירה בין AMP ל-ADP הוא 1.5 עד 1.9 דקות, וההבדל בזמן השמירה בין ADP ל-ATP הוא 1.1 עד 1.9 דקות.
5. הגדרת רשימת עבודה
   1. התחל עם מדגם ריק כדי למזער את הנשיאה מתמהיל הבדיקה LC.
   2. הפעל את הדגימות בסדר אקראי.
   3. סיים בדגימה ריקה כדי לנקות את העמודה לניסויים עתידיים.

6. עיבוד מראש של נתונים ב- automRm

הערה: השלבים הבאים דנים בהמרה מ- .d ל- .mzML ב- msconvert, הכנת metabdb, טעינת נתונים ומודלים ו- metabdb, ואסטרטגיות כלליות לסקירת שיא ידנית.

1. המר נתונים גולמיים מתבנית .d לתבנית .mzML באמצעות ProteoWizard²⁰ באמצעות ההגדרות הבאות: דיוק קידוד בינארי: 32 סיביות, MS רמות 1-2, כתיבת אינדקס נבחרה, האפשרות השתמש בדחיסת zlib נבחרה.
2. התחל R.
3. התקן automRm²¹ בהתאם לתיעוד החבילה (נדרש רק פעם אחת לפני השימוש הראשון).
4. הפעל ממשק משתמש גרפי automRm ב- R: automRm::automrm_gui()
5. עבד את האצווה של קבצי .d בכרטיסיה עבד > עבד אצווה.
   1. בחר קובץ .xlsx המכיל מידע מטבוליטים. קובץ זה חייב להתאים לשיטת LC-QQQ-MS.
   2. בחר. קובץ RData מחזיק שיא קטיף מודל ML.
   3. בחר. קובץ RData המחזיק את מודל ML דיווח שיא.
   4. בחר את תיקיית הפרויקט המכילה קבצי .mzML.
   5. התחל עיבוד מראש של נתונים על-ידי לחיצה על תהליך אצווה.
6. לאחר סיום העיבוד המוקדם, פתח peakoverview.pdf כדי לבדוק את הזיהוי הנכון של פסגות כרומטוגרפיות. לחלופין, טען את automRmdata_Review.RData מהכרטיסייה סקירה של ממשק המשתמש הגרפי automRm כדי לשנות באופן ידני סינון שיא ושילוב שיא.
7. פתח את peakinfo.xlsx מתיקיית הפרויקט ובדוק את הנתונים.
   1. בדוק אות תקן פנימי ^{של 13}C בכרטיסייה 13CArea: ודא שאין הבדלים שיטתיים בערכי העוצמה בין קבוצות הניסוי ובין דגימות תאים לדגימות פסולת. אם קיימים הבדלים כאלה, השתמש רק בנתונים מהכרטיסיות NormArea או NormHeight לניתוח הבא; אחרת, השתמש בנתונים מהכרטיסיות RawArea או RawHeight.
   2. בדוק את עוצמת האות של התקנים הפנימיים ATA ו- CLF בכרטיסיה RawArea. ודא שאין הבדלים שיטתיים בעוצמה של אף אחת מהתרכובות בין קבוצות הניסוי.
   3. עבור כל מטבוליט, השווה את עוצמת האות של דגימות המכילות תאים לדגימות פסולת מאותו תרחיף תאים. השתמש בבדיקה סטטיסטית מתאימה כדי לזהות מטבוליטים שבהם דגימות המכילות תאים הן בעלות עוצמות גבוהות יותר מאשר דגימות פסולת. כלול רק מטבוליטים שעוברים בדיקה זו בניתוח נתונים עוקב.

תוצאות

מיון FACS מאפשר בידוד של אוכלוסיות נקיות מסוגי תאים שונים מאותו תרחיף תאים (איור 2 ואיור 3). הספציפיות של שיטה זו מסתמכת על צביעה של סוגי תאים שונים עם סמני משטח ספציפיים (לדוגמה, תאי B ותאי T מהטחול) או שילובים ספציפיים של סמני פני שטח (לדוגמה, HSCs ו- MPPs). צביעה של סמנים תוך תאיים דורשת בדרך כלל חדירה של קרום התא. זה יכול לגרום לדליפה של מטבוליטים, ולכן סוג זה של כתמים אינו מתאים לשימוש בפרוטוקול זה.

LC מספק הפרדה של מטבוליטים לפני גילוי על-ידי טרשת נפוצה (איור 4). מטבוליטים פולטים מעמודת HILIC בערך לפי קוטביות, כאשר פחות תרכובות קוטביות פולטות מוקדם ויותר מטבוליטים קוטביים נפלטים מאוחר יותר. עוצמת האות נקבעת על ידי כמות מטבוליט המטרה במדגם וגורם תגובה ספציפי למטבוליט. כתוצאה מכך, לא ניתן להשוות באופן משמעותי את עוצמות האות בין מטבוליטים אלא רק עבור מטבוליט אחד על פני דגימות. 3 הפסגות המודגשות באיור 4 מייצגות 1: ניאצינאמיד מזוהה הן בפסולת והן בתמצית תאים, אם כי ברמות שונות, 2: אצטיל-קרניטין שמזוהה כמעט אך ורק בתמציות תאים, ו-3: חומצה אמינוטרפטלית סטנדרטית פנימית שמזוהה באותה רמה בדגימות פסולת ותמציות תאים.

הבדלים מטבוליים בין סוגי תאים מאותה רקמה נשמרים באמצעות פרוטוקול FACS-LC-MS משולב (איור 5). עבור HSCs ו-MPPs, תאים מ-6 עכברים נדרשו לייצר 6 דגימות, מה שהוביל לשונות גדולה יותר בתוך כל קבוצה בהשוואה לתאי B ותאי T, שמוינו מאותו טחול מורין. דגימות פסולת המייצגות דגימות בקרה ריקות בתהליך מופרדות בבירור מדגימות המכילות תמציות תאים. בתוך דגימות הפסולת נראית הפרדה ברורה בין שני הניסויים, המדגישה את ההבדל בסביבה המטבולית שהתאים חווים לפני המיון. כאשר הוא מיוצג במפת חום מקובצת (איור 6), מידע נוסף הופך גלוי, כגון הרמות היחסיות של מטבוליטים בין דגימות.

איור 1: סקירה כללית של שלבים מרכזיים בפרוטוקול המוצג. נתון זה הודפס מחדש באישור Schoenberger et ^al.12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: בידוד אוכלוסיות טהורות של תאי B ותאי T מהטחול. תאים ואירועי פסולת נבחרו בהתבסס על אותות פיזור קדימה (FSC) ופיזור צדדי (SSC). תאי B ותאי T נבחרו בהתבסס על אותות צביעה ספציפיים לסוג התא. נתון זה הותאם באישור Schoenberger et ^al.12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: בידוד של HSC ו-MPP ממח העצם. תאים ואירועי פסולת נבחרו בהתבסס על אותות פיזור קדימה (FSC) ופיזור צדדי (SSC). אוכלוסיות HSC ו-MPP נבחרו בהתבסס על שלבים מרובים של אותות צביעה ספציפיים לסוג התא. נתון זה הותאם באישור Schoenberger et ^al.12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: כרומטוגרמות לדוגמה. דגימות עם (A) 5000 HSCs ו-(B) 5000 אירועי פסולת מאותו סוג. שים לב שהציר חולק קנה מידה זהה בשתי החלוניות. מטבוליטים מודגשים הם 1: ניקוטינאמיד, 2: אצטיל-קרניטין, 3: חומצה aminoterephtalic (ATA). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) של פרופילים מטבוליים מסוגי תאים שונים ודגימות רקע של פסולת מאותם ניסויים. נצפתה הפרדה גדולה בין האיברים השונים ודגימות רקע של פסולת מכל איבר. בנוסף, סוגי תאים מופרדים בבירור בתוך התאים של כל איבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: מפת חום המייצגת מטבוליטים שנמדדו בין סוגי תאים שונים ודגימות בקרת רקע תואמות (פסולת). ערכים חסרים זוקפו עם ערך חצי מינימום של אותו מטבוליט בכל הדגימות. עבור plotting, הנתונים נורמלו למקסימום בנפרד בכל שורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה 1: הטבלה מפרטת את ההגדרות הספציפיות לתרכובת עבור המטבוליטים שנבחרו, כולל זמן שמירה (RT), קוטביות (Pol), מבשר m/z (Q1), מקטע m/z (Q3) ואנרגיית התנגשות (CE). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

הצעדים הקריטיים ביותר ליישום מוצלח של מטבולומיקה ממוקדת באמצעות פרוטוקול זה הם: 1) אסטרטגיית צביעה וגטינג חזקה שתניב אוכלוסיות תאים נקיות 2) טיפול מדויק בנפחי נוזלים, 3) תזמון ניתן לשחזור של כל שלבי הניסוי, במיוחד כל השלבים לפני מיצוי מטבוליטים. באופן אידיאלי, כל הדגימות השייכות לניסוי אחד צריכות להיות מעובדות ונמדדות באצווה אחת כדי למזער את השפעות האצווה²². עבור ניסויים גדולים יותר, אנו מציעים לאסוף תמציות תאים ב -80 ° C ולאחר מכן למדוד את כל התמציות באצווה אחת.

כאשר עובדים עם דגימות בעלות קלט נמוך, יש להדגיש טיפול נקי בכל החומרים המשמשים במהלך הניסויים²³. זיהומים נפוצים הם שאריות חיץ, דטרגנטים ומוצרי טיפוח העור. האמצעי החשוב ביותר למזעור הזיהום הוא שימוש בכפפות מתאימות לאורך כל הניסוי.

כדי למזער שינויים פוטנציאליים בהרכב המטבוליטים עקב חשיפה של תאים לתנאים לא פיזיולוגיים, חיוני להכין את הדגימות על קרח ועם ריאגנטים קרים (4 מעלות צלזיוס). כמו כן, להיות מהיר ככל האפשר לפני שלב FACS יגדיל את איכות המדידה². הזמנים המצוינים לצביעת נוגדנים הם קצרים ככל האפשר ליעילות צביעה טובה. צעד נוסף לחסימת קשירה לא ספציפית של נוגדנים לקולטני Fc באמצעות נוגדנים בלוק Fc ניתן להוסיף לפני הליך צביעת FACS^24,25. זה מונע זיהום של אוכלוסיות תאי היעד ומומלץ במיוחד כאשר עובדים עם תרחיפים של תאים הכוללים סוגים רבים של תאים גבוהים קולטן Fc (כמו מונוציטים או מקרופאגים) או תאים שגודלו בתרבית ללא נסיוב. עם זאת, זה יגדיל את זמן הטיפול הכולל ב 10-15 דקות ולכן עשוי להוסיף שונות לא פיזיולוגית נוספת לתוצאות.

עם השימוש בשיטות MRM דינמיות על ספקטרומטרים מודרניים של מסות, ניתן להקליט את כל המטבוליטים המפורטים בהגדרות ספציפיות לתרכובת בזריקה אחת. הגבלת מספר מטבוליטי המטרה מאפשרת יישום של הפרוטוקול המתואר על ספקטרומטרים ישנים יותר של מסות ומאיצה עיבוד מקדים של נתונים וניתוח נתונים.

רמה מסוימת של אות רקע בנתוני LC-MS היא בלתי נמנעת. לכן, יש לנקוט בזהירות רבה כדי לזהות את אותם מטבוליטים שניתן לזהות מעל הרקע. מיון אירועים קטנים מכדי לייצג תאים שלמים (פסולת) יוצר דוגמאות ריקות רלוונטיות בתהליך המייצגות עוצמות אות רקע תלויות מטריצה. בנוסף, תקנים פנימיים מאפשרים זיהוי דגימות בעייתיות שיש להחריגן מניתוח נתונים נוסף²⁶. שני אמצעי אבטחת האיכות פועלים בצורה הטובה ביותר אם קיים מספר גדול מספיק של עותקים משוכפלים. אנו ממליצים להשתמש בלפחות שישה עותקים משוכפלים לכל קבוצה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמצית שמרים 13C	פתרונות איזוטופיים	ISO-1
40 ומיקרו; מסננת תאים	m קורנינג	352340
אצטוניטריל, מאגר ליזה בדרגת LC-MS	VWR	83640.32
ACK	Gibco	104921	לחלופין: Lonza, Cat# BP10-548E
אדנוזין דיפוספט (ADP)	סיגמא אולדריץ'	A2754
אדנוזין מונופוספט (AMP)	סיגמא אולדריץ'	A1752
אדנוזין טריפוספט (ATP)	Sigma Aldrich	A2383
אמוניום קרבונט, HPLC כיתה	פישר סיינטיפיק	A/3686/50
אטלנטיס פרמייר BEH Z-HILIC עמודה (100 x 2.1 מ"מ, 1.7 ומיקרו; m)	Waters	186009982
B220-A647	Invitrogen	103226
B220-PE/Cy7	BioLegend	103222	RRID:AB_313005
CD11b-PE/Cy7	BioLegend	101216	RRID:AB_312799
CD150-BV605	BioLegend	115927	RRID:AB_11204248
CD3-PE	Invitrogen	12-0031-83
CD48-BV421	BioLegend	103428	RRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7	BioLegend	100422	RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7	BioLegend	100722	RRID:AB_312761
cKit-PE	BioLegend	105808	RRID:AB_313217
ערכת תאי CD4 של עכבר שלא נגעו בהם	Invitrogen	11415D
FACSAria III	BD
Gr1-PE/Cy7	BioLegend	108416	RRID:AB_313381
רדיד איטום חום		Neolab Jul-18
איזולאוצין	סיגמא אולדריץ'	58880
JetStream ESI מקור	Agilent	G1958B
לאוצין	סיגמא אולדריץ'	L8000
חומצה מדרונית,	סיגמא אולדריץ'	M9508-1G
, מתנול, קארל רוט בדרגת LC-MS	HN41.2
NaCl	Fluka	31434-1KG
PBS	Sigma Aldrich	D8537
Sca1-APC/Cy7	BioLegend	108126	RRID:AB_10645327
TER119-PE/Cy7	BioLegend	116221	RRID:AB_2137789
Triple Quadrupole מסה ספקטרומטר	Agilent	6495B
Twin.tec PCR צלחת 96 באר LoBind חצאית	Eppendorf	30129512
UHPLC Autosampler	Agilent	G7157B
UHPLC עמוד תרמוסטט	Agilent	G7116B
UHPLC משאבת	Agilent	G7120A
תרמוסטט לדוגמא UHPLC	Agilent	G4761A